Name: simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00
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作者要感谢 icrec 研究项目 (igtp, badalona) 和电子和生物医学仪器仪表组 (upc, 巴塞罗那) 的成员, 特别是 j. rocel-ferrer 教授。此外, 作者还承认 stem cels 转化医学杂志和 alphamed 出版社允许改编以前发表的数字 (llucia-valldeperas 等).30). 这一原型的开发和议定书的设计得到了欧洲联盟委员会第7个框架方案 (saf 2014-59892)、经济和竞争事务部 (saf----第7个框架方案) 的支持。Marató, nmp3-sl-2009-29239)、fundacióla maratóde tv3 (080330, 201516, 201516) 和 fundación para la Prospectiva y la prospectivión en salud en españa (fipse; 06-00001396-15)。

本研究使用患者样本中的人心脏 atdpc。它们的使用已得到当地道德委员会的批准, 所有患者都给予了知情同意。研究议定书符合《赫尔辛基宣言》概述的原则。
1. 准备工作
<ol><li>高压灭菌器两个推子, 12个用于电刺激的铂金 ptfe 电极, 以及一些纸巾, 在121°c 下20分钟。</li>
	<li>
消毒 12个 pdms 自定义构造 (图 1a)。
	<ol>
<li>用5毫升的无菌蒸馏水在...

机电刺激似乎是一个安全的选择, 准备细胞的敌对心脏环境, 并提高他们的心脏承诺。在这里, 描述的心脏祖细胞的协议增加了主要心脏标记的表达, 并被报道是有益的, 他们的下一个植入梗死小鼠心肌 30.一般来说, 机电刺激的心脏 atdpc 增加了与早期、结构和钙调节相关的基因表达, 而这在以前的电气或机械刺激中从未单独实现过。事实上, 机电刺激的心脏 atdpc 显示出一个更完整的...

心功能是基于电激励和机械收缩的耦合。简单地说, 心肌细胞间的连接允许电信号的传播产生几乎同步收缩的心脏, 泵血系统和通过肺系统。因此, 心脏细胞经历了调节基因表达和细胞功能的电和机械力。因此, 许多团体试图开发模仿心脏生理环境的培养平台, 以了解机械和电刺激对心脏发育、功能和成熟的作用。体外电和机械刺激在心脏组织工程中得到了广泛的应用, 以增强功能特性, 提高细胞成熟, 或改善细胞细胞耦合和钙处理1,2,3 个,4 个,5,6,7.,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. 然而, 由于开发刺激器和协议的挑战, 以及由于强制性优化 22, 同步机电调节仍未得到开发22。
初步工作将机电刺激作为电刺激和介质灌注的结合;然而, 流动不涉及应变为基础的变形典型的心室充盈 23,24,25。后来, 更多的生理方法结合电刺激与物理变形或拉伸, 以模仿等体积收缩 26,27,28,29,30 ,31。feng 等人介绍了2005年首次演示机电刺激, 报告心肌细胞大小和收缩特性增强26。wang 等人接受了 5-azacytidine 预处理的间充质干细胞, 并同时进行了电气和机械调理, 改善了再细胞化、细胞活力、心脏分化和组织重塑27。自这些出版物以来, 更多的团体报告了细胞单层或工程组织的机电刺激情况 (例如, black28、vunjak-novakovic29、31和我们的第30组)。第一个被适应的细胞在体内测试 30。简单地说, 摩根和布莱克测试了几种电气和机械刺激的组合, 报告说, 刺激之间的时间是至关重要的, 因为延迟联合机电刺激产生了最好的结果28。接下来, godier-fufurnémont 和合作者从新生大鼠心脏细胞中优化了工程心脏肌肉结构的机电刺激协议, 并首次实现了正力频率关系29。随后, 我们的研究小组报告说, 机电预处理细胞在体外增加了主要心脏标记物的表达, 并在体内产生了广泛的有益作用, 如心脏功能的改善或梗死血管密度的增加边境地区30。最近的出版物表明, 干细胞衍生心肌细胞的心脏组织在机电条件下达到了接近成人成人心脏结构和功能31的成熟水平.此外, 替代的三维刺激平台包括电活性支架, 为所附单元提供电气、机械和地形提示 32.此外, 机械变形 (细胞单层拉伸和压缩) 也可以通过模仿正常生理条件以及极端条件33的可拉伸电极引起。
因此, 其基本原理是, 基于生理条件的体外机电刺激可以增强细胞的心肌潜能。事实上, 这种刺激可以有利于进一步整合治疗细胞到心肌在临床情况下, 或增加组织成熟的药物筛选应用。
此外, 我们分离并鉴定了人类脂肪组织源性心脏祖细胞 (心脏 atdpc)34。这些细胞位于心外膜脂肪中。这些细胞在心肌梗死治疗中表现出有益的组织病理学和功能作用, 同时也保持心脏和内皮分化的潜力。30,35. 我们假设, 在生物物理刺激之后, 这些好处会增加。
因此, 我们为感兴趣的细胞群开发了一种装置和刺激机制, 并对其影响进行了调查。与以前的出版物36相比, 这种机电协议是以无菌和非侵入性的方式诱导主动细胞拉伸的新策略。这里报道的技术详细说明了用于细胞的电气、机械和机电刺激的装置和方法。
该装置可以独立或同时提供电和机械刺激。刺激是用一种非侵入性和无菌的新方法进行的, 该方法包括预灭菌的细胞支架、放置在标准培养板内的电极以及诱导机械和电力的平台 (图 1)。
该平台最多可容纳六个培养板, 由激光切割聚 (甲基丙烯酸甲酯) 和印刷电路板件组成。该平台原型依靠的组合单相可编程计算机控制的电刺激器, 印刷电路板的强大连接的电极, 和 6 10 毫米 x 10 毫米镍镀镍固定的磁铁放置附近的一面的培养板。也有一个铝棒与六个驱动磁铁 (同一模型) 放置在前面的另一侧的培养板, 并移动与线性伺服马达。电机由电机控制器驱动, 通过 rs-232 端口由商业软件操作 (见材料表)。通过用户界面和可编程刺激器, 可以对电强度、脉冲持续时间和频率、机械刺激频率、占空比、脉冲数、脉冲振幅 (磁体偏移) 进行编程,和斜坡。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> 图 1: 机电刺激器.(a) 用于细胞调理的 pdms 构造。(b) 绘制 pdms 结构, 包括电极和磁铁。(c) 用于执行机电调理的印刷电路板 (平台) 的详细情况。该面板已从 llucia-valdeperas 等人30 人处进行了改装。(d) 机电刺激平台和用户界面 (计算机) 的图片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
在两项国际专利中都充分介绍了刺激装置和机电调理方法, 即 wo-2013185818-a137和 wo-201725159-a138。
生物兼容型有机硅结构旨在为电池、电极和磁体提供结构支持, 此前已有 10、21 种。简单地说, 它们由聚二甲基硅氧烷 (pdms) 组成, 在室温下成型和固化, 杨氏模量为 1.3 mpa, 接近生理水平。该结构包含一个灵活区域 (10 毫米 x 10 毫米 x 2 毫米) 中的细胞培养池、两个固定电极的内部横向插槽和两个嵌入的6毫米 x2 毫米 x4 mm 镀镍的磁铁。电极是由0.2 毫米铂线扭曲周围的2毫米 x 3 毫米 x 12 毫米聚四氟乙烯 (ptfe) 核心酒吧 (21 厘米每个电极, 约23转), 并放置在对面的灵活区域, 以创建一个电场诱导电刺激。机械拉伸是通过在支撑中嵌入的磁体和放置在培养板旁边的外部磁体之间以及在移动的铝臂上的磁吸引来实现的。这样, 细胞支持可以在不打破无菌屏障的情况下扩展。这种方法适用于细胞单层, 但也可以适应三维结构。
此外, 使用规则衍射光栅 (1, 250 声), 可以在细胞播种的地方印上规则图案。由于其透明度和 0.5 mm 的厚度, 在明亮场和荧光显微镜下的 pdms 结构下培养的细胞是可能的直接可视化。在目前的情况下, pdms 培养池具有垂直的表面图案, 垂直于拉伸力, 以将细胞垂直地与电场对齐, 从而最大限度地减少整个细胞的电场梯度。
图 1显示了用于刺激的构造和设备的详细说明。pdms 结构和特性针对细胞拉伸进行了优化 (图 1a. b)。该刺激器的开发和验证是为了有效地应用所需的电和机械刺激的细胞连接到 pdms 结构。此过程包括通过软件界面确保良好的连接性和用户可操作性 (图 1C,D)。
协议部分介绍了使用此定制设备进行细胞刺激的过程。

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-10-10-05-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel-plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-06-04-02-HN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td >Dow Corning Corp</td>
			<td >184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)</td>
			<td >Newport</td>
			<td >05RG150-1250-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motor controller</td>
			<td >Faulhaber</td>
			<td>MCLM-3006-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Labview</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >70013-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>45353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 200 mM, 100x</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>M4526-24x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein &amp; RNA analyses</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AllPrep RNA/Protein Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>50980404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rneasy mini kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td >172-5140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random hexamers</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >79236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan PreAmp MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4391128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan Universal PCR MasterMix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immunostaining</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% formalin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >HT-501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >horse serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumina (BSA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PARAFILM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phalloidin Alexa 568</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S8032-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Connexin-43 rabbit primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>C6219 lot#061M4823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sarcomeric &#945;-actinin mouse primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7811 lot#080M4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GATA-4 goat primary antibody</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>AF2606 VAZ0515101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEF2 rabbit primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-313 lot#E0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SERCA2 goat primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8095 lot#D2709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >712-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-225-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-225-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >705-225-147</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential

心血管疾病是发达国家的主要死因。因此, 对有效的心脏细胞疗法的需求促使干细胞和生物工程领域的研究人员在体外开发高保真的人心肌, 用于基础研究和临床应用。然而, 心脏细胞的未成熟表型是获得功能模仿成人心肌的组织的一个限制, 而成年心肌主要以机械和电信号为特征。因此, 该协议的目的是通过机电刺激、重述生理参数来制备和成熟靶细胞群。心脏组织工程正在向更多的生物方法发展, 因此, 基于生物物理刺激的策略正在获得动力。为此目的开发的设备是独特的, 允许单独或同时进行电气和机械刺激, 经过仔细的表征和验证。此外, 尽管该方法已针对这种刺激器和特定的细胞群进行了优化, 但它可以很容易地适应其他设备和细胞系。这里的结果提供了在机电刺激后细胞群心脏承诺增加的证据。运动刺激细胞表现出增加的主要心脏标记表达, 包括早期, 结构, 和钙调节基因。这种细胞调理可用于进一步再生细胞治疗、疾病建模和高通量药物筛选。

图 2表示单元刺激所遵循的一般架构。简单地说, 细胞播种在 pdms 结构上, 并接受机电刺激, 每周进行两次介质改变。非受激细胞被用作机电调理的控制。此外, 我们在实验中添加了额外的控制, 并使用皮下 atdpc 作为心脏 atdpc 的对照。皮下 atdpc 是通过皮下脂肪组织获得的, 经过与心脏 atdpc33相同的隔离和培养过程。连接到 pdms 结构的细...

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Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

在这里, 我们提出了一个协议, 训练细胞群使用电子和机械刺激模拟心脏生理。这种机电刺激增强了治疗细胞的心肌潜能, 是进一步进行细胞治疗、疾病建模和药物筛选的有希望的策略。

同时进行机电刺激增强细胞心肌成功能的潜能

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

这是一种在细胞上应用机电刺激的方法。它有多种应用来研究它对细胞种群的影响，对体内分娩的预训练，以及细胞成熟。其优点是，电气和机械刺激可以单独或同时与同一设备一起应用，同时保持无菌病毒完好无损。这种技术是我们治疗的间接方法。细胞疗法被认为是机电刺激细胞可能是一个有趣的细胞群体，以治疗内向心肌。该方法一般属于心血管领域，但也可以应用于神经系统。这是一个简单的技术，需要耐心。最困难的部分是与小块工作，并保持无菌贯穿始终。操作的细节很少，很难解释，所以视觉演示真的很有帮助。首先将 12 个清洁的 PDMS 结构转移到无菌的 10 厘米板。为保证完全灭菌，请将板暴露在紫外线下五分钟。然后将每个构造转移到一个单独的 35 毫米细胞培养板，或 6 孔板，用于立即细胞播种。要开始细胞播种，首先用5毫升1xPBS清洗心脏 ATPC 的汇合 T75 瓶。要分离细胞，请添加一毫升0.05%的三辛-EDTA。并在37摄氏度下孵育5分钟。然后，添加五毫升的完整介质，以灭活 trypsin-EDTA。在15毫升管中收集所有分离的细胞。用五毫升PBS清洗细胞玻璃两次，收集任何剩余的细胞，并将其加入15毫升的管中。在230克的离心机，在22摄氏度下5分钟。取出上清液，将细胞重新悬浮在两毫升的完整介质中，然后用血细胞计计数。种子200微升的心脏ATC进入每个板与PDMS构造，以获得约80%的种子表面覆盖细胞第二天。在37摄氏度和5%CO2下孵育。轻轻添加 2 毫升预热完整介质每个板。在37摄氏度和5%CO2的构造下孵育细胞。在开始此过程之前，为机电刺激分配 12 个构造中 6 个，为非刺激控制分配 6 个结构。使用70%乙醇清洁刺激装置。将刺激装置、无菌电极和钳子放在流柜内。为了轻松操作电极和构造，从每个细胞培养板中去除 90% 的介质。将 PDMS 结构放在向磁铁的右侧位置，以确保固定磁体和移动磁体之间的磁吸引。前两个步骤是最关键的，在这些步骤中，您操作细胞的种子 PDMS 构造和电极，同时保持整个过程的无菌性。然后，将铂线连接到电极连接器。在 PDMS 结构中，将电极的 PTFE 部分定向到其指定空间中。在每个构造中添加 2.5 毫升新鲜、预热的完整介质。放置所有 PDMS 结构并电气连接到平台后，将平台放回 37 摄氏度和 5%CO2 培养箱。然后连接电气和机械源。要配置刺激程序，请通过控制机械刺激的应用的用户界面指定电气和机械刺激方案。要设置同步性，请打开电气刺激器，然后等待主菜单显示在显示屏上。然后选择选项 2，编辑序列，加上 Enter。要编辑序列菜单，请使用模式选项卡选择当前"通过单击加"，然后按 Enter"表示" 选择1000"带加号/减号，按 Enter"和"对于触发模式"选项卡，通过软件选择外部，按"对于振幅选项卡，选择1"带加号/减号，然后按 Enter"，然后，在主菜单中，选择选项4，然后生成序列，然后按 Enter"在控制应用面板的机械刺激部分，首先在加号期间文本控件中写入1000"。然后在 ON 时间文本控制中写入 500"，以设置机械脉冲持续时间。最后，在游游文本控件中编写2000"以提供10%的构造伸长。每周更换两次单元格介质，首先移除旧介质，然后在 PDMS 支持的两侧添加温暖、新鲜的介质。在第七天，在实验结束时，收集手稿中描述的样本。机电刺激心脏 ATDC 增强心肌生成潜力。实时PCR显示早期和晚期心脏基因表达增加，特别是心脏转录因子GATA-4、结构标记β-霉素重链和钙相关基因康内辛43。对作用素纤维的法罗酮染色表明，大多数细胞根据垂直模式对齐。康内辛43分布主要在细胞质和血浆膜，有助于通过间隙结细胞内通信。MEF2和GATA-4转录因子位于心脏 ATDPC 的核。但是GATA-4在皮下非DPC中未检测到。细胞质标记SERCA2和沙康α-行为素，没有显示一个成熟的沙康科动物组织典型的心肌细胞。在控制和刺激细胞群中未观察到殴打。在该协议的开头，一个健康的细胞单层和在整个过程中保持不育性是至关重要的。样品采集后，可以进行标准基因组蛋白表达技术。这种技术有助于更好地了解细胞电和/或机械刺激的影响。直到最近，不可能使用相同的设备进行两种刺激，这使得结果更难比较。

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