Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Yazarlar Helen Crawford bu el yazması, grafik tasarım için Jim Woolace ve Veronica Nelson ve Devikha protokol gelişiminde katıldığınız için Chandrasekaran hazırlamak için teşekkür ederiz. Bu iletişim kuralı gelişimi NIH Ulusal alerji Enstitüsü ve bulaşıcı hastalıklar (R01 AI135953 ve AI138329 H.P.K. için) ve ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 ve U19 gelen hibe tarafından desteklenmiştir HL129902 H.P.K. için), NIH P51 OD010425 yanı sıra ve kısmen NIH/ncı Kanser Merkezi destek hibe P30 CA015704 aracılığıyla. H.P.K. olduğunu Markey moleküler tıp araştırmacı ve alınan destek Jose Carreras/e Donnall Thomas donatılmış sandalye açılış alıcı olarak kanser araştırmaları ve Fred Hutch donatılmış sandalye için hücre ve gen tedavisi için.

Priming otolog NHP nakli, (hareketlilik), hücre ve Gen değiştirme koleksiyonu ile daha önce yayımlanmış protokolleri26tutarlı yapılmaktadır. Tüm deneysel yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi ve Washington Üniversitesi tarafından onaylanmış (#3235 - 01) Protokol. Tüm çalışmalar Kılavuzu'nda bulunan öneriler için bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri ("The G...

LV vektör Mühendisliği gen-hücre tipleri CD34 gibi değiştirmek için en iyi karakterize yöntemdir+ HSPCs, sonraki nakli içinde vivo için. Burada açıklanan protokol vivo uzun vadeli kalıcı gen-modified HSPCs sayısını en üst düzeye çıkarmak ve klinik faydaları hastalara çeşitli malign, bulaşıcı ve genetik hastalıklar ile sağlamak için tasarlanmıştır. Gen-düzenleme stratejileri son on yılda ortaya çıkmıştır, LV-modified hücreleri en iyi olmakla birlikte, tüp bebek, hayvan ...

Kök hücre gen terapisi insan patolojiler geniş bir yelpazede çözmek için güçlü bir araçtır. HSPC gen tedavisi hastaların, bu hücreler toplama i) göreli kolaylığı II) ile ilgili hücre yüzey fenotipleri ve ex vivo kültür parametreler kullanılabilir ve alan olarak genişleten bilgi zenginliği nedeniyle özellikle çekici bir yaklaşımdır, Çünkü III) gen değişikliği stratejilerinin ilgi çeşitli hastalıklar için özel olarak tasarlanmış bir artan toolbox ile bilim adamları sunar. Aktif HSPC gen terapisi yaklaşımlardan temel bilim HSPC biyoloji, gen-modified HSPCs preklinik içinde vivo modellerinde engraftment ve ilgili hasta nüfus uygulamaya dahil olmak üzere çoklu açıları araştırıyoruz. Biz ve diğer hücre yüzey fenotip işlevsel olarak farklı HSPC alt kümeleri1,2,3, seferberlik ve HSPC verim ve en aza indirirken engraftment en üst düzeye çıkarmak Klima rejimleri nitelendirmiştir toksisite4,5ve Gen değiştirme ve bir geniş yelpazede malign, genetik ve bulaşıcı hastalıklar6,7,8, özel gen düzenleme stratejileri 9,10. İşlev ve engraftment HSPCs gen-modified, küçük ve büyük-hayvan - modelleri, fareler, köpekler ve NHPs de dahil olmak üzere bir dizi olarak değerlendirilebilir. Özellikle, çünkü birçok reaktifler, örneğin, antikorlar HSPC hücre yüzey proteinleri CD34 ve CD90, gibi belirli insan ve NHP hücreler birbirinin yerine kullanılabilir NHP modelleri avantajlı. Ayrıca, fare aksine, NHPs gibi büyük hayvanlar gen değişikliği ölçeğini daha yakın bir yaklaşım klinik etkinlik için gerekli izin. Son olarak, NHPs HIV-1 enfeksiyonu11 gibi insan patolojiler modellenmesi için altın standart ve aday antikanser ve anti-HIV immunotherapies12,13için gelişmekte olan bir modeli sistemi vardır.
Bu iletişim kuralı için arındırıcı, genetik değiştirerek ve NHP HSPC infüzyon ürünleri hazırlama yöntemleri anahat amacıdır. Bu iletişim kuralının kapsamı dışında biz daha önce bu ürünler otolog NHP konaklarda engraft göstermiştir rağmen tüm hematopoetik soy ortaya çıkmasına ve hastalık modelleri1geniş bir terapötik etkinlik sağlar. Ayrıca engrafting HSPCs clonality ile karakterize ve kinetik, ticareti ve bireysel HSPCs ve onların Döl, aşağıdaki otolog transplantasyon1,14fenotip izlemek için bir platform inşa. Burada sunulan yöntemleri aşağıdaki hedefleri ile geliştirilmiştir: i) son derece saf HSPCs ve uzun vadeli engrafting HSC alt kümeleri, II) sırasında ilkel HSCs ex vivo kültürü korumak için ve verimli bir şekilde her iki toplu HSPCs gen değiştirmek III) için izole etmek için ya da uzun vadeli engrafting HSC alt kümeleri. Biz yanı sıra floresans aktif hücre (phenotypically/işlevsel ayrı HSPC nüfus, birçok gruplar2,15, yöntemleri ile tutarlı yalıtmak için FACS), sıralama manyetik destekli cep-sıralama (Mac), istihdam 16. İlkel HSCs kültür bakımından (yani, bu hücreler farklılaşma içine tam olarak çıkmasına taahhüt ataları minimize lenfoid ve myeloid alt kümeleri ayırt) burada açıklanan protokol önemli bir yönüdür. Daha önce HSPCs bir ilkel fenotip17,18, burada, koruyarak genişletmek için yaklaşımlar nitelendirmiştir rağmen bir çok az (48 h) HSCs korumak üzerinde odaklanır ve ex vivo kültür tanımlanan protokol açıklar.
HSPCs ve HSC verimli değişiklik alt kümeleri bu iletişim merkezi bir hedeftir. Biz bildirdin çeşitli yaklaşımlar arasında iki farkla en içinde incelenen klinik denemeler vardır: LV-aracılı gen değişikliği ve nükleaz aracılı gen1,6,19düzenleme. Gen-düzenleme stratejileri bir nükleaz platformlar bir dizi özellikle ilgi hedeflenen bir gen değiştirmek için kullanın, örneğin, C-C kemokin reseptör tip 5 (CCR5) HIV enfeksiyonu7,19 veya Bcl11A tedavisi için tedavi için Hemoglobinopati6/. Burada, hangi transgenik yükleri entegre semirandomly genom1,8,20LV-aracılı gen değişikliği ele. LV yaklaşımları önemli bir avantajı yeteneği (en fazla 8-9 kilobases) genetik malzeme büyük miktarlarda sunmak için var. Gen-düzenleme stratejileri yalnızca belirtilen bir odağı entegre ilgi bir transgene hedeflemek için donör Homolog rekombinasyon (HDR) tarafından geliştirilmekte olan rağmen bu yöntemler geliştirme tüp bebek ve küçük hayvan modellerinde daha fazla gerektirir. Buna ek olarak, LV vektörel çizimler NHPs ve hastaların21,22yaygın olarak kullanılmıştır. Önemlisi, hangi kullanır BM başlangıç HSPC kaynağı olarak kullanıma hazır, burada açıklanan protokol kolayca ve geniş, örneğin, PBSCs yalıtmak için adapte edilebilir. Yukarıda açıklandığı gibi her iki tür için tabidir reaktifler kullanmak için NHPs ve insan arasındaki genetik benzerlik yüksek derecede avantajlarından yararlanın. Son olarak, bu yaklaşım hematopoetik diğer alt kümeleri, yani T hücreleri12,23,24değiştirmek için adapte; etkili T hücreli immünoterapi yaklaşımlar gelişiyle ağır bu protokol için kullanılan aynı LV platformda güvendi. Bu yöntemlerin herhangi bir araştırmacı HSPC biyoloji veya LV-aracılı gen değişikliği ilgilenen uygundur. Örneğin, burada sunulan HSPC arıtma Protokolü HSC zenginleştirilmiş roman alt kümeleri tanımlamak için kullanılan1,15,25daha önce açıklandığı gibi. Aynı şekilde, burada sunulan yöntemleri benzer şekilde olabilir LV iletim uygulanan ve daha çok sayıda diğer hücre tipleri ve deneysel soruları, tüp bebek ve içinde vivo modellerinde her ikisi tarafından geliştirilmiştir.
Özetle, biz yöntemleri yalıtmak ve genetik olarak NHP HSPCs değiştirmek için mevcut. Bu yöntemler diğer türler ve HSPCs ile ilgili diğer kaynakları için kolayca adapte edilebilir. İyice incelenmesi bu iletişim kuralı çok sayıda insan hastalıkları için etkili tedaviler modellenmesi büyük söz gösterir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

Hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) transplantasyonu lösemi için bir temel taşı tedavisi ve diğer kanserler için neredeyse yarım asır oldu, insan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) enfeksiyon tek bilinen tedavisi altında yatan ve büyük söz gösterir beta talasemi gibi genetik hastalıkların tedavisinde. Bizim Grup modeli HSPC gen terapisi insan dışı primatlar (NHPs), bir iletişim kuralına bilim adamları birçok aynı reaktifler ve klinikte uygulanan teknikleri optimize etmek izin geliştirmiştir. Burada, CD34 arıtma yöntemleri tarif+ HSPCs ve uzun vadeli kalıcı hematopoetik kök hücre (HSC) alt kümeleri astarlanmalıdır kemik iliği (BM) üzerinden. Aynı teknikleri diğer HSPC kaynakları (örneğin, seferber periferik kan kök hücreleri [PBSCs]) arıtma için istihdam edilebilir. Özetlenen hangi hücrelerin saf, kültürlü, lentivirus (LV) ile modifiye ve otolog ana geri içine infüzyon için hazırlanan bir 2 gün iletişim kuralıdır. Başarının anahtar veriler dahil CD34 saflığı+ HSPC nüfus, saf HSPCs morfolojik farklı koloniler halinde semisolid medya ve en önemlisi, gen değişiklik verimliliği formu yeteneği. Anahtar HSPC gen tedavisi için tüm hematopoietik hücre tipleri için ortaya çıkmasına uzun ömürlü hücre bir kaynak sağlama yeteneği avantajdır. Bu nedenle, bu yöntemler modeli tedavilere kanser, genetik hastalıklar ve bulaşıcı hastalıklar için kullanılmıştır. Her durumda, kırmızı kan hücreleri, T hücreleri, B hücreleri ve/veya miyeloid alt kümeleri dahil olmak üzere farklı HSPC Döl fonksiyonu güçlendirerek terapötik etkinlik kurulur. İzole etmek için yöntemleri değiştirmek ve HSPC hazırlamak ürünleri doğrudan uygulanabilir ve çevrilebilir insan hasta birden çok hastalık.

Yukarıda açıklanan protokol yalıtmak ve gen NHP CD34 değiştirmek için tasarlanmış+ HSPCs, daha sonra geri otolog ev sahibi (resim 1 ve Şekil 2) infüzyon. Bu protokol sonrası, biz genellikle ilâ 8 x 109 dan helezon makak astarlanmalıdır BM ile toplam WBCs alın ve, bazen, bu tutardan rhesus makak çift. Her iki tür, CD34 sayısı+ biz zenginleştirmek HSPCs toplam WBC sayısı (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Bu iletişim kuralının amacı insan dışı primat CD34 izole etmektir+ hücreleri astarlanmalıdır kemik iliği, gen-lentiviral vektörler ile bu hücreleri değiştirme ve otolog ana bilgisayar içine infüzyon için bir ürün hazırlamak için gelen. Toplam iletişim kuralı yaklaşık 48 saat uzunluğudur.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Umut verici ve yeni gen terapisi yaklaşımlarının etkinliğini ve güvenliğini değerlendirmek için, gen modifiye edilmiş hücrelerin invivo modellerinde kapsamlı bir şekilde test edilmesi çok önemlidir. İlgili hücre yüzeyi belirteçlerinin reaktiflerin çapraz reaktivitesinin korunması ve klinik parametreleri yakından taklit etmek için insan dışı primat modelleri boyunca hastalara uygulanan aynı destekleyici tedavileri uygulayabilme yeteneği. Prosedürü benimle birlikte gösteren Şey ani Perez, Dr.Hans-Peter Kiem'in laboratuvarından araştırma teknisyeni.50 mililitre konik tüpler içine sağlıklı bir insan dışı primat donör izole kemik iliği 10 ila 12 mililitre aliquots ekleyerek başlayın. Tüpün hacmini hemolitik tamponla 50 mililitreye kadar getirin ve hücreleri oda sıcaklığında yedi dakikaya kadar kuluçkaya yatırın. Santrifüj ile hücre enkaz çıkarın ve supernatant son iki ila beş mililitre hariç tüm aspire.Tüpü hareket ettirerek artık süpernatant hacmindeki peleti yeniden askıya alın ve kemik iliği süspansiyonlarını 70 mikrometrelik gözenek hücresi süzgeci kullanarak yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Hacmi 50 mililitreye çıkarmak için taze hemolitik tampon ekleyin ve santrifüj ile toplanmadan önce hücreleri oda sıcaklığında beş dakika daha kuluçkaya yatırın. Tüm supernatant aspire ve maksimum tampon 10 mililitre hücreleri resuspend.Başka bir 70 mikrometre gözenek süzgeci ile hücre süspansiyon filtreleme den önce, taze tampon 40 mililitre ile tüp durulayın ve hücre süspansiyon ile yıkama havuzu. STANDART manyetik destekli hücre sıralama protokollerine göre CD34 pozitif hücreler için zenginleştirdikten sonra, boncuk izole hücreleri 50 mililitreye kadar taze maksimum tamponda yıkayın ve HSPC ortamındaki peleti yeniden askıya alın. Daha sonra, hücrelerin 10 ila 20 mililitresini havalandırmalı dokuya yerleştirin ve t75 şişelerini bir gecede kültürleri için 37 derece ve %5 karbondioksit inkübatöründe tedavi edin.Kemik iliği hücre örneklerinin zenginleştirme öncesi ve sonrası saflığını değerlendirmek için uygun plots ve nüfus hiyerarşisi tüm olaylar dağılım, CD34 pozitif, hematopoetik kök hücreler, multipotent an-eritoid miyeloid ataları ve lenfo miyeloid ataları için tüm kapıları gösteren bir akış sitometri protokolü oluşturmak. Daha sonra, ileri ve yan dağılım parametreleri için voltajları ayarlamak için lekesiz, ön zenginleştirme, beyaz kan hücresi örneği çalıştırın ve komşu kanallar arasındaki telafiyi ayarlamak için tek lekeli kompansasyon boncukları takip eden tüm floresan kanalları. Cd34 zenginleştirme verimliliğini belgelemek için kalan tüm lekesiz ve lekeli numuneleri ayarlanmış ve telafi edilmiş protokolle çalıştırın.Tüm tazminatlar ayarlandığında, CD34 alt kümelerinin tür saflaştırması için hücre ayırıcısını koloni oluşturan hücre tahlillerine yapılandırır ve lekeli CD34 zenginleştirilmiş örnek tüpünü sitometreye yükleyin. Sonra 2000-3000 olayları kaydedin ve sıra kapılarını sinyal gücüne ve hedef popülasyonlara uyacak şekilde ayarlayın. Kurulum tamamlandığında, akış hızını saniyede 500 ila 1000 hücreye ayarlayan ve dağılımdan 800 ila 1200 hücre yi, CD34 pozitif, hematopoetik kök hücre, çok güçlü an-eritoid miyeloid atası ve lenfo miyeloid atanın kapılarını hücre başına 3,6 mililitre lik ayrı tüpler içeren ayrı tüplere ayırarak elde edin.Toplama tüpleri sıralama girdap sonunda, ve üç steril 3,5 santimetre hücre süspansiyon bir mililitre eklemek, doku dışı kültür 37 santigrat derece onların 10-14 gün kuluçka için hücre nüfusu başına bireysel 15 santimetre petri kapları içinde ayarlanmış petri yemekleri tedavi. Ertesi sabah, her şişenin altındaki yapışık hücreleri steril HBSS ile hafifçe durulamak ve hasat edilen hücreleri santrifüj le toplamak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Mililitre konsantrasyonu başına 1 x 10 ila 6.Ve hücre kültürü kuluçka bir gecede kuluçka için 12 iyi plaka kaplı bir rekombinant fibronectin parçası bir kuyuda sahte kontrol için hücrelerin bir mililitre ekleyin. Sonra rekombinant fibronektin parçası kaplı T75 şişeleri içine kalan hücrelerin 10 mililitre aliquots ekleyin hücre kültürü kuluçka için 30 dakika kuluçka için kapaklar havalandırmalı. Kuluçka sırasında virüs şartlı orta örnekleri ve titre ve mililitre başına hücrelerin enfeksiyöz birimlerinin sayısına göre eklenecek virüs miktarını hesaplamak.Masayı kuvözden alın ve hücreleri 37 derece ve %5 karbondioksite geri döndürmeden önce her şişeye uygun miktarda virüs şartlı orta ekleyin. Ertesi sabah şişedeki hücreleri tek tek 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücreleri yıkama başına 50 mililitreye kadar HBSS'de yıkayın ve artık virüsü ortadan kaldırmak için bu adımı üç kez tekrarlayın.Prostaglandin E2 ile desteklenen HSPC ortamlarında hücreleri iki saat kuluçkaya yatırın. Sonra hücreleri yıkayın ve tüp başına% 2 otolog serum ile desteklenen HBSS 10 mililitre hücreleri yeniden askıya. Daha sonra 16,5 kalibrelik bir iğne ile donatılmış 20 mililitrelik şırınga kullanarak hücre süspansiyonları aspire. Tüpün içini taze HBSS artı %2 otolog serumla yıkayın ve şırınganın içine aspire edin.Hücre çözeltisini otolog bir konakiçine infüzyonuna kadar buza yerleştirmeden önce şırıngayı iğne kapağıyla dikkatlice kaplayın. Transekte hücrelerin gen modifikasyon verimliliğini belirlemek için, plaka 1 x 10 6 ayrılmış sahte veya hSPC ortamının mililitre başına transdüklenen hücreler doku kültürü olmayan tedavi plakaları üzerine. İkinci, beş ve on iki transdüksiyon sonrası günde hücreleri hasat edin ve sayın.İkinci ve beşinci günlerde, taze HSPC ortamındaki hücrelerin %33'ünü mililitre konsantrasyonu başına 1 x 10 ila 6. İkinci, beş ve on iki gün, kantitatif gerçek zamanlı PCR için DNA ekstraksiyon tampon hücrelerinin% 33 dondurma, ve hematopoetik singeny henotypik bileşimi değerlendirmek için standart protokollere göre akış sitometri ile hücrelerin son% 33 analiz. Akış sitometrisi ile transgen ekspresyonunu ölçmek için üç ek yan dağılım vs ekleyin.transgen çizimleri;ve hematopoetik kök hücreler üzerinde ilk arsa kapı, çok güçlü an-eritro miyeloid ataları üzerinde ikinci arsa, ve lenfo miyeloid ataları üzerinde üçüncü arsa, tüm vs transgene. Sonra 2000-3000 olayları kaydedin ve sıra kapılarını sinyal gücüne ve hedef popülasyonlara uyacak şekilde ayarlayın.Bu protokolü kullanarak zenginleştirilmiş insan dışı primat CD34 pozitif HSPC sayısı genellikle giriş toplam beyaz kan hücresi sayısı ile orantılıdır. Daha önceki bulgular, toplam CD34 pozitif HSPC ürüngerçek uzun vadeli ve aşılama hematopoetik kök hücreleri olmayan hücreleri içerdiğini göstermiştir gibi, bu akış sitometri tabanlı ve koloni oluşturan hücre teknikleri güvenilir tanımlamak ve kararlı atajenlerden uzun vadeli hematopoetik kök hücreleri için zenginleştirilmiş alt kümeleri ayırt etmek için kullanılabilir. CD34 pozitif insan kök hücre zenginleştirilmiş hücreler verimli gen lentiviral vektörler kullanılarak değiştirilebilir.Vektörün entegre olmayan bir kopyasını taşıyan hücreler 12 günlük sıvı kültür analizi döneminde seyreltilirler, oysa genomdaki kolik entegre vektörler tüm sinalara aktarılır. Koloni oluşturan hücre tahlillerinde vektörün ifadesi ile doğrulanmış. Bu preklinik yöntem genetiği değiştirilmiş insan dışı primat hematopoetik kök ve gen tedavisi için progenitor hücrelerini izole etmek için kullanılabilir.Bu yöntem diğer türler, hematopoetik kök ve ata hücreleri, gen terapi araçları ve hastalıklar için kolayca adapte edilebilir. Bu iyice incelenmiş protokol çok sayıda insan hastalıkları için etkili tedavilerin modelleme için büyük umut vaat ediyor. İnsan olmayan primat dokuları ile çalışmanın kişisel koruyucu ekipmanlar da dahil olmak üzere gelişmiş güvenlik önlemleri gerektirdiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Translasyon modifikasyon ve varyant için hızlı ve nicel Yöntem peptidler genleri için eşleme etkin

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...