Name: simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00
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Die Autoren möchten den Mitgliedern des ICREC Research Program (IGTP, Badalona) und die elektronische und biomedizinische Messtechnik Gruppe (UPC, Barcelona), vor allem Prof. J. Rosell-Ferrer danken. Darüber hinaus bestätigen die Autoren Stammzellen Translational Medicine Journal und AlphaMed Presse erlaubt die Anpassung der zuvor veröffentlichten Zahlen (Llucià-Valldeperas, Et al. 30). die Entwicklung dieses Prototypen und das Design des Protokolls wurden vom Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF-2014-59892), die Europäische Kommission unterstützt 7. Rahmenprogramm () RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) und Fundación Para la Innovación y la Prospectiva de Salud de España (FIPSE; 15 / 00001396 / 06).

Diese Studie wird menschliche Herz ATDPCs von Patientenproben verwendet. Ihre Nutzung durch die lokale Ethikkommission genehmigt wurde, und alle Patienten gab informierte Zustimmung. Das Studienprotokoll passt sich an die Grundsätze, die in der Deklaration von Helsinki.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Autoklav zwei Pinzetten, 12 Platinelektroden PTFE für elektrische Stimulation und einige Papiertücher, bei 121 ° C für 20 Minuten.</li>
	<li>
Sterilisieren Sie 12 PDMS maßgeschneiderte ...

Elektromechanische Stimulation scheint eine sichere Alternative für die Vorbereitung einer feindlichen Umgebung kardialen Zellen und Stärkung ihrer kardialen Engagements sein. Hier berichtet ein Protokoll beschrieben für kardiale Vorläuferzellen erhöht den Ausdruck der wichtigsten kardialen Marker und wurde für ihre nächste Implantation auf murinen Infarzierte Myokard30vorteilhaft. Im Allgemeinen erhöht elektromechanisch stimuliert kardiale ATDPCs die Expression von Genen im Zusammenhang m...

Herz-Funktion basiert auf der Kopplung von elektrischen Erregung und mechanische Schrumpfung. Kurz, Cardiomyocyte interzelluläre Verbindungen ermöglichen elektrische Signalausbreitung fast synchronen Kontraktionen des Herzens, Blut zu Pumpen systemisch und durch Lungensystems produzieren. Herzzellen, unterziehen damit, elektrische und mechanische Kräfte, die Genfunktion Ausdruck und Mobilfunk zu regulieren. Dementsprechend haben viele Gruppen, Kultur-Plattformen entwickeln, die die kardiale physiologische Umgebung um zu verstehen, die Rolle der mechanischen und elektrischen Stimulation auf kardiale Entwicklung, Funktion und Reifung zu imitieren versucht. In-vitro- elektrische und mechanische Reize wurden individuell umfassend angewendet im Herzgewebe Engineering bis zur funktionelle Eigenschaften verbessern, die Zelle Reifung oder Verbesserung der Zell-Zell-Kupplung und Kalzium Umgang mit1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. synchrone elektromechanische Klimaanlage bleibt jedoch ungenutzt, wegen der Herausforderung einen Stimulator und ein Protokoll zu entwickeln, und wegen der obligatorischen Optimierung22.
Vorarbeiten wurden elektromechanische Stimulation als eine Kombination von Elektrostimulation und Medien Perfusion, Allerdings beinhaltet die Strömung die Stamm-basierten Verformung typische ventrikuläre Füllung23,24,25. Später kombiniert weitere physiologische Ansätze elektrische Reize mit physischen Deformation oder Strecken, um die Isovolumetric Kontraktion26,27,28,29,30 imitieren ,31. Feng Et Al. beschrieben die erste Demonstration der elektromechanische Stimulation im Jahr 2005, Berichterstattung, Cardiomyocyte Größe und kontraktile Eigenschaften26verbessert. Wang Et Al. mesenchymalen Stammzellen mit 5-Azacytidine vorbehandelt und gleichzeitige elektrische und mechanische Klimaanlage, Verbesserung der Recellularization, Zellviabilität, kardialen Differenzierung und Gewebe Umbau27angewendet. Seit diese Veröffentlichungen mehr Gruppen berichteten über elektromechanische Stimulation der Zelle Monolagen oder Gewebe (z.B. Schwarz28, Vunjak-Novakovic29,31, und unsere Gruppe30) entwickelt, mit der erste klimatisierte Zellen getestet in-vivo30. Kurz, Morgan und schwarz getestet mehrere Kombinationen von elektrischen und mechanischen Reizen, berichtet, dass das Timing zwischen Stimulationen entscheidend war, weil verzögerte kombinierte elektromechanische Stimulation der besten Ergebnisse28ergab. Als nächstes Godier-Furnémont und Mitarbeiter eine elektromechanische Stimulation Protokoll für technische Herz Muskel Konstrukte von neonatalen Ratte Herzzellen optimiert und erreicht, zum ersten Mal eine positive Kraft-Frequenz Beziehung29. Danach berichtete unserer Gruppe, dass elektromechanisch vorkonditionierten Zellen den Ausdruck der wichtigsten kardialen Marker in Vitro erhöht und breit vorteilhaft in-vivo Effekte, wie z. B. verbesserte Herzfunktion oder erhöht Schiff Dichte in der Infarkt Border Region30. Die jüngste Publikation gezeigt, dass kardiale Gewebe aus Stamm-abgeleitete Herzmuskelzellen elektromechanische Klimaanlage erreicht eine Reifung Ebene näher an menschlichen Erwachsenen kardialen Struktur und Funktion31unterzogen. Darüber hinaus alternative dreidimensionale Stimulierung Plattformen umfassen elektroaktive Gerüste, die bieten elektrische, mechanische und topographische Hinweise, um die Zellen32befestigt. Darüber hinaus kann auch mechanische Verformung (Zelle Monolage stretching und Kompression) mit dehnbaren Elektroden imitiert normalen physiologischen Bedingungen als auch extreme Bedingungen33induziert werden.
Daher ist die Begründung, dass in-vitro-elektromechanische Reize basierend auf physiologischen Bedingungen das Cardiomyogenic Potential einer Zelle steigern könnte. In der Tat, könnte diese Stimulation profitieren weitere Integrationen von therapeutischen Zellen in das Myokard in einem Szenario mit klinischen oder Gewebe Reifung für Drogentest Anwendungen zu erhöhen.
Darüber hinaus wir isoliert und charakterisiert eine Bevölkerung von menschlichen Fettgewebe abgeleitet Vorläuferzellen der kardialen Ursprungs (kardiale ATDPCs)34. Diese Zellen befinden sich in das epicardial Fett. Diese Zellen anzeigen histopathologische und funktional wohltuend bei der Behandlung von Herzinfarkt und auch pflegen Herz- und endothelialen Differenzierung Potenzial. 30 , 35. wir vermutet, dass diese Vorteile nach biophysikalischen Stimulation erhöhen würde.
Infolgedessen entwickelt ein Gerät und eine Anregung für die Zell-Population von Interesse und untersuchte die Auswirkungen. Dieses elektromechanische Protokoll ist eine neue Strategie zur aktiven Zelle erstreckt sich auf sterile Weise zu induzieren und nicht-invasiv im Vergleich zu früheren Veröffentlichungen36, in Kombination mit elektrischen Feldes Stimulation. Die Technik hier berichtet beschreibt im Detail die Vorrichtung und Verfahren für die elektrische, mechanische und elektromechanische Stimulation der Zellen verwendet.
Dieses Gerät kann sowohl mechanische als auch elektrische Stimulation, unabhängig voneinander oder gleichzeitig bereitstellen. Die Stimulation erfolgt mit einem nicht-invasive und aseptische neuartiger Ansatz, die Elektroden im Inneren einer standard Kultur-Platte und eine Plattform, die die mechanische und elektrische Kräfte (Abbildung 1) induziert Elektrodenspitzen Zelle unterstützt.
Die Plattform fasst bis zu sechs Kultur Platten und besteht aus einer Sandwichstruktur von lasergeschnittenen Poly(methyl methacrylate) und Leiterplatte Stücke. Die Plattform Prototyp stützt sich auf eine Kombination von ein monophasisch programmierbare computergesteuerten elektrischen Stimulator eine Leiterplatte für die stabile Verbindung der Elektroden und sechs 10 mm x 10 mm x 5 mm vernickelter Neodym-feste Magneten platziert in der Nähe von einer Seite des Kultur-Platten. Außerdem gibt es eine Aluminium-Bar mit sechs treibenden Magnete (Gleiches Modell) vor der anderen Seite der Kultur Platten gelegt und zog mit einem linearen Servomotor. Der Motor wird von einer Motorsteuerung, betrieben durch einen RS-232-Port von kommerzieller Software angetrieben (siehe die Tabelle der Materialien). Durch die Benutzeroberfläche und programmierbarer Stimulator ist es möglich, programmieren Sie die elektrischen Intensität, die Pulsdauer und Frequenz, die Häufigkeit der mechanischen Stimulation, die Einschaltdauer, die Anzahl der Impulse, die Impuls-Amplitude (Magnet Ausflug), und die Steigung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> Abbildung 1 : Elektromechanischer Stimulator. (A) PDMS Konstrukt für die Konditionierung der Zelle verwendet. (B) Zeichnung des PDMS Konstrukts, einschließlich Elektroden und Magnete. (C) Detail der Leiterplatte (Plattform) verwendet, um die elektromechanische Konditionierung durchzuführen. Dieses Panel verändert wurde, vom Llucià-Valldeperas Et Al.30. (D) Bild von der elektromechanische Stimulation-Plattform und Benutzeroberfläche (Computer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Der Stimulator und die Methode für die elektromechanische Konditionierung sind vollständig in zwei internationale Patente, WO-2013185818-A1-37 und WO-2017125159-A138beschrieben.
Das biokompatible Silikon Konstrukte entwickelt, um strukturelle Unterstützung Zellen, Elektroden und Magnete wurden beschriebenen zuvor10,21. Kurz, Sie bestehen aus Polydimethylsiloxan (PDMS), geformt und bei Raumtemperatur mit einem Elastizitätsmodul von 1,3 MPa, in der Nähe von physiologischen Ebenen geheilt. Das Konstrukt enthält einen Zelle Kultur Pool in einem flexiblen Bereich (10 x 10 x 2 mm), zwei innere quer-Steckplätze, die Elektroden zu halten, und zwei eingebettet 6 x 2 mm x 4 mm vernickelter Neodym-Magneten. Die Elektroden sind mit 0,2 mm Platin Draht verdreht um eine 2 x 3 mm x 12 mm Polytetrafluorethylen (PTFE) core-bar (21 cm pro Elektrode, ca. 23 Kurven) und platziert auf gegenüberliegenden Seiten des flexiblen Bereich erstelle ich ein elektrisches Feld zur Induktion gebaut elektrische Stimulation. Mechanische Dehnung wird durch magnetische Anziehungskraft zwischen Magneten, eingebettet in die Unterstützung und externen Magneten platziert neben der Kultur-Platte und auf dem beweglichen Arm Aluminium erreicht. Auf diese Weise kann die Zelle Unterstützung verlängert werden, ohne die sterile Barriere zu brechen. Dieser Ansatz eignet sich für eine Zelle Monolage aber könnte für dreidimensionale Konstrukte auch angepasst werden.
Darüber hinaus könnte ein regelmäßiges Muster eingeprägt, wo die Zellen ausgesät werden, werden mit einem linierten Beugungsgitter (1.250 Rillen/mm). Die direkte Visualisierung der Zellen kultiviert auf das PDMS-Konstrukt unter Hellfeld und Fluoreszenz Mikroskope ist wegen seiner Transparenz und 0,5 mm Dicke möglich. Im vorliegenden Fall hat der PDMS-Kultur-Pool eine vertikale Oberflächenmuster, senkrecht auf die Dehnung Kraft, um die Zellen senkrecht auf das elektrische Feld ausrichten, die das elektrische Feld Gefälle über die Zelle minimiert.
Abbildung 1 zeigt eine detaillierte Beschreibung des Konstrukts und Gerät zur Stimulation verwendet. Die PDMS zu konstruieren und Eigenschaften sind für die Zelle Dehnung (Abb. 1A, B) optimiert. Der Stimulator wird entwickelt und validiert für den effizienten Einsatz der gewünschten elektrischen und mechanischen Stimulation auf Zellen an der PDMS-Konstrukt befestigt. Dieser Prozess umfasst gute Konnektivität und Benutzer Bedienbarkeit durch die Software-Schnittstelle (Abbildung 1, D) zu gewährleisten.
Das Verfahren zur Zellstimulation mit diesem maßgeschneiderten Gerät wird im Abschnitt Protokoll beschrieben.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-10-10-05-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel-plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-06-04-02-HN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td >Dow Corning Corp</td>
			<td >184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)</td>
			<td >Newport</td>
			<td >05RG150-1250-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motor controller</td>
			<td >Faulhaber</td>
			<td>MCLM-3006-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Labview</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >70013-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>45353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 200 mM, 100x</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>M4526-24x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein &amp; RNA analyses</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AllPrep RNA/Protein Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>50980404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rneasy mini kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td >172-5140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random hexamers</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >79236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan PreAmp MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4391128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan Universal PCR MasterMix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immunostaining</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% formalin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >HT-501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >horse serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumina (BSA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PARAFILM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phalloidin Alexa 568</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S8032-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Connexin-43 rabbit primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>C6219 lot#061M4823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sarcomeric &#945;-actinin mouse primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7811 lot#080M4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GATA-4 goat primary antibody</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>AF2606 VAZ0515101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEF2 rabbit primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-313 lot#E0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SERCA2 goat primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8095 lot#D2709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >712-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-225-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-225-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >705-225-147</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Todesursache in den entwickelten Ländern. Infolgedessen hat die Nachfrage nach effektiven Herzmuskelzellen Therapien motiviert, Forscher in der Stammzelle und Bioengineering Felder in Vitro High-Fidelity-menschlichen Myokard für Grundlagenforschung und klinische Anwendungen zu entwickeln. Die unreife Phänotyp der Herzmuskelzellen ist jedoch eine Beschränkung auf den Erhalt von Gewebe, die funktionell die adulten Myokard imitieren charakterisiert vor allem durch mechanische und elektrische Signale. Somit ist der Zweck dieses Protokolls zu bereiten und Reifen der Ziel-Zell-Population durch elektromechanische Stimulation Rekapitulation physiologische Parameter. Herzgewebe Engineering entwickelt sich in Richtung mehr biologische Ansätze und Strategien basierend auf biophysikalische Reize, so sind an Dynamik gewinnt. Für diesen Zweck entwickelte Gerät ist einzigartig und ermöglicht individuelle oder gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, sorgfältig gekennzeichnet und validiert. Zusätzlich, obwohl die Methodik dieser Stimulator und einer bestimmten Zellpopulation optimiert wurde, kann es leicht auf andere Geräte und Zell-Linien angepasst werden. Die Ergebnisse hier bieten Beweis für das erhöhte kardiale Engagement der Zellpopulation nach elektromechanische Stimulation. Elektromechanisch stimulierte Zellen zeigen einen erhöhte Ausdruck der wichtigsten kardialen Marker, einschließlich der frühen, strukturellen und Calcium-regulierende Gene. Diese Zelle Klimaanlage könnte für weitere regenerative Zelltherapie, Krankheit Modellierung und Hochdurchsatz-Drogen-Screening nützlich sein.

Abbildung 2 stellt das allgemeine Schema für die Zellstimulation gefolgt. Kurz, wurden Zellen ausgesät auf das PDMS-Konstrukt und elektromechanische Stimulation mit einem Medienwechsel zweimal pro Woche durchgeführt. Nonstimulated Zellen dienten als Kontrolle für die elektromechanische Konditionierung. Darüber hinaus wir das Experiment ein zusätzliches Steuerelement hinzugefügt, und subkutane ATDPCs dienten als Kontrolle für kardiale ATDPCs. Von subku...

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Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ausbildung einer Zellpopulation, die mit elektrischen und mechanischen Reizen emuliert kardiale Physiologie. Diese elektromechanische Stimulation erhöht das Cardiomyogenic Potenzial der behandelten Zellen und ist eine vielversprechende Strategie für weitere Zelltherapie, Krankheit Modellierung und Drogen-Screening.

Gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, Cells Cardiomyogenic Potenzial zu steigern

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Dies ist eine Methode, um elektromechanische Stimulation auf Zellen anzuwenden. Es hat mehrere Anwendungen, um seine Auswirkungen auf eine Zellpopulation zu studieren, Vortraining für In-vivo-Lieferung, und Zellreifung. Der Vorteil ist, dass elektrische und mechanische Reize mit dem gleichen Gerät einzeln oder gleichzeitig angewendet werden können, während sterile virale intakt bleiben.Diese Technik ist ein indirekter Ansatz für unsere Therapie. Zelltherapie gilt als elektromechanisch stimulierte Zellen kann eine interessante Zellpopulation zur Behandlung von Intro-Myokard sein. Diese Methode gehört in der Regel zum Kardiovaskulärfeld, aber es könnte auch auf das Nervensystem angewendet werden.Dies ist eine einfache Technik, die Geduld erfordert. Der schwierigste Teil wird sein, mit den kleinen Stücken zu arbeiten, und halten Die Sterilität durchweg. Es gibt kleine Details der Manipulation, die schwer zu erklären sind, so dass die visuelle Demonstration wirklich hilfreich ist.Beginnen Sie mit der Übertragung von 12 gereinigten PDMS-Konstruktionen auf sterile 10-Zentimeter-Platten. Um eine vollständige Sterilisation zu versichern, setzen Sie die Platten fünf Minuten lang UV-Licht aus. Übertragen Sie dann jedes Konstrukt auf eine separate 35-Millimeter-Zellkulturplatte oder 6-Well-Platten für die sofortige Zellaussaat.Um mit der Zellaussaat zu beginnen, waschen Sie zunächst einen konfluenten T75-Kolben kardialer ATDPCs mit fünf Millilitern 1x PBS. Um die Zellen zu lösen, fügen Sie einen Milliliter 0,05%trypsin-EDTA hinzu. Und bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten brüten.Fügen Sie dann fünf Milliliter komplettes Medium hinzu, um die Trypsin-EDTA zu inaktivieren. Sammeln Sie alle getrennten Zellen in einem 15 Milliliter Rohr. Waschen Sie das Zellglas zweimal mit fünf MilliliterPBS, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln, und fügen Sie es in die 15 Milliliter Tube.Zentrifuge bei 230 g für fünf Minuten bei 22 Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in zwei Milliliter neines vollständigen Mediums wieder auf, und zählen Sie sie mit dem Hämozytometer. Samen 200 Mikroliter Herz-ATDPCs in jede Platte mit dem PDMS konstruktiert, um etwa 80% der Säfläche von Zellen bedeckt am nächsten Tag zu erhalten.Inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5% CO2. Fügen Sie vorsichtig 2 Milliliter vorgewärmtes komplettes Medium pro Platte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen mit den Konstrukten bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 über Nacht.Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, weisen Sie sechs von 12 Konstrukten für die elektromechanische Stimulation zu, und halten Sie sechs für nicht stimulierte Steuerungen. Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Stimulationseinheit zu reinigen. Legen Sie die Stimulationseinheit, sterile Elektroden und Pinzette in den Durchflussschrank.Um die Elektroden und Konstrukte leicht zu manipulieren, entfernen Sie 90% des Mediums aus jeder Zellkulturplatte. Platzieren Sie die PDMS-Konstrukte in der richtigen Position in Richtung des Magneten, um die magnetische Anziehungskraft zwischen festen und mobilen Magneten zu versichern. Diese beiden vorherigen Schritte, in denen Sie die gesäten PDMS-Konstrukte der Zelle und die Elektroden manipulieren, während die Sterilität während des gesamten Prozesses beibehalten wird, sind die kritischsten.Schließen Sie dann den Platindraht an die Elektrodenverbinder an. Richten Sie den PTFE-Teil der Elektroden in ihren vorgesehenen Räumen in den PDMS-Konstrukten aus. Fügen Sie 2,5 Milliliter frisches, vorgewärmtes komplettes Medium zu jedem Konstrukt hinzu.Sobald alle PDMS-Konstrukte platziert und elektrisch mit der Plattform verbunden sind, platzieren Sie die Plattform wieder in den 37 Grad Celsius und 5%CO2-Inkubator. Schließen Sie dann die elektrische und mechanische Quelle an. Um das Stimulationsprogramm zu konfigurieren, geben Sie elektrische und mechanische Stimulationsregime über die Benutzeroberflächen des elektrischen Stimulaators und der Anwendung an, die die mechanische Stimulation steuert.Um die Synchronität einzustellen, schalten Sie den elektrischen Stimulator ein, und warten Sie, bis das Hauptmenü auf dem Display angezeigt wird. Wählen Sie dann Option zwei, Bearbeitungssequenz plus Enter aus. Um das Sequenzmenü zu bearbeiten, verwenden Sie die Registerkarte Modus, um current auszuwählen, indem Sie auf Plus klicken" und drücken Sie die Eingabetaste"Für den Zeitraum, Wählen Sie 1000"mit Plus/Minus und drücken Sie die Registerkarte "Eingabemodus" Und drücken Sie die Taste "Für die Amplituden-Registerkarte" wählen Sie 1"mit Plus/Minus aus und drücken Sie die Taste"Dann, zurück ins Hauptmenü, wählen Sie Option 4 aus, und erzeugen Sie dann die Sequenz, und drücken Sie "Im mechanischen Stimulationsbereich des Bedienfelds 1000" in der Plusperioden-Textsteuerung.Schreiben Sie dann 500"in die ON-Zeittextsteuerung, um die mechanische Pulsdauer einzustellen. Schreiben Sie schließlich 2000"in das Exkursionstextsteuerelement, um eine 10%construct Dehnung zu liefern. Ändern Sie die Zellmedien zweimal pro Woche, indem Sie zuerst die alten Medien entfernen und dann warme, frische Medien an den Seiten der PDMS-Unterstützung hinzufügen.Am siebten Tag, am Ende des Experiments, sammeln Sie die Proben, wie im Manuskript beschrieben. Elektromechanisch stimulierte kardiale ATDPCs verbesserten ihr kardiomyogenes Potenzial. Dies wurde durch Echtzeit-PCR angezeigt, die eine erhöhte Expression von frühen und späten Herzgenen zeigten, insbesondere den kardialen Transkriptionsfaktor GATA-4, den Strukturmarker Beta-Myosin-schwere Kette und das kalziumverwandte Gen Connexin43.Phalloidin Färbung gegen Aktinfasern zeigte, dass die Mehrheit der Zellen nach dem vertikalen Muster ausgerichtet. Die Connexin43-Verteilung erfolgte hauptsächlich im Zytoplasma und in der Plasmamembran und trug zur intrazellulären Kommunikation durch Spaltknoten bei. MEF2- und GATA-4-Transkriptionsfaktoren wurden an den Kernen in kardialen ATDPCs lokalisiert.Aber GATA-4 wurde nicht in subkutanen ATDPCs nachgewiesen. Die zytoplasmatischen Marker SERCA2 und sarcomeric alpha-actinin zeigten keine reife Sarkome-Organisation, die typisch für Kardiomyozyten ist. Und Schlagen wurde nicht bei der Kontrolle beobachtet und stimulierte Zellpopulationen.Eine gesunde Zellmonolayer zu Beginn dieses Protokolls und die Beibehaltung der Sterilität während des gesamten Verfahrens sind entscheidend. Nach der Probenentnahme können die Standard-Genomproteinexpressionstechniken durchgeführt werden. Diese Technik hilft, die Wirkung von elektrischen und/oder mechanischen Reizen der Zelle besser zu verstehen.Bis vor kurzem war es unmöglich, das gleiche Gerät für beide Stimulationen zu verwenden, was den Vergleich der Ergebnisse erschwerte.

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Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Selbstmontage von Gamma-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren in komplexe Nanostrukturen in organischen Lösungsmittelmischungen

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...