Name: simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential at JoVE.com

המחברים רוצה להודות חברי תכנית המחקר של ICREC (IGTP, בדלונה) ואת אלקטרונית קבוצה במכשור ביו-רפואי (UPC, ברצלונה), במיוחד פרופסור ג'יי Rosell-פרר. בנוסף, המחברים להכיר תאי גזע Translational רפואה יומן ולחץ AlphaMed עבור המתיר את העיבוד של דמויות שפורסמו בעבר (Llucià-Valldeperas, et al. 30)-הפיתוח של האב-טיפוס הזה, העיצוב של הפרוטוקול נתמכו Ministerio דה Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio דה Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), הנציבות האירופית (תכנית המסגרת השביעית RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), פונדציו La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502), Fundación פארא לה Innovación y la Prospectiva en סאלוד en אספניה (FIPSE; 00001396-06-15).

מחקר זה משתמש ATDPCs הלב האנושי מדגימות החולה. השימוש שלהם אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית, כל המטופלים נתן הסכמה מדעת. פרוטוקול המחקר תואמת העקרונות המתוארים את הצהרת הלסינקי.
1. תכשירים
<ol><li>פינצטה אוטוקלב שתי אלקטרודות PTFE פלטינה 12 סטימולציה חשמלית, מגבות נייר, ב 121 מעלות צלז...

גירוי מכאני חשמלי שנראה חלופה בטוחה עבור הכנת תאי הלב סביבה עוינת ושיפור מחויבותם הלב. . הנה, פרוטוקול המתואר ובתאים לב מוגברת הביטוי של סמנים הלב הראשי, היה דיווח להיות מועיל עבור שלהם השרשה הבא על שריר הלב מאתר infarcted30. באופן כללי, ATDPCs לב electromechanically מגורה עלה הביטוי של גנים הקשו...

תפקוד הלב מבוסס על המושבים של עירור חשמלי והתכווצות מכני. בקצרה, צמתי המערכת cardiomyocyte היתר האות החשמלי הפצת לייצר כמעט סינכרונית התכווצויות הלב משאבת הדם מערכתית, דרך מערכת ריאתי. תאי לב, לפיכך, עוברים כוחות חשמליים ומכניים המסדירים ג'ין פונקציה ביטוי וסלולר. בהתאם לכך, קבוצות רבות ניסו לפתח תרבות פלטפורמות המחקים הסביבה פיזיולוגיים לב להבין את התפקיד של גירויים מכניים וחשמליים על התפתחות הלב, הפונקציה ההבשלה. במבחנה חשמליים ומכניים stimulations בנפרד הוחל בהרחבה בהנדסת רקמות הלב לשפר מאפיינים פונקציונליים, להגדיל את התא ההבשלה או לשפר את תא-תא צימוד וסידן טיפול1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. עם זאת, מיזוג אלקטרו-מכאניים סינכרונית נותר מנוצלת בגלל האתגר של פיתוח ממריץ, פרוטוקול, ובשל אופטימיזציה חובה22.
עבודה ראשוני התייחס גירוי מכאני חשמלי כשילוב של גירוי חשמלי זלוף מדיה; עם זאת, הזרם אינו כרוך להרכב מבוסס-זן טיפוסי של מילוי חדרית23,24,25. מאוחר יותר, יותר גישות פיזיולוגיים בשילוב גירויים חשמליים עם דפורמציה פיזי או מתיחה לחקות את isovolumetric התכווצות26,27,28,29,30 ,31. פנג et al. תיאר ההפגנה הראשונה של גירוי מכאני חשמלי בשנת 2005, דיווח משופרת cardiomyocyte גודל ומאפייני כויץ26. וואנג et al. pretreated גזע mesenchymal עם 5-azacytidine והחלת מיזוג חשמליים ומכניים בו זמנית, שיפור recellularization, תא הכדאיות, בידול הלב ואת רקמת שיפוץ27. מאז אותם פרסומים, יש קבוצות יותר דיווחו על גירוי מכאני חשמלי של תאים monolayers או מהונדסים רקמות (למשל, שחור28,29,Vunjak-Novakovic31, קבוצה30) עם תאים ממוזגים הראשון נבדק ויוו30. בקצרה, מורגן ושחור נבדק מספר שילובים של גירויים חשמליים ומכניים, דיווח כי התזמון בין stimulations היה מכריע משום שאיחרו גירוי מכאני חשמלי משולב הניבו את התוצאות הכי טוב28. בשלב הבא, Godier-Furnémont, משתפי פעולה ממוטב פרוטוקול גירוי מכאני חשמלי עבור בונה שריר הלב מהונדסים מתאי הלב עכברוש neonatal, מושגת, בפעם הראשונה, מערכת יחסים של כוח חיובי-תדירות29. לאחר מכן, הקבוצה שלנו דיווחו כי תאי electromechanically preconditioned גדלו הביטוי של סמנים הלב הראשי במבחנה רחבה מועיל אפקטים ויוו, כגון שיפור תפקוד הלב או גדלה צפיפות כלי ב- לאוטם אזור הגבול30. הפרסום האחרון הוכיח כי רקמות הלב מן גזע-תא-derived cardiomyocytes נתון מיזוג אלקטרו-מכאניים הגיעו עם ההבשלה ברמה קרובה להיות אנושית למבוגרים לב מבנה ותפקוד31. בנוסף, פלטפורמות חלופיות גירוי תלת מימדי מהווים פיגומים electroactive המספקים חשמלי, מכני, ומצורפת רמזים הטופוגרפי לתאי32. יתר על כן, דפורמציה מכאנית (תא טפט מתיחה ודחיסה) יכולה להיגרם גם עם אלקטרודות מתיחה מחקה נורמלי בתנאים פיזיולוגיים, כמו גם בתנאים קיצוניים33.
לכן, הרציונל הוא הפריה גירויים אלקטרו-מכאניים בהתבסס על תנאים פיזיולוגיים יכול לשפר את הפוטנציאל cardiomyogenic של תא. אכן, לגירוי הזה יכול להפיק תועלת נוספת שילובים של תאים טיפולית לתוך שריר הלב בתרחיש קליני או להגדיל את רקמת ההבשלה ליישומים סמים-הקרנה.
בנוסף, אנו מבודדים, מאופיין אוכלוסיה של האדם נגזר רקמת שומן ובתאים של הלב מוצא (ATDPCs לב)34. תאים אלה נמצאים השומן epicardial. תאים אלה להציג השפעות מועילות histopathological ופונקציונליים בטיפול של אוטם שריר הלב, גם לתחזק את הלב ואת אנדותל בידול פוטנציאליים. 30 , 35. שיערנו כי יתרונות אלו יגדל לאחר גירוי ביופיזיקלי.
כתוצאה מכך, אנו פיתחה מכשיר משטר גירוי עבור האוכלוסייה תא עניין, חקר את ההשפעות. פרוטוקול זה אלקטרו-מכאניים אסטרטגיה חדשה לזירוז התא הפעיל מתיחה באופן סטרילי, noninvasively לעומת הקודם פרסומים36, בשילוב עם גירוי שדה חשמלי. הטכניקה דיווחו כאן מסביר בפירוט את ההתקן ואת שיטת המשמש את גירוי חשמלי, מכני, אלקטרו-מכאניים של תאים.
מכשיר זה יכול לספק גירויים חשמליים ומכניים, באופן עצמאי או בעת ובעונה אחת. הגירוי מתבצע עם גישה מוזרה אספטי לא פולשנית, הכולל תמיכה תא presterilized, אלקטרודות בתוך צלחת רגילה תרבות, ובעל פלטפורמה המשרה כלפי כוחות מכניים וחשמליים (איור 1).
הפלטפורמה יכולה להכיל עד 6 צלחות ותרבות מורכב מבנה כריך של לייזר poly(methyl methacrylate) וחתיכות המעגלים המודפסים. האבטיפוס פלטפורמה מתבסס על שילוב של monophasic לתכנות מבוקר-מחשב חשמל ממריץ, לוח מעגלים מודפסים עבור החיבור חזקים של אלקטרודות, ו 6 10 מ מ x 10 מ מ x 5 מ מ מ נאודימיום-קבוע מגנטים הניח ליד צד אחד של הלוחות תרבות. במלון יש גם בר אלומיניום עם שישה נהיגה מגנטים (לדוגמא) הניח לפני הצד השני של הלוחות תרבות ועבר עם במנוע סרוו ליניארי. המנוע הוא מונע על ידי בקר מנוע, המופעל באמצעות יציאת RS-232 על ידי תוכנה מסחרית (ראה את הטבלה של חומרים). דרך ממשק המשתמש ממריץ לתכנות, זה ניתן לתכנת את עוצמת חשמל, המשך את הדופק, תדר, התדירות של גירוי מכני, מחזור חיים שלה, מספר פולסים, הדופק משרעת (טיול מגנט), המדרון.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> איור 1 : ממריץ אלקטרו- (א) PDMS המבנה המשמש את מיזוג התא. (B) ציור של הבונה PDMS, כולל אלקטרודות ומגנטים. (ג) פירוט של הלוח מעגל מודפס (פלטפורמה) המשמש לביצוע ההתניה אלקטרו-מכאניים. לוח זה שונה מ- Llucià-Valldeperas et al.30. (ד) תמונה של גירוי מכאני חשמלי פלטפורמה וממשק משתמש (מחשב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
ממריץ את וגם את שיטת אלקטרו-מכאניים מיזוג מלא מתוארים שני הפטנטים הבינלאומי, וו-2013185818-A137 ו וו-2017125159-A138.
שהסיליקון מסתיימים מבנים שנועדו לספק תמיכה מבנית לתאים, אלקטרודות של מגנטים כבר שתוארה קודם לכן10,21. בקצרה, הם מורכבים של polydimethylsiloxane (PDMS), יצוק ולרפא בטמפרטורת החדר, עם מודול האלסטיות של MPa 1.3, קרוב רמות פיזיולוגיים. הבונה מכיל בריכה התרבות תאים באזור גמיש (10 מ מ x 10 מ"מ x 2 מ"מ), שני חריצים רוחביים הפנימי להחזיק את האלקטרודות, ושניים משובצים 6 מ"מ x 2 מ"מ x 4 מ מ ממ נאודימיום מגנטים. האלקטרודות בנויים על 0.2 מ מ פלטינום תיל כרוכים סביב 2 מ"מ x 3 מ"מ x מ מ 12 טפלון (PTFE) core בר (21 ס מ לכל אלקטרודה, פונה כ 23) והניח בשני צידי אזור גמיש כדי ליצור שדה חשמלי להשראת גירוי חשמלי. מתיחה מכנית מושגת באמצעות משיכה מגנטי בין מגנטים נעוץ התמיכה מגנטים חיצוני להציב ליד הלוחית תרבות, על זרוע אלומיניום נע. בדרך זו, ניתן להרחיב את התמיכה התא מבלי לשבור את מחסום סטרילי. גישה זו מתאימה טפט תא אבל יכול להיות מותאם מבנים תלת-ממדי, כמו גם.
בנוסף, דפוס קבוע יכול להיות מוטבעים בו התאים אינם נזרע, שימוש סריג עקיפה הנשלטים (1,250 חריצים מ"מ). פריט חזותי ישיר של תאים תרבותי על הבונה PDMS תחת brightfield ומיקרוסקופים פלורסנט אפשרי בשל שקיפות 0.5 מ מ עובי. במקרה הנוכחי, בבריכה תרבות PDMS יש דפוס פני שטח אנכי, אנכי כוח מתיחה, כדי ליישר את התאים בניצב לשדה חשמלי, אשר מצמצם את המילוי ההדרגתי של שדה חשמלי על פני התא.
איור 1 מציג תיאור מפורט של מבנה, מכשיר המשמש את הגירוי. PDMS לבנות, מאפיינים ממוטבים עבור תא מתיחה (איור 1 א', ב'). ממריץ הוא פיתח ואומת עבור יישום אפקטיבי של הגירוי הרצוי חשמליים ומכניים לתאים המחוברים הבונה PDMS. תהליך זה כולל הקפדה טובה operability בקישוריות המשתמש באמצעות ממשק תוכנה (איור 1C, יח).
ההליך עבור תא גירוי באמצעות התקן בהזמנה אישית זה מתוארת בסעיף פרוטוקול.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-10-10-05-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel-plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-06-04-02-HN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td >Dow Corning Corp</td>
			<td >184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)</td>
			<td >Newport</td>
			<td >05RG150-1250-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motor controller</td>
			<td >Faulhaber</td>
			<td>MCLM-3006-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Labview</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >70013-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>45353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 200 mM, 100x</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>M4526-24x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein &amp; RNA analyses</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AllPrep RNA/Protein Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>50980404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rneasy mini kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td >172-5140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random hexamers</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >79236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan PreAmp MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4391128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan Universal PCR MasterMix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immunostaining</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% formalin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >HT-501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >horse serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumina (BSA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PARAFILM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phalloidin Alexa 568</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S8032-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Connexin-43 rabbit primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>C6219 lot#061M4823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sarcomeric &#945;-actinin mouse primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7811 lot#080M4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GATA-4 goat primary antibody</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>AF2606 VAZ0515101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEF2 rabbit primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-313 lot#E0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SERCA2 goat primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8095 lot#D2709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >712-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-225-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-225-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >705-225-147</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה במדינות המפותחות. כתוצאה מכך, הביקוש טיפולים יעילים תא לב יש מוטיבציה חוקרים תאי הגזע והשדות בביו-הנדסה לפיתוח במבחנה אמינות גבוהה האנושי שריר הלב מחקר בסיסי ויישומים קליניים. אולם, פנוטיפ ילדותי של תאי לב היא הגבלה על קבלת רקמות באופן פונקציונלי לחקות מבוגרים שריר הלב, אשר מאופיין בעיקר על ידי אותות מכניים וחשמליים. לכן, המטרה של פרוטוקול זה נועד להכין. ולומדים האוכלוסייה תא היעד באמצעות גירוי מכאני חשמלי, recapitulating פיסיולוגיים. הנדסת רקמות הלב הוא מתפתח לקראת גישות ביולוגיות יותר, אסטרטגיות המבוססת על גירויים biophysical, לפיכך, אתה צובר תאוצה. המכשיר שפותח למטרה זו הוא ייחודי ומאפשר בודדים או בו-זמניים חשמליים ומכניים גירוי, בזהירות מאופיין ואומתו. בנוסף, למרות המתודולוגיה מוטבה זה ממריץ, אוכלוסיה תא ספציפי, זה בקלות ניתן להתאים שורות תאים ומכשירים אחרים. התוצאות כאן מציעים ראיה המחויבות לב מוגברת של האוכלוסייה תא לאחר גירוי מכאני חשמלי. תאים electromechanically מגורה הצג ביטוי מוגבר של סמנים הלב הראשי, כולל גנים מוקדם מבניים, ויסות הסידן. מיזוג התא הזה עשוי להיות שימושי עבור טיפול בתאי משובי נוסף, מידול המחלה תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

איור 2 מייצג את כללי הסכימה עבור גירוי התא. בקצרה, התאים היו נזרע על הבונה PDMS, נתון גירוי מכאני חשמלי, עם שינוי המדיה לבצע פעמיים בשבוע. תאים nonstimulated שימשו בתור פקד מיזוג אלקטרו-מכאניים. בנוסף, הוספנו פקד נוסף הניסוי, תת עורית ATDPCs שימשו פקד עבור ATDPCs הלב. ATDPCs תת...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential at JoVE.com

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

כאן אנו מציגים פרוטוקול על הדרכת אוכלוסיה התא באמצעות גירויים חשמליים ומכניים הדמיית פיזיולוגיה של הלב. גירוי מכאני חשמלי זה משפר את הפוטנציאל cardiomyogenic של תאים שטופלו, אסטרטגיה מבטיח טיפול בתאי נוספת, מידול המחלה, והתרופות הקרנה.

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

זוהי שיטה ליישם גירוי אלקטרומכני על תאים. יש לו יישומים מרובים כדי ללמוד את השפעותיו על אוכלוסיית התא, אימון מראש עבור משלוח in vivo, התבגרות התא. היתרון הוא כי גירויים חשמליים ומכאניים ניתן ליישם עם אותו מכשיר בנפרד או בו זמנית תוך שמירה על ויראלי סטרילי שלם.טכניקה זו היא גישה עקיפה לטיפול שלנו. טיפול בתאים נחשב לתאים מגורים אלקטרומכניים עשוי להיות אוכלוסיית תאים מעניינת לטיפול במבוא-שריר הלב. שיטה זו שייכת בדרך כלל לשדה הלב וכלי הדם, אבל זה יכול להיות מיושם גם על מערכת העצבים.זוהי טכניקה קלה הדורשת סבלנות. החלק הקשה ביותר יהיה לעבוד עם החלקים הקטנים, ולשמור על הסטריליות לאורך כל הדרך. יש מעט פרטים של מניפולציה שקשה להסביר, ולכן ההדגמה החזותית ממש מועילה.התחל בהעברת 12 מבני PDMS מנוקים לצלחות סטריליות של 10 ס"מ. כדי לבטח עיקור מלא, לחשוף את הצלחות לאור UV במשך חמש דקות. לאחר מכן להעביר כל מבנה לצלחת תרבות תאים נפרדת 35 מילימטר, או 6 בארות צלחות עבור זריעת תאים מיידית.כדי להתחיל זריעת תאים, לשטוף תחילה בקבוק T75 confluent של ATDPCs לב עם חמישה מיליליטר של 1x PBS. כדי לנתק את התאים, הוסף מיליליטר אחד של 0.05%trypsin-EDTA. ודגירה ב37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום שלם כדי להשבית את טריפסין-EDTA. לאסוף את כל התאים מנותקים בצינור 15 מיליליטר. לשטוף את זכוכית התא פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS כדי לאסוף את כל התאים הנותרים, ולהוסיף אותם צינור 15 מיליליטר.צנטריפוגה ב 230 גרם במשך חמש דקות ב 22 מעלות צלזיוס. הסר את העל-טבעי, והשהה מחדש את התאים בשני מיליליטר של מדיום שלם, וספיר אותם באמצעות ההמוציטמטר. זרעים 200 microliters של ATDPCs לב לתוך כל צלחת עם מבני PDMS כדי להשיג כ 80% משטח הזריעה מכוסה על ידי תאים למחרת.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, ו 5% CO2. מוסיפים בעדינות 2 מיליליטר של מדיום שלם מחומם מראש לכל צלחת. הדגירה את התאים עם המבנים ב 37 מעלות צלזיוס, ו 5% CO2 לילה.לפני תחילת הליך זה, להקצות שישה מתוך 12 מבנים עבור גירוי אלקטרומכני, ולשמור שישה עבור פקדים שאינם מגורה. השתמש 70% אתנול כדי לנקות את יחידת הגירוי. מניחים את יחידת הגירוי, אלקטרודות סטריליות, פינצטה בתוך ארון הזרימה.על מנת לתפעל בקלות את האלקטרודות והמבנהים, הסר 90% מהמדיום מכל לוחית תרבות תאים. מקם את מבני PDMS במיקום הנכון לכיוון המגנט כדי לבטח משיכה מגנטית בין מגנטים קבועים וניידים. שני שלבים קודמים אלה שבהם אתה מטפל במבנוני PDMS הזרעים של התא ובאלקטרודות תוך שמירה על הסטריליות לאורך כל התהליך הם הקריטיים ביותר.לאחר מכן, חבר את חוט הפלטינה למחברי האלקטרודה. כוון את חלק ה- PTFE של האלקטרודות בחללים המיועדים להן במבנונים של PDMS. הוסף 2.5 מיליליטר של מדיום שלם טרי, מחומם מראש לכל מבנה.לאחר שכל מבני ה-PDMS ממוקמים ומחוברים חשמלית לפלטפורמה, הנח את הפלטפורמה בחזרה ב-37 מעלות צלזיוס ובאינקובטור 5%CO2. לאחר מכן חבר את המקור החשמלי והמכני. כדי להגדיר את תוכנית הגירוי, לציין משטרים גירוי חשמלי ומכאני באמצעות ממשקי המשתמש של ממריצה חשמלית ואת היישום, אשר שולט על גירוי מכני.כדי להגדיר את הסנכרון, הפעל את המריצה החשמלית והמתן עד שהתפריט הראשי יופיע בתצוגה. לאחר מכן בחר באפשרות שתיים, ערוך רצף, בנוסף ל- Enter. כדי לערוך את תפריט הרצף, השתמש בכרטיסיה מצב כדי לבחור הנוכחי"על-ידי לחיצה על פלוס" והקשה על Enter"עבור התקופה, בחר 1000"עם פלוס/מינוס והקש Enter"וללשונית מצב הדק, בחר חיצונית לפי תוכנה והקש Enter"עבור הכרטיסיה משרעת, בחר 1"עם פלוס/מינוס והקש Enter"לאחר מכן, בחזרה בתפריט הראשי, בחר באפשרות 4 ולאחר מכן צור רצף והקש Enter"במקטע הגירוי המכאני של לוח היישום של הבקרה, כתוב תחילה 1000"בפקד הטקסט של תקופת החיבור.לאחר מכן כתוב 500 אינץ' בבקרת הטקסט בזמן ON, כדי להגדיר את משך הדופק המכאני. לבסוף, כתוב 2000"בפקד טקסט הטיול כדי לספק התארכות של 10%.. שנה את מדיית התא פעמיים בשבוע, על-ידי הסרה תחילה של המדיה הישנה ולאחר מכן הוספת מדיה חמה ורעננה בצידי התמיכה ב- PDMS.ביום השביעי, בסוף הניסוי, אוספים את הדגימות כמתואר בכתב היד. ATDPCs לב מגורה אלקטרומכנית שיפרה את הפוטנציאל הלבבי שלהם. זה היה מסומן על ידי PCR בזמן אמת מראה ביטוי מוגבר של גנים לב מוקדם ומאוחר במיוחד גורם שעתוק לב GATA-4, הסמן המבני בטא מיוסין שרשרת כבדה, ואת הגן הקשורות לסידן Connexin43.כתמי פאלודין נגד סיבי actin הראו כי רוב התאים מיושרים על פי התבנית האנכית. התפלגות Connexin43 הייתה בעיקר בציטופלסמה, וב קרום הפלזמה, ותרמה לתקשורת תאית דרך צמתים של פערים. גורמי שעתוק MEF2 ו- GATA-4 אותרו בגרעינים ב- ATDPCs לבביים.אבל GATA-4 לא זוהה ב ATDPCs תת עורית. סמנים ציטופלסמי SERCA2, ו סרקומרי אלפא-actinin, לא הראה ארגון סרקומר בוגר אופייני קרדיומיוציטים. ומכות לא נצפו בשליטה ואוכלוסיות תאים מגורה.מונוליאר תאים בריא בתחילת פרוטוקול זה ושמירה על הסטריליות לאורך כל ההליך הם קריטיים. לאחר איסוף הדגימה, ניתן לבצע את טכניקות ביטוי החלבון הגנום הסטנדרטיות. טכניקה זו מסייעת להבין טוב יותר את ההשפעה של גירויים חשמליים ו/או מכניים של תאים.עד לאחרונה, זה היה בלתי אפשרי להשתמש באותו מכשיר עבור שניהם גירוי, אשר עשה את התוצאות קשה יותר להשוות.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Alternating-Current Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

חרוזים ועל הפרדת תאים ריבוי ערוצים מכשירים microfluidic שימוש dielectrophoresis ו זרימה למינרית

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

סינתזה סימולטני של יחיד חומה פחמן ו גרפן פלזמה ארק מגנטית מוגברת

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

תבניות נימי פעולה ייחודית על ידי מיקרו-ערוצים בעצמות כמו-יכולות לשפר את הגיוס של תאים לשיקום גדול גרמי פגם

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

תא שריר לב מבוסס מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

שריר הלב מבוססי תא מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

הרכבה עצמית של חומצות פפטידיות פפטיד שעברו שינוי גמא לתוך ננו-מבנים מורכבים בתערובות ממס אורגניות

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...