Name: simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential at JoVE.com

De auteurs willen de leden van de ICREC Research Program (IGTP, Badalona) en de elektronische instrumentatie groep Biomedische (UPC, Barcelona), met name Prof. J. Rosell-Ferrer bedanken. Bovendien, erkennen de auteurs stamcellen Translational Medicine journal en AlphaMed pers voor het toelaten van de aanpassing van de eerder gepubliceerde cijfers (Llucià-Valldeperas, et al.. 30). de ontwikkeling van dit prototype en het ontwerp van het protocol werden ondersteund door Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), de EuropeseCommissie 7e kaderprogramma ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) en Fundación para la Innovación y la Prospectiva nl Salud nl España (FIPSE; 06-00001396-15).

Deze studie maakt gebruik van menselijke cardiale ATDPCs van monsters van de patiënt. Hun gebruik is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie, en alle patiënten gaf geïnformeerde toestemming. Het studie-protocol voldoet aan de beginselen die zijn uiteengezet in de verklaring van Helsinki.
1. voorbereiding
<ol><li>Autoclaaf twee pincet, 12 platina PTFE-meet-elektroden elektrische stimulatie en sommige papieren handdoeken, bij 121 ° C gedurende 20 minuten.</li>
	<li>
Sterilise...

Elektromechanische stimulatie lijkt te zijn een veilig alternatief voor voorbereiden op een vijandige omgeving van de cardiale cellen en verbetering van hun cardiale inzet. Hier, een protocol beschreven voor cardiale voorlopercellen verhoogd de expressie van belangrijkste cardiale markers en was gemeld dat zij heilzaam zijn voor hun volgende implantatie op infarcted lymfkliertest myocard30. Electromechanically gestimuleerd cardiale ATDPCs verhoogd in het algemeen, de uitdrukking van de genen gerel...

Hartfunctie is gebaseerd op de koppeling van elektrische excitatie en contractie van de mechanische. Kort, cardiomyocyte intercellulaire kruispunten toestaan elektrische signaal doorgeven aan het produceren van bijna synchrone contracties van het hart dat bloed pomp, systemisch en via het pulmonaire systeem. Hartcellen, ondergaan dus zowel elektrische en mechanische krachten die regelen van gen expressie en cellulaire functie. Dienovereenkomstig, vele groepen hebben geprobeerd te ontwikkelen cultuur platformen die de cardiale fysiologische omgeving om te begrijpen van de rol van mechanische en elektrische stimulatie op cardiale ontwikkeling, functie en rijping na te bootsen. In vitro elektrische en mechanische stimulaties individueel toegepaste uitgebreid in cardiale weefselengineering functionele eigenschappen verbeteren, cel rijping vergroten of verbeteren cel koppeling en calcium behandeling1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. synchrone elektromechanische conditionering blijft echter onbenut vanwege de uitdaging van de ontwikkeling van een stimulator en protocol, en de verplichte optimalisatie22.
Voorbereidende werkzaamheden gericht elektromechanische stimulatie als een combinatie van elektrische stimulatie en media perfusie; de stroom gaat echter niet om de stam gebaseerde vervorming typische van ventriculaire vulling23,24,25. Later meer fysiologische benaderingen elektrische prikkels gecombineerd met fysieke vervorming of uitrekken om na te bootsen de isovolumetric contractie26,27,28,29,30 ,31. Feng et al. beschreef de eerste demonstratie van elektromechanische stimulatie in 2005, rapportage cardiomyocyte grootte en contractiele eigenschappen26verbeterd. Wang et al. mesenchymale stamcellen met 5-azacytidine voorbehandeld en gelijktijdige elektrische en mechanische conditionering, verbetering van de recellularization, levensvatbaarheid van de cellen, cardiale differentiatie en weefsel remodeling27toegepast. Sinds die publicaties, meer groepen hebben gemeld op elektromechanische stimulatie van cel monolayers of weefsels (bijvoorbeeld zwart28Vunjak-Novakovic29,31, en onze fractie30) ontworpen met de eerste geconditioneerde cellen getest in vivo30. Kort, Morgan en zwart getest verschillende combinaties van elektrische en mechanische stimuli, melden dat de timing tussen stimulaties was van cruciaal belang omdat vertraagde gecombineerde elektromechanische stimulatie de beste resultaten-28 leverde. Vervolgens Godier-Furnémont en medewerkers geoptimaliseerd een elektromechanische stimulatie-protocol voor de gemanipuleerde hart spier constructies van neonatale rat hart cellen en bereikt, voor de eerste keer, een positieve kracht-frequentie relatie29. Daarna, onze fractie gerapporteerd dat electromechanically geconditioneerde cellen verhoogd de uitdrukking van de belangrijkste cardiale markeringen in vitro en brede gunstige effecten in vivo, zoals verbeterde cardiale functie of toegenomen dichtheid van het vaartuig in het infarct grens regio30. De meest recente publicatie aangetoond dat cardiale weefsels uit stamcellen-cell-derived cardiomyocytes aan elektromechanische conditionering bereikt een rijping niveau dichter bij menselijke volwassen cardiale structuur en functie31 onderworpen. Bovendien, alternatieve driedimensionale stimulatie platformen omvatten electroactive steigers waarmee de elektrische, mechanische en topografische signalen naar de cellen gekoppeld32. Mechanische vervorming (cel enkelgelaagde uitrekken en compressie) kan bovendien ook worden opgewekt met elastische elektroden nabootsen van normale fysiologische omstandigheden, evenals extreme omstandigheden33.
De grondgedachte is derhalve dat in vitro elektromechanische prikkels op basis van fysiologische omstandigheden zou kunnen het potentieel van de cardiomyogenic van een cel vergroten. Inderdaad, deze stimulatie kan profiteren verder integraties van therapeutische cellen in het myocardium in een klinische scenario of weefsel rijping voor drug-screening toepassingen te verhogen.
Bovendien, we geïsoleerd en een bevolking van menselijk vetweefsel afkomstige voorlopercellen van cardiale gekenmerkt oorsprong (cardiale ATDPCs)34. Deze cellen bevinden zich in het epicardial vet. Deze cellen weergeven histopathologisch en functionele voordelen bij de behandeling van een hartinfarct en ook het onderhouden van cardiale en endotheel differentiatie potentiële. 30 , 35. wij veronderstelde dat deze voordelen na biofysische stimulatie verhogen zou.
Dus we ontwikkelde een apparaat en een regeling van de stimulatie voor de bevolking van de cel van belang en onderzocht de effecten. Dit elektromechanische protocol is een nieuwe strategie voor het opwekken van actieve cel die zich uitstrekt in een steriele wijze en noninvasively vergeleken met eerdere publicaties36, in combinatie met elektrische veld stimulatie. De techniek hier gemeld wordt uitgelegd in detail het apparaat en de methode die wordt gebruikt voor de elektrische, mechanische en elektromechanische stimulatie van cellen.
Dit apparaat kan bieden zowel elektrische en mechanische stimulatie, onafhankelijk of gelijktijdig. De stimulatie wordt uitgevoerd met een noninvasive en aseptische nieuwe benadering, die presterilized cel ondersteunt, elektroden geplaatst binnen een standaard cultuur plaat, en een platform dat induceert de mechanische en elektrische krachten (Figuur 1).
Het platform kan houden tot zes cultuur platen en bestaat uit een sandwich constructie van laser-gesneden poly(methyl methacrylate) en printplaat stukken. Het prototype platform is gebaseerd op een combinatie van een monofasische programmeerbare computer gestuurde elektrische stimulator, een Printplaat voor de robuuste aansluiting van de elektroden, en zes 10 mm x 10 x 5 mm vernikkeld neodymium-vaste magneten geplaatst in de buurt van de één-kant van de platen van de cultuur. Er is ook een aluminium bar met zes drijvende magneten (hetzelfde model) voor de andere kant van de cultuur-platen geplaatst en vertrok met een lineaire servomotor. De motor wordt aangedreven door een motorcontroller, beheerd via een RS-232 poort door commerciële software (Zie de Tabel van de materialen). Via de gebruikersinterface en programmeerbare stimulator is het mogelijk om te programmeren van de elektrische intensiteit, de impulstijd en frequentie, de frequentie van mechanische stimulatie, de taakcyclus, het aantal pulsen, de amplitude van de pols (magneet excursie), en de helling.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> Figuur 1 : Elektromechanische stimulator. (A) PDMS-constructie voor de conditionering van de cel gebruikt. (B) een tekening van het PDMS construct, met inbegrip van de elektroden en magneten. (C) Detail van de printplaat (platform) gebruikt voor het uitvoeren van de elektromechanische conditionering. Dit paneel is gewijzigd van Llucià-Valldeperas et al.30. (D) foto van de elektromechanische stimulatie platform en de user interface (computer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Zowel de stimulator en de methode voor elektromechanische conditioning zijn volledig beschreven in twee internationale patenten, WO-2013185818-A137 en38van de WO-2017125159-A1.
De biocompatibel siliconen constructies ontworpen om structurele steun geven aan cellen, elektroden, en magneten zijn geweest beschreven eerder10,21. Kortom, ze bestaan uit Polydimethylsiloxaan (PDMS), gegoten en genezen bij kamertemperatuur, met een Youngs modulus van 1.3 MPa, dicht bij de fysiologische niveaus. De constructie bevat een cel cultuur zwembad in een flexibele ruimte (10 x 10 x 2 mm), twee innerlijke transversale "slots" om te houden van de elektroden, en twee ingesloten 6 x 2 mm x 4 mm vernikkeld neodymium-magneten. De elektroden zijn gebouwd met 0,2 mm platina-draad twisted rond een 2 x 3 mm x 12 mm polytetrafluorethyleen (PTFE) kern bar (21 cm per elektrode, ongeveer 23 bochten) en aan weerszijden van de flexibele ruimte maken van een elektrisch veld voor inducerende geplaatst elektrische stimulatie. Mechanische uitrekken wordt bereikt door magnetische aantrekkingskracht tussen magneten ingebed in de steun en externe magneten geplaatst naast de cultuur-plaat en op de bewegende aluminium arm. Op deze manier, kan de cel ondersteuning worden uitgebreid zonder verbreking van de steriele barrière. Deze aanpak is geschikt voor een cel enkelgelaagde maar kon worden aangepast aan de driedimensionale constructies, ook.
Bovendien zou een regelmatig patroon ingeprinte waar de cellen worden overgeënt, met behulp van een gelinieerde diffractie raspen (1.250 groeven/mm). De directe visualisatie van de cellen gekweekt op het PDMS construct onder helderveld en fluorescente microscopen is mogelijk omwille van de transparantie en de 0.5 mm dikte. In het onderhavige geval heeft het PDMS cultuur zwembad een verticale oppervlaktepatroon, loodrecht op de uitrekkende force, de cellen loodrecht naar het elektrische veld, die het verloop van het elektrisch veld in de cel minimaliseert uitgelijnd.
Figuur 1 toont een detailbeschrijving van de constructie en het apparaat dat wordt gebruikt voor de stimulatie. De PDMS construeren en kenmerken zijn geoptimaliseerd voor mobiele rekken (figuur 1A, B). De stimulator is ontwikkeld en gevalideerd voor de effectieve toepassing van de gewenste elektrische en mechanische stimulatie naar cellen die zijn gekoppeld aan de PDMS construct. Dit proces omvat zorgen voor goede connectiviteit en gebruiker operability via de interface van de software (Figuur 1 c, D).
De procedure voor stimulatie van de cel met behulp van dit hulpmiddel naar maat wordt beschreven in de sectie protocol.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-10-10-05-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel-plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-06-04-02-HN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td >Dow Corning Corp</td>
			<td >184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)</td>
			<td >Newport</td>
			<td >05RG150-1250-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motor controller</td>
			<td >Faulhaber</td>
			<td>MCLM-3006-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Labview</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >70013-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>45353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 200 mM, 100x</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>M4526-24x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein &amp; RNA analyses</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AllPrep RNA/Protein Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>50980404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rneasy mini kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td >172-5140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random hexamers</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >79236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan PreAmp MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4391128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan Universal PCR MasterMix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immunostaining</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% formalin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >HT-501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >horse serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumina (BSA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PARAFILM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phalloidin Alexa 568</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S8032-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Connexin-43 rabbit primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>C6219 lot#061M4823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sarcomeric &#945;-actinin mouse primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7811 lot#080M4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GATA-4 goat primary antibody</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>AF2606 VAZ0515101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEF2 rabbit primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-313 lot#E0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SERCA2 goat primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8095 lot#D2709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >712-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-225-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-225-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >705-225-147</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential

Cardiovasculaire aandoeningen zijn de belangrijkste doodsoorzaak in de ontwikkelde landen. Bijgevolg heeft de vraag naar effectieve cardiale celtherapieën gemotiveerd onderzoekers in de cel van de stam en bioengineering velden te ontwikkelen in vitro HiFi-menselijke myocard voor zowel basisonderzoek en klinische toepassingen. De onrijpe fenotype van hartcellen is echter een beperking op het verkrijgen van weefsels die functioneel na te bootsen de volwassen myocard, dat vooral wordt gekenmerkt door mechanische en elektrische signalen. Het doel van dit protocol is dus, voor te bereiden en oudere van de cel doelgroep door middel van elektromechanische stimulatie, Recapitulerend fysiologische parameters. Cardiale weefselengineering evolueert naar meer biologische benaderingen en strategieën op basis van biofysische stimuli, dus, zijn goed op stoom. Het apparaat ontwikkeld voor dit doel is uniek en kan afzonderlijk of gelijktijdig elektrische en mechanische stimulatie, zorgvuldig gekenmerkt en gevalideerd. Bovendien, hoewel de methode is geoptimaliseerd voor deze stimulator en de bevolking van een specifiek cel, kan het gemakkelijk worden aangepast aan andere apparaten en cellijnen. De resultaten hier bieden bewijs van de toegenomen cardiale verbintenis de celpopulatie na elektromechanische stimulatie. Electromechanically gestimuleerd cellen tonen een verhoogde expressie van belangrijkste cardiale markers, met inbegrip van vroege, structurele en calcium-regulering genen. Deze cel conditionering kan nuttig zijn voor verdere regeneratieve celtherapie, ziekte modelleren, en high-throughput drug screening.

Figuur 2 geeft het algemene schema gevolgd voor de stimulatie van de cel. Cellen werden kort, ontpit op het PDMS construct en onderworpen aan elektromechanische stimulatie, met een verandering van de media uitgevoerd tweemaal per week. Nonstimulated cellen werden gebruikt als een besturingselement voor de elektromechanische conditionering. Bovendien, we een extra besturingselement toegevoegd aan het experiment en onderhuids ATDPCs werden gebruikt als een best...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential at JoVE.com

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Dit is een methode om elektromechanische stimulatie op cellen toe te passen. Het heeft meerdere toepassingen om de effecten ervan op een celpopulatie te bestuderen, voortraining voor in vivo levering en celrijping. Het voordeel is dat elektrische en mechanische stimuli individueel of gelijktijdig met hetzelfde apparaat kunnen worden toegepast terwijl steriele virale intact blijven.Deze techniek is een indirecte benadering van onze therapie. Celtherapie wordt beschouwd als elektromechanisch gestimuleerd cellen kan een interessante cel populatie voor de behandeling van intro-myocardium. Deze methode behoort over het algemeen tot het cardiovasculaire veld, maar het kan ook worden toegepast op het zenuwstelsel.Dit is een eenvoudige techniek die geduld vereist. Het moeilijkste deel zal werken met de kleine stukjes, en houd de steriliteit in. Er zijn weinig details van manipulatie die moeilijk uit te leggen zijn, dus de visuele demonstratie is echt nuttig.Begin met het overbrengen van 12 gereinigde PDMS constructies naar steriele platen van 10 centimeter. Om volledige sterilisatie te verzekeren, stelt u de platen gedurende vijf minuten bloot aan UV-licht. Breng vervolgens elke constructie over naar een aparte 35 millimeter celkweekplaat, of 6-putplaten voor onmiddellijke celzaaien.Om te beginnen met celzaaien, eerst wassen een confluent T75 fles cardiale ATDPCs met vijf milliliter van 1x PBS. Om de cellen los te maken, voeg een milliliter van 0,05% trypsin-EDTA. En vijf minuten lang uitbroeden bij 37 graden Celsius.Voeg vervolgens vijf milliliter volledig medium toe om de trypsine-EDTA te inactiveren. Verzamel alle losstaande cellen in een buis van 15 milliliter. Was het celglas twee keer met vijf milliliter PBS om de resterende cellen te verzamelen en voeg ze toe aan de buis van 15 milliliter.Centrifuge op 230 g gedurende vijf minuten bij 22 graden Celsius. Verwijder de supernatant, en opnieuw opschorten de cellen in twee milliliter van volledige medium, en tel ze met de hemocytometer. Zaad 200 microliters van cardiale ATDCC's in elke plaat met de PDMS constructen om ongeveer 80% van het zaaioppervlak bedekt met cellen de volgende dag te verkrijgen.Incubeer bij 37 graden Celsius, en 5%CO2. Voeg voorzichtig 2 milliliter voorverwarmd compleet medium per plaat toe. Incubeer de cellen met de constructen op 37 graden Celsius, en 5% CO2 's nachts.Voordat u met deze procedure begint, wijst u zes van de twaalf constructies toe voor elektromechanische stimulatie en bewaar er zes voor niet-gestimuleerde controles. Gebruik 70% ethanol om de stimulatie-eenheid schoon te maken. Plaats de stimulatie-eenheid, steriele elektroden en pincet in de stroomkast.Om de elektroden en constructies gemakkelijk te manipuleren, verwijdert u 90% van het medium uit elke celkweekplaat. Plaats de PDMS constructies in de juiste positie in de richting van de magneet om magnetische aantrekkingskracht tussen zowel vaste als mobiele magneten te verzekeren. Deze twee eerdere stappen waarin u de inzaaide PDMS-constructies van de cel manipuleert en de elektroden terwijl de steriliteit gedurende het hele proces behouden blijft, zijn het meest kritisch.Sluit vervolgens de platinadraad aan op de elektrodeconnectoren. Oriënteer het PTFE-deel van de elektroden in hun aangewezen ruimten in de PDMS-constructies. Voeg 2,5 milliliter vers, voorverwarmd compleet medium toe aan elke constructie.Zodra alle PDMS constructies zijn geplaatst en elektrisch verbonden met het platform, plaats het platform terug in de 37 graden Celsius, en 5% CO2 incubator. Sluit vervolgens de elektrische en mechanische bron aan. Om het stimulatieprogramma te configureren, specificeer u elektrische en mechanische stimulatieregimes via de gebruikersinterfaces van de elektrische stimulator en de toepassing, die de mechanische stimulatie regelt.Als u het synchronisme wilt instellen, schakelt u de elektrische stimulator in en wacht u tot het hoofdmenu op het display verschijnt. Selecteer vervolgens optie twee, bewerk reeks, plus Enter. Als u het volgordemenu wilt bewerken, gebruikt u het tabblad Modus om huidige opties te selecteren door op plus te klikken en op Enter te drukken voor de periode. selecteer 1000"met plus/min en druk op Enter"En voor het tabblad triggermodus selecteert u Extern door software en drukt u op Enter"Voor het amplitude-tabblad, selecteer 1"met plus/min en druk op Enter"Vervolgens, terug in het hoofdmenu, selecteer optie 4 en genereer vervolgens volgorde en druk op Enter"In het gedeelte met mechanische stimulatie van het configuratietoepassingspaneel, schrijf eerst 1000"in het tekstbesturingselement plus.Schrijf vervolgens 500"in de ON-tijd tekstregeling, om de mechanische pulsduur in te stellen. Tot slot, schrijf 2000"in de excursie tekst controle om een 10% construct rek te leveren. Verander de celmedia twee keer per week, door eerst de oude media te verwijderen en vervolgens warme, verse media toe te voegen aan de zijkanten van de PDMS-ondersteuning.Op dag zeven, aan het einde van het experiment, verzamelen de monsters zoals beschreven in het manuscript. Elektromechanisch gestimuleerd cardiale ATDCC's versterkten hun cardiomyogene potentieel. Dit werd aangegeven door real-time PCR met verhoogde expressie van vroege en late cardiale genen met name de cardiale transcriptie factor GATA-4, de structurele marker beta-myosine zware keten, en het calcium gerelateerde gen Connexin43.Phalloidine kleuring tegen actin vezels bleek dat de meerderheid van de cellen uitgelijnd volgens het verticale patroon. Connexin43 distributie was meestal in het cytoplasma, en op het plasmamembraan, bij te dragen aan intracellulaire communicatie via gap knooppunten. Mef2- en GATA-4-transcriptiefactoren bevonden zich op de kernen van cardiale ATDCC's.Gata-4 werd echter niet gedetecteerd in onderhuidse APC's. De cytoplasmische markers SERCA2, en sarcomeric alpha-actinine, niet tonen een volwassen sarcomere organisatie typisch voor cardiomyocyten. En het slaan werd niet waargenomen in controle en gestimuleerde celbevolking.Een gezonde celmonolaag aan het begin van dit protocol en het houden van de steriliteit gedurende de hele procedure zijn cruciaal. Na het verzamelen van monsters kunnen de standaard technieken voor genoomeiwitexpressie worden uitgevoerd. Deze techniek helpt om het effect van cele elektrische en/of mechanische stimuli beter te begrijpen.Tot voor kort was het onmogelijk om hetzelfde apparaat te gebruiken voor beide stimulatie, wat de resultaten moeilijker te vergelijken maakte.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Alternating-Current Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Scheiden Kralen en cellen in Multi-channel Microfluïdische apparaten met behulp van Dielectrophoresis en Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Gelijktijdig Synthese van enkelwandige koolstof nanobuisjes en grafeen in een magnetisch-enhanced Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Techniek skeletspier weefsel van muizen myoblast progenitorcellen en toepassing van elektrische stimulatie

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Onderscheidend capillaire actie van Micro-kanalen in Bone-achtige sjablonen kunnen verbeteren Aanwerving van Cellen voor Herstel van de Grote Bony Defect

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Cardiac Spier-Cell Based Actuator en Zelfstabiliserende Biorobot - DEEL 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Cardiac Spier Cell-gebaseerde Actuator en Zelfstabiliserende Biorobot - Deel 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Zelfassemblage van gamma-gemodificeerde peptide nucleïnezuren in complexe nanostructuren in organische oplosmiddelmengsels

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...