Name: simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af ICREC Research Program (IGTP, Badalona) og biomedicinsk Instrumentation gruppen (UPC, Barcelona), især Prof. J. Rosell-Ferrer og elektronisk. Derudover, anerkender forfatterne STAMCELLER translationel medicin journal og AlphaMed Tryk på for at tillade tilpasning af tidligere offentliggjorte tal (Llucià-Valldeperas, et al. 30). udvikling af denne prototype og design af protokollen blev støttet af Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), Europa-Kommissionens 7. rammeprogram ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502), og Fundación para la Innovación y la Prospectiva da Salud da España (FIPSE; 06-00001396-15).

Denne undersøgelse bruger menneskelige hjerte ATDPCs fra patientprøver. Deres anvendelse er godkendt af den lokale etiske komité, og alle patienter gav informeret samtykke. Undersøgelse-protokollen i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.
1. præparater
<ol><li>Autoklave to pincet, 12 platin PTFE elektroder til elektrisk stimulation og nogle papirhåndklæder, ved 121 ° C i 20 min.</li>
	<li>
Sterilisere 12 PDMS custom-made konstruktioner (<strong class="xfig...

Elektromekaniske stimulation synes at være et sikkert alternativ til at forberede celler for en fjendtlig hjerte miljø og forbedre deres hjerte engagement. Her, rapporteret en protokol, der er beskrevet for kardiale stamceller øget udtryk for vigtigste hjerte markører og blev for at være gavnlig for deres næste implantation infarcted murine myokardiet30. I almindelighed, forøget elektromekaniske stimuleret hjerte ATDPCs udtryk af gener relateret til tidligt, strukturelle og calcium forordni...

Hjertefunktion er baseret på koblingen af elektrisk excitation og mekaniske kontraktion. Kort, cardiomyocyte intercellulære vejkryds tillade elektrisk signal propagation at producere næsten synkron sammentrækninger af hjertet at pumpe blodet systemisk og via lungesystemet. Hjerte celler, gennemgår således både elektriske og mekaniske kræfter, der regulerer gen expression og cellulære funktion. Derfor, mange grupper har forsøgt at udvikle kultur-platforme, der efterligner den kardiale fysiologiske miljø for at forstå rollen, som mekanisk og elektrisk stimulering på hjerte udvikling, funktion og modning. In vitro elektriske og mekaniske stimulering har individuelt anvendt flittigt i hjertets vævsmanipulering at forbedre funktionelle egenskaber, øge celle modning eller forbedre celle-celle kobling og calcium håndtering1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. dog synkron elektromekaniske conditioning er fortsat uudnyttet udfordring for at udvikle en stimulator og protokol, og den obligatoriske optimering22.
Indledende arbejde rettet elektromekaniske stimulation som en kombination af elektrisk stimulation og medier perfusion; strømmen omfatter dog ikke den typiske ventrikulære fyldning23,24,25stamme-baseret deformation. Senere, kombineret flere fysiologiske tilgange elektriske stimuli med fysiske deformation eller strækning til at efterligne isovolumetric sammentrækning26,27,28,29,30 ,31. Feng et al. beskrev den første demonstration af elektromekaniske stimulation i 2005, rapportering af udvidet cardiomyocyte størrelse og kontraktile egenskaber26. Wang et al. forbehandlet mesenkymale stamceller med 5-azacytidine og anvendt samtidige elektriske og mekaniske conditioning, forbedre recellularization, cellernes levedygtighed, cardiac differentiering og væv remodellering27. Siden disse publikationer, flere grupper har rapporteret om elektromekaniske stimulation af celle encellelag eller manipuleret væv (f.eks, sort28, Vunjak-Novakovic29,31, og vores gruppe30) med den første konditioneret celler testet in vivo30. Kort, Morgan og sort testet flere kombinationer af elektriske og mekaniske stimuli, rapportering, timingen mellem stimulering var afgørende, fordi forsinkede kombineret elektromekaniske stimulation givet de bedste resultater28. Næste, Godier-Furnémont og samarbejdspartnere optimeret en elektromekanisk stimulation protokol for manipuleret hjerte muskel konstruktioner fra neonatal rotte hjertet celler og opnåede for første gang, en positiv kraft-frekvens forholdet29. Bagefter, rapporterede vores gruppe at elektromekaniske forprogrammerede celler forøget udtryk af vigtigste hjerte markører i vitro og bredt gavnlige effekter in vivo, såsom forbedret hjertefunktion eller øget fartøj tæthed i infarkt grænse område30. Den seneste publikation demonstreret at hjerte væv fra stilk-celle-afledte cardiomyocytes udsat for elektromekaniske conditioning nået en modning niveau tættere på menneskelige voksen hjertets struktur og funktion31. Derudover alternative tredimensionale stimulation platforme omfatter electroactive stilladser, der giver elektriske, mekaniske, og topografiske stikord til cellerne knyttet32. Desuden kan mekanisk deformation (celle éncellelag stretching og komprimering) også være fremkaldt med elastisk elektroder efterligne normale fysiologiske tilstande, samt ekstreme forhold33.
Rationalet er derfor, at in vitro-elektromekanisk stimuli baseret på fysiologiske forhold kunne øge cardiomyogenic potentiale i en celle. Ja, denne stimulation kunne gavne yderligere integrationer af terapeutiske celler i myokardiet i en klinisk scenario eller øge væv modning for narkotika-screening applikationer.
Derudover vi isoleret og karakteriseret en befolkning på menneskers fedtvæv-afledte stamceller af hjertestop oprindelse (hjertets ATDPCs)34. Disse celler er placeret i den epikardielle fedt. Disse celler vise gavnlige histopatologiske og funktionelle virkninger i behandlingen af myokardieinfarkt og også opretholde hjerte og endotel differentiering potentielle. 30 , 35. vi den hypotese, at disse fordele vil stige efter biofysiske stimulation.
Derfor, vi udviklet en enhed og en stimulation ordning for befolkningens celle af interesse og undersøgte virkningerne. Denne elektromekaniske protokol er en ny strategi for at fremkalde aktiv celle strækker sig i en steril måde og i forhold noninvasively til tidligere publikationer36, i kombination med elektrisk stimulation. Teknikken rapporteret her forklarer i detaljer enheden og metode, der anvendes til elektriske, mekaniske og elektromekaniske stimulering af celler.
Denne enhed kan give både elektrisk og mekanisk stimulation, uafhængigt eller samtidigt. Stimulering er udført med en noninvasive og aseptisk roman tilgang, der omfatter presterilized celle støtte, elektroder placeret inde i en standard kultur plade, og en platform, der inducerer de mekaniske og elektriske kræfter (figur 1).
Platformen kan rumme op til seks kultur plader og består af en sandwich struktur af laser-cut poly(methyl methacrylate) og printplade stykker. Platform prototype bygger på en kombination af en monofasiske programmerbare computer-kontrollerede elektriske stimulator, en printplade til robust tilslutning af elektroder og seks 10 mm x 10 mm x 5 mm forniklet neodym-faste magneter placeret i nærheden af én side af kultur plader. Der er også en aluminium bar med seks drivende magneter (samme model) placeret foran anden siden af kultur plader og flyttede med en lineær servomotor. Motoren drives af en motor controller, drives via en RS-232 port af kommerciel software (Se Tabel af materialer). Gennem brugergrænseflade og programmerbare stimulator er det muligt at programmere den elektriske intensitet, pulse varighed og hyppighed, hyppigheden af mekaniske stimulation, dets normeret maksimalydelse, antallet af impulser, pulse amplitude (magnet udflugt), og hældningen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> Figur 1 : Elektromekaniske stimulator. (A) PDMS konstruere bruges til celle conditioning. (B) tegning af PDMS konstruktion, herunder elektroder og magneter. (C) detaljer af den trykte kredsløb (platform) bruges til at udføre de elektromekaniske conditioning. Dette panel er blevet ændret fra Llucià-Valldeperas et al.30. (D) billede af elektromekaniske stimulation platform og brugergrænsefladen (computer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Både stimulatoren og metoden for elektromekaniske conditioning er fuldt ud beskrevet i to internationale patenter, WO-2013185818-A137 og WO-2017125159-A138.
Biokompatibelt silikone konstruktioner designet til at yde strukturel støtte til celler, elektroder og magneter har været beskrevet tidligere10,21. Kort, de består af Polydimethylsiloxan (PDMS), støbte og helbredt ved stuetemperatur, med en ung modulus af 1,3 MPa, tæt på fysiologiske niveauer. Konstruktionen indeholder en celle kultur pool i en fleksibel område (10 mm x 10 mm x 2 mm), to indre tværgående slots til at holde elektroderne, og to indlejret 6 mm x 2 mm x 4 mm forniklet neodymmagneter. Elektroderne er bygget med 0,2 mm platinum wire snoet omkring en 2 mm x 3 mm x 12 mm polytetrafluorethylen (PTFE) core bar (21 cm pr. elektrode, ca 23 omgange) og placeret på modsatte sider af den fleksible område til at oprette et elektrisk felt for at fremkalde elektrisk stimulation. Mekanisk stretching er opnået gennem magnetisk tiltrækning mellem magneter indlejret i støtte og eksterne magneter placeret ved siden af kultur-pladen og på den bevægelige aluminium arm. På denne måde, kan den celle støtte forlænges uden at bryde den sterile barriere. Denne fremgangsmåde er egnet til en celle éncellelag men kunne tilpasses til tre-dimensionelle konstruktioner, så godt.
Derudover kunne et regelmæssigt mønster være påtrykt, hvor cellerne udsås, ved hjælp af en styret diffraktion rist (1,250 riller/mm). Den direkte visualisering af celler dyrkes på PDMS konstruere under brightfield og fluorescerende mikroskoper er muligt på grund af dens gennemsigtighed og 0,5 mm tykkelse. I den aktuelle sag har PDMS kultur swimmingpool en lodret overflade mønster, vinkelret på den stretching kraft, justere celler vinkelret til det elektriske felt, hvilket minimerer det elektriske felt forløb på tværs af cellen.
Figur 1 viser en detaljeret beskrivelse af konstruktion og enhed, der bruges til at stimulere. PDMS konstruere og karakteristika er optimeret til celle strækker sig (figur 1A, B). Stimulatoren er udviklet og valideret for en effektiv anvendelse af de ønskede elektriske og mekaniske stimulation til celler knyttet til PDMS konstruktion. Denne proces omfatter at sikre gode tilslutningsmuligheder og bruger operabilitet via software interface (figur 1 c, D).
Proceduren for celle stimulation ved hjælp af denne skræddersyede enhed er beskrevet i afsnittet protokol.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-10-10-05-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel-plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-06-04-02-HN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td >Dow Corning Corp</td>
			<td >184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)</td>
			<td >Newport</td>
			<td >05RG150-1250-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motor controller</td>
			<td >Faulhaber</td>
			<td>MCLM-3006-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Labview</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >70013-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>45353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 200 mM, 100x</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>M4526-24x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein &amp; RNA analyses</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AllPrep RNA/Protein Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>50980404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rneasy mini kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td >172-5140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random hexamers</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >79236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan PreAmp MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4391128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan Universal PCR MasterMix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immunostaining</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% formalin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >HT-501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >horse serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumina (BSA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PARAFILM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phalloidin Alexa 568</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S8032-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Connexin-43 rabbit primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>C6219 lot#061M4823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sarcomeric &#945;-actinin mouse primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7811 lot#080M4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GATA-4 goat primary antibody</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>AF2606 VAZ0515101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEF2 rabbit primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-313 lot#E0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SERCA2 goat primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8095 lot#D2709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >712-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-225-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-225-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >705-225-147</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential

Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste årsag til dødsfald i de udviklede lande. Derfor har efterspørgslen efter effektive hjerte celle terapier motiveret forskere i stamceller og bioteknologi felter at udvikle in vitro- high-fidelity menneskelige myokardiet for både grundforskning og klinisk anvendelse. Umodne Fænotypen af cardiac celler er dog en begrænsning på opnåelse af væv, der funktionelt efterligner den voksne myokardiet, som er hovedsagelig karakteriseret ved mekaniske og elektriske signaler. Formålet med denne protokol er således, at forberede og modne celle målgruppen gennem elektromekaniske stimulation, recapitulating fysiologiske parametre. Hjerte vævsmanipulering er udvikling mod flere biologiske metoder og strategier baseret på biofysiske stimuli, således vinder momentum. Enheden er udviklet til dette formål er enestående og giver mulighed for individuelle eller samtidige elektriske og mekaniske stimulation, nøje karakteriseret og valideret. Desuden, selv om metoden, der er blevet optimeret for denne stimulator og en bestemt celle population, kan det nemt tilpasses til andre enheder og cellelinjer. Resultaterne her tilbyde bevis på den øgede hjerte engagement af cellen befolkningen efter elektromekaniske stimulation. Elektromekaniske stimuleret celler Vis øget udtryk for vigtigste hjerte markører, herunder tidlige, strukturelle og calcium-regulerende gener. Denne celle konditionering kan være nyttigt for yderligere regenerativ celleterapi, sygdom modellering og høj overførselshastighed stof screening.

Figur 2 repræsenterer generelle skemaet følges for celle stimulation. Kort, celler var seedet på PDMS konstruktion og udsat for elektromekaniske stimulation, med medier ændringer udført to gange om ugen. Nonstimulated celler blev brugt som kontrol for elektromekaniske konditionering. Derudover har vi tilføjet et ekstra kontrolelement til eksperimentet, og subkutane ATDPCs blev brugt som kontrol for hjerte ATDPCs. Subkutane ATDPCs er fremstillet af subku...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential at JoVE.com

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Her præsenterer vi en protokol for at uddanne en celle population ved hjælp af elektriske og mekaniske stimuli efterligne hjerte fysiologi. Denne elektromekaniske stimulation forbedrer cardiomyogenic potentialet i de behandlede celler og er en lovende strategi for yderligere celleterapi, sygdom modellering og stof screening.

Samtidige elektriske og mekaniske Stimulation til at øge cellernes Cardiomyogenic potentiale

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Dette er en metode til at anvende elektromekanisk stimulation på celler. Det har flere ansøgninger til at studere dens virkninger på en celle befolkning, pre-uddannelse for in vivo levering, og celle modning. Fordelen er, at elektriske og mekaniske stimuli kan anvendes med den samme enhed individuelt eller samtidigt med at steril viral intakt.Denne teknik er en indirekte tilgang til vores terapi. Celleterapi betragtes elektromekanisk stimulerede celler kan være en interessant cellepopulation til behandling af intro-myokardi. Denne metode generelt hører til det kardiovaskulære område, men det kunne også anvendes til nervesystemet.Dette er en nem teknik, der kræver tålmodighed. Den sværeste del vil være at arbejde med de små stykker, og holde sterilitet hele vejen igennem. Der er små detaljer om manipulation, som er vanskelige at forklare, så den visuelle demonstration er virkelig hjælpsom.Begynd med at overføre 12 rensede PDMS konstruktioner til sterile 10 centimeter plader. For at sikre fuldstændig sterilisering udsættes pladerne for UV-lys i fem minutter. Overfør derefter hver konstruktion til en separat 35 millimeter cellekulturplade eller 6-brøndplader til øjeblikkelig cellesåning.For at starte cellesåning vaskes der først en sammenløbet T75-kolbe af hjerte-ATDPC'er med fem milliliter 1x PBS. For at løsne cellerne, tilsættes en milliliter på 0,05% trypsin-EDTA. Og inkubere ved 37 grader Celsius i fem minutter.Derefter tilsættes fem milliliter komplet medium for at inaktivere trypsin-EDTA. Alle fritliggende celler opsamls i et 15 milliliterrør. Celleglasset vaskes to gange med fem milliliter PBS for at indsamle eventuelle resterende celler, og tilsæt dem til 15 milliliterrøret.Centrifuge ved 230 g i fem minutter ved 22 grader Celsius. Fjern supernatant, og re-suspendere cellerne i to milliliter komplet medium, og tælle dem med hæmocytometeret. Seed 200 mikroliter af hjerte-ATDPC'er i hver plade med PDMS konstruktioner for at opnå omkring 80% af såning overflade dækket af celler den følgende dag.Inkubere ved 37 grader Celsius, og 5% CO2. Tilsæt forsigtigt 2 milliliter forvarmt komplet medium pr. plade. Inkuber cellerne med konstruktionerne ved 37 grader Celsius og 5% CO2 natten over.Før du starter denne procedure, tildele seks ud af 12 konstruktioner til elektromekanisk stimulation, og holde seks for ikke-stimuleret kontrol. Brug 70% ethanol til at rengøre stimuleringsenheden. Anstænker stimuleringsenheden, sterile elektroder og pincet inde i strømningsskabet.For nemt at manipulere elektroderne og konstruktionerne fjernes 90 % af mediet fra hver cellekulturplade. Placer PDMS konstruktionerne i den rigtige position mod magneten for at sikre magnetisk tiltrækning mellem både faste og mobile magneter. Disse to tidligere trin, hvor du manipulere cellens seedede PDMS konstruktioner og elektroder og samtidig holde sterilitet i hele processen er de mest kritiske.Tilslut derefter platinledningen til elektrodestikkene. Orienter PTFE-delen af elektroderne i deres udpegede rum i PDMS-konstruktionerne. Der tilsættes 2,5 milliliter frisk, forvarmt komplet medium til hver konstruktion.Når alle PDMS konstruktioner er placeret og elektrisk forbundet til platformen, skal du placere platformen tilbage i 37 grader Celsius og 5% CO2-inkubator. Tilslut derefter den elektriske og mekaniske kilde. For at konfigurere stimuleringsprogrammet skal du angive elektriske og mekaniske stimuleringsregimer gennem brugergrænsefladerne i den elektriske stimulator og applikationen, som styrer den mekaniske stimulering.Hvis du vil indstille synkronismen, skal du tænde for den elektriske stimulator og vente på, at hovedmenuen vises på displayet. Vælg derefter indstilling to, rediger sekvens plus Enter. Hvis du vil redigere sekvensmenuen, skal du bruge fanen tilstand til at vælge aktuel"ved at klikke plus" og trykke på Enter"For perioden, Vælg 1000"med plus/minus og tryk på Enter"Og for at udløse tilstand, vælg eksternt efter software, og tryk på Enter"For amplitude-fanen skal du vælge 1"med plus/minus og trykke på Enter"Derefter skal du tilbage i hovedmenuen vælge alternativ 4 og derefter generere sekvens, og tryk på Enter"Skriv"I den mekaniske stimuleringssektion i kontrolpanelet skal du først skrive 1000"i plusperiodetekstkontrolelementet.Skriv derefter 500"i ON-tidstekststyringen for at indstille den mekaniske pulsvarighed. Endelig skrive 2000 "i udflugt tekst kontrol til at levere en 10% konstruere forlængelse. Skift cellemediet to gange om ugen ved først at fjerne de gamle medier og derefter tilføje varme, friske medier på siderne af UNDERSTØTTELSEN AF PDMS.På dag syv, i slutningen af eksperimentet, indsamle prøverne som beskrevet i manuskriptet. Elektromekanisk stimuleret hjerte-ATDPCs forbedret deres kardiomyogenic potentiale. Dette blev indikeret ved real-time PCR viser øget udtryk for tidlige og sene hjertegener specifikt hjerte transskription faktor GATA-4, den strukturelle markør beta-myosin tunge kæde, og calcium relaterede genet Connexin43.Phalloidin farvning mod actin fibre viste, at de fleste celler justeret i henhold til det lodrette mønster. Connexin43 distribution var for det meste i cytoplasmaet, og ved plasmamembranen, hvilket bidrog til intracellulær kommunikation gennem hulkryds. MEF2 og GATA-4 transskription faktorer var placeret ved kernen i hjerte-ATDPCs.Men GATA-4 blev ikke påvist i subkutane ATDPCs. De cytoplasmatiske markører SERCA2, og sarkomerisk alfa-actinin, viste ikke en moden sarcomere organisation typisk for kardiomyocytter. Og slå blev ikke observeret i kontrol og stimuleret cellepopulationer.En sund celle monolag i begyndelsen af denne protokol og holde sterilitet i hele proceduren er afgørende. Efter prøvetagning kan standardgenomproteinudtryksteknikkerne udføres. Denne teknik hjælper til bedre at forstå effekten af celle elektriske og / eller mekaniske stimuli.Indtil for nylig var det umuligt at bruge den samme enhed til både stimulering, hvilket gjorde resultaterne sværere at sammenligne.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Alternating-Current Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Samtidig Syntese af Single-walled carbon nanorør og Graphene i en magnetisk-forstærket Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering skeletmuskel Væv fra murine myoblast progenitorceller og anvendelse af elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Distinctive kapillarvirkning af Micro-kanaler i Bone-lignende Skabeloner kan Øge Rekruttering Celler til Restaurering af Large Bony Defekt

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk kontrol af levende celler Elektrisk aktivitet ved Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Kardial muskelcellebaseret aktuator og selvstabiliserende biorobot - DEL 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Kardial muskelcellebaseret aktuator og selvstabiliserende biorobot - del 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Gel-seq: En metode til samtidige sekventering bibliotek forberedelse af DNA og RNA bruger Hydrogel matricer

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Konstruktion og brug af en elektrisk Stimulation kammer for at øge Osteogenic differentiering i mesenkymale stamceller/stromale celler In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Selvsamling af gammamodet peptid nukleinsyrer i komplekse nanostrukturer i organiske opløsningsmiddelblandinger

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...