Name: simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential at JoVE.com

Forfatterne vil takke medlemmer av elektronisk og biomedisinsk instrumentering gruppe (UPC, Barcelona), spesielt Prof J. Rosell-Ferrer forskningsprogrammet ICREC (IGTP, Badalona). I tillegg bekrefter forfatterne STAMCELLER translasjonsforskning medisin journal og AlphaMed Trykk for å tillate tilpasning av tidligere publiserte tall (Llucià-Valldeperas, et al. 30). utvikling av denne prototypen og utformingen av protokollen ble støttet av Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), Europakommisjonen 7th Framework Programme ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502), og Fundación para la Innovación y la Prospectiva no Salud España (FIPSE; 06-00001396-15).

Denne studien bruker menneskelige hjerte ATDPCs fra pasientprøvene. Bruken er godkjent av den lokale etikk, og alle pasienter ga samtykke. Studien protokollen følger prinsippene som ble forklart i erklæringen i Helsinki.
1. forberedelser
<ol><li>Autoclave to pinsett, 12 platina PTFE elektroder elektrisk stimulering og noen papirhåndklær, 121 ° c for 20 min.</li>
	<li>
Sterilisere 12 PDMS skreddersydd konstruksjoner (figur 1A).
	<ol>
<li>Va...

Elektromekanisk stimulering synes å være et trygt alternativ for celler forberedte et fiendtlig cardiac miljø og forsterke deres hjerte engasjement. Her, rapportert en protokoll beskrevet for hjerte progenitor celler økt uttrykk for viktigste cardiac markører og ble for å være gunstig for deres neste implantasjon på infarcted murint myokard30. Generelt økt electromechanically stimulert cardiac ATDPCs uttrykk for gener knyttet til tidlig, strukturelle og kalsium regulering, som aldri har v...

Hjertefunksjon er basert på koblingen av elektriske eksitasjon og mekanisk sammentrekning. Kort, cardiomyocyte intercellulære veikryss tillater elektrisk signal overføring å produsere nesten synkron sammentrekninger av hjertet som pumper blod systemisk og pulmonal systemet. CARDIAC celler, dermed gjennomgå både elektrisk og mekanisk styrker som regulerer gen uttrykk og cellular funksjon. Følgelig har mange grupper forsøkt å utvikle kultur plattformer som etterligner cardiac fysiologiske miljøet for å forstå rollen av mekanisk og elektrisk stimulering hjerte utvikling, funksjon og modning. In vitro mekaniske og elektriske stimulations er individuelt brukt mye i cardiac tissue engineering å forbedre funksjonelle egenskaper, øke celle modning, eller forbedre celle-celle kopling og kalsium håndtering1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. imidlertid synkron elektromekaniske condition fortsatt uutnyttet på grunn av utfordringen med å utvikle en stimulator og protokollen, og fordi det obligatoriske optimalisering22.
Forarbeidet adressert elektromekaniske stimulering som en kombinasjon av elektrisk stimulering og media perfusjon; flyten innebærer imidlertid ikke press-baserte deformasjon typisk ventrikkel fylling23,24,25. Senere, kombinert mer fysiologiske tilnærminger elektrisk stimuli med fysiske feil eller strekke å etterligne i isovolumetric sammentrekning26,27,28,29,30 ,31. Feng et al. beskrevet den første demonstrasjonen av elektromekaniske stimulering i 2005, rapportering forbedret cardiomyocyte størrelse og kontraktile26. Wang et al. forbehandlet mesenchymal stamceller med 5-azacytidine og brukt samtidig mekaniske og elektriske condition, bedre recellularization, celle levedyktighet, hjerte differensiering og vev remodeling27. Siden disse publikasjoner, flere grupper har rapportert på elektromekaniske stimulering av celle monolayers eller utviklet vev (f.eks svart28, Vunjak-Novakovic29,31og vår gruppe30) med den første betinget celler testet i vivo30. Kort, Morgan og svart testet flere kombinasjoner av mekaniske og elektriske stimuli, rapporterer at timingen mellom stimulations var viktig fordi forsinket kombinert elektromekaniske stimulering gitt de beste resultater28. Deretter Godier Furnémont og samarbeidspartnere optimalisert en elektromekaniske stimulering protokoll for konstruert hjertet muskel konstruksjoner fra neonatal rotte hjerteceller og oppnådd, for første gang, en positiv kraft-frekvens forholdet29. Etterpå rapportert vår gruppe at electromechanically preconditioned celler økt uttrykk for viktigste cardiac markører i vitro og bred gunstige effekter i vivo, som forbedret hjertefunksjon eller økt fartøyet tetthet i betennelsessykdommer grensen område30. Den nyeste publikasjonen har vist at hjerte vev fra stem-cell-derived cardiomyocytes utsatt for elektromekaniske condition nådde en modning nivå nærmere menneskelige voksne cardiac struktur og funksjon31. I tillegg alternativ tredimensjonale stimulering plattformer omfatter electroactive stillaser som gir elektriske, mekaniske og topografiske signaler til cellene festet32. Videre kan mekanisk deformasjon (celle monolayer stretching og kompresjon) også bli satt med elastisk elektroder mimicking normale fysiologiske forhold, samt ekstreme forhold33.
Begrunnelsen er derfor at i vitro elektromekaniske stimuli basert på fysiologiske forhold kan styrke cardiomyogenic potensialet i en celle. Faktisk kunne denne Stimuleringen dra videre integrasjoner av terapeutiske celler i myokard i klinisk scenario eller øke vev modning for narkotika-screening programmer.
Dessuten, vi isolert og preget en befolkning på menneskelig fettvev-avledet progenitor celler av cardiac opprinnelse (hjerte ATDPCs)34. Disse cellene er plassert i epicardial fettet. Disse cellene vise gunstige histopathological og funksjonelle effekter i behandlingen av hjerteinfarkt og også vedlikeholde cardiac og endothelial differensiering potensielle. 30 , 35. vi hypotesen at disse fordelene vil øke etter Biofysiske stimulering.
Derfor vi utviklet en enhet og en stimulering regime for celle befolkningen av interesse og undersøkt virkningene. Denne elektromekaniske protokollen er en ny strategi å indusere aktive cellen strekker seg på en steril måte og sammenlignet noninvasively med tidligere publikasjoner36, i kombinasjon med elektrisk felt stimulering. Teknikken rapporterte her forklarer i detalj enheten og metoden brukes til elektriske, mekaniske og elektromekaniske stimulering av celler.
Denne enheten kan gi både elektrisk og mekanisk stimulering, uavhengig eller samtidig. Stimulering utføres med en noninvasive og aseptisk romanen tilnærming som inkluderer presterilized cellestøtte, elektroder plassert inne i en standard kultur plate, og en plattform som induserer de mekaniske og elektriske styrkene (figur 1).
Plattformen kan inneholde opptil seks kultur plater og består av en sandwich struktur laserskåret poly(methyl methacrylate) og kretskort stykker. Plattformen prototypen er avhengig av en kombinasjon av en monophasic programmerbare datastyrt elektro stimulator, et kretskort for robust tilkoblingen elektroder og seks 10 x 10 mm x 5 mm nikkelbelagt Neodym-fast magneter plassert nær ene kultur platene. Det er også en aluminium bar med seks kjøring magneter (samme modell) plassert foran den andre siden av kultur platene og flyttet med en lineær servomotor. Motoren er drevet av en motor kontroller, drives gjennom en RS-232 port av kommersiell programvare (se Tabell for materiale). Gjennom brukergrensesnittet og programmerbare stimulator er det mulig å programmere elektrisk intensiteten, hele puls og frekvens, hyppigheten av mekanisk stimulering, sin driftssyklus, antall pulser, puls amplitude (magnet utflukt), og bakken.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> Figur 1 : Elektromekaniske stimulator. (A) PDMS konstruere brukes for cellen condition. (B) tegning av den PDMS konstruksjonen, inkludert elektroder og magneter. (C) detalj av kretskort (plattform) brukes til å utføre den elektromekaniske condition. Dette panelet er endret fra Llucià-Valldeperas et al.30. (D) bilde av elektromekaniske stimulering plattformen og grensesnittet (datamaskin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Både stimulator og metoden for elektromekaniske condition er fullstendig beskrevet i to internasjonale patenter, WO-2013185818-A137 og WO-2017125159-A138.
Biokompatible silikon konstruksjoner laget for å gi strukturell støtte celler, elektroder og magneter har vært beskrevet tidligere10,21. Kort, de består av polydimethylsiloxane (PDMS), støpt og kurert ved romtemperatur, med en ung modulus 1.3 MPA, nær fysiologiske nivåer. Konstruer inneholder en celle kultur basseng i et fleksibelt (10 mm x 10 x 2 mm), to indre tverrgående spor å holde elektrodene og to innebygd 6 x 2 mm x 4 mm nikkelbelagt neodymmagneter. Elektrodene er bygget med 0.2 mm platina wire snurret rundt en 2 x 3 mm x 12 mm polytetrafluoroethylene (PTFE) core bar (21 cm per elektrode, ca 23 svinger) og plassert på motsatte sider av fleksible området for å opprette et elektrisk felt for induksjon elektrisk stimulering. Mekanisk strekker oppnås gjennom magnetisk tiltrekning mellom magneter i støtte og eksterne magneter plassert ved kultur plate og på bevegelige aluminium arm. På denne måten kan cellestøtte utvides uten å bryte sterilt barrieren. Denne tilnærmingen passer for en celle monolayer, men kan tilpasses til tre-dimensjonale konstruksjoner, også.
I tillegg kan mønsteret være trykt hvor cellene er sådd, bruker en styrt Diffraksjon rist (1250 riller/mm). Direkte visualisering av celler kultivert på PDMS Konstruer under brightfield og fluorescerende mikroskop er mulig på grunn av sin åpenhet og 0,5 mm tykkelse. I det aktuelle tilfellet har PDMS kultur bassenget en vertikal overflaten mønster, vinkelrett strekker styrken, justere cellene vinkelrett til elektriske feltet som minimerer elektrisk felt graderingen over cellen.
Figur 1 viser en detaljert beskrivelse av konstruksjonen og apparat for stimulering. PDMS konstruere og egenskaper er optimalisert for celle strekker (figur 1A, B). Stimulator er utviklet og godkjent for effektiv bruk av ønsket elektro og mekanisk stimulering celler knyttet til den PDMS konstruksjonen. Denne prosessen inneholder sikre god tilkobling og bruker brukbarhet gjennom programvaregrensesnitt (figur 1 c, D).
Fremgangsmåten for cellen stimulering bruke skreddersydd enheten er beskrevet i delen protokollen.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-10-10-05-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel-plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-06-04-02-HN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td >Dow Corning Corp</td>
			<td >184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)</td>
			<td >Newport</td>
			<td >05RG150-1250-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motor controller</td>
			<td >Faulhaber</td>
			<td>MCLM-3006-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Labview</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >70013-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>45353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 200 mM, 100x</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>M4526-24x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein &amp; RNA analyses</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AllPrep RNA/Protein Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>50980404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rneasy mini kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td >172-5140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random hexamers</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >79236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan PreAmp MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4391128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan Universal PCR MasterMix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immunostaining</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% formalin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >HT-501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >horse serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumina (BSA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PARAFILM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phalloidin Alexa 568</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S8032-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Connexin-43 rabbit primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>C6219 lot#061M4823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sarcomeric &#945;-actinin mouse primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7811 lot#080M4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GATA-4 goat primary antibody</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>AF2606 VAZ0515101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEF2 rabbit primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-313 lot#E0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SERCA2 goat primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8095 lot#D2709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >712-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-225-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-225-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >705-225-147</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential

Kardiovaskulære sykdommer er den ledende dødsårsaken i utviklede land. Derfor har behovet for effektiv cardiac cellen terapi motivert forskere i feltene stilk cellen og bioteknologi å utvikle i vitro Hi-Fi-menneskelige myokard både grunnleggende forskning og klinisk bruk. Umodne fenotypen av cardiac celler er imidlertid en begrensning på å oppnå vev som etterligner funksjonelt voksen myokard, som kjennetegnes hovedsakelig av mekaniske og elektriske signaler. Dermed er formålet med denne protokollen å forberede og modne målet cellen befolkningen gjennom elektromekaniske stimulering, recapitulating fysiologiske parametere. Hjerte vev utvikling er i utvikling mot mer biologiske tilnærminger og strategier basert på Biofysiske stimuli, dermed er frammarsj. Enheten utviklet for dette formålet er unik og lar enkeltpersoner eller samtidige elektro og mekanisk stimulering, nøye preget og godkjent. I tillegg selv om metodikken er optimalisert for denne stimulator og en bestemt celle befolkningen, kan det enkelt tilpasses til andre enheter og linjer. Resultater her tilbyr bevis på økt hjerte engasjement av celle befolkningen etter elektromekaniske stimulering. Electromechanically stimulert celler Vis økt uttrykk for viktigste cardiac markører, inkludert tidlig, strukturelle og kalsium-regulere gener. Denne cellen condition kan være nyttig for ytterligere regenerativ cellen terapi, sykdom modellering og høy gjennomstrømming narkotikarelaterte screening.

Figur 2 representerer generelle skjemaet fulgt i cellen stimulering. Kort, celler var sådd på den PDMS konstruksjonen og utsatt for elektromekaniske stimulering, med en media endring utført to ganger i uken. Nonstimulated celler ble brukt som en kontroll for elektromekaniske condition. I tillegg vi lagt til en ekstra kontroll til eksperimentet, og underhud ATDPCs ble brukt som en kontroll for enkelte ATDPCs. Subkutan ATDPCs hentes fra subkutan fettvev, fø...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential at JoVE.com

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Her presenterer vi en protokoll for å trene en celle befolkningen ved hjelp av mekaniske og elektriske stimuli simulere cardiac fysiologi. Denne elektromekaniske stimulering forbedrer cardiomyogenic potensialet i behandlet cellene og er en lovende strategi for ytterligere cellen terapi, sykdom modellering og narkotikarelaterte screening.

Samtidige elektro og mekanisk stimulering å øke cellenes Cardiomyogenic potensial

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Dette er en metode for å bruke elektromekanisk stimulering på celler. Den har flere programmer for å studere dens effekter på en cellepopulasjon, pre-trening for in vivo levering, og celle modning. Fordelen er at elektriske og mekaniske stimuli kan påføres med samme enhet individuelt eller samtidig mens du holder steril viral intakt.Denne teknikken er en indirekte tilnærming til vår terapi. Celleterapi anses elektromekanisk stimulert celler kan være en interessant cellepopulasjon for å behandle intro-myokardi. Denne metoden tilhører vanligvis kardiovaskulærfeltet, men det kan også brukes på nervesystemet.Dette er en enkel teknikk som krever tålmodighet. Den vanskeligste delen vil jobbe med de små bitene, og holde steriliteten gjennom. Det er små detaljer om manipulasjon som er vanskelig å forklare, så den visuelle demonstrasjonen er veldig nyttig.Begynn med å overføre 12 rengjorte PDMS konstruksjoner for å sterile 10 centimeter plater. For å sikre fullstendig sterilisering, utsett platene for UV-lys i fem minutter. Deretter overfører hver konstruksjon til en egen 35 millimeter cellekulturplate, eller 6-brønns plater for umiddelbar cellesåing.For å starte cellesåing, vask først en samtidig T75 kolbe av hjerte-ATDPCer med fem milliliter 1x PBS. Hvis du vil koble fra cellene, legger du til én milliliter med 0,05 % trypsin-EDTA. Og inkubere på 37 grader Celsius i fem minutter.Deretter legger du til fem milliliter med komplett medium for å inaktivere trypsin-EDTA. Samle alle frittliggende celler i et 15 milliliter rør. Vask celleglasset to ganger med fem milliliter PBS for å samle eventuelle gjenværende celler, og legg dem til 15 milliliter røret.Sentrifuge ved 230 g i fem minutter ved 22 grader Celsius. Fjern supernatant, og re-suspendere cellene i to milliliter av komplett medium, og telle dem med hemocytometeret. Seed 200 mikroliter av hjerte-ATDPCer i hver plate med PDMS konstruerer for å oppnå ca 80% av såing overflaten dekket av celler neste dag.Inkuber ved 37 grader Celsius, og 5% CO2. Tilsett forsiktig 2 milliliter forhåndsoppvarmet komplett medium per plate. Inkuber cellene med konstruksjonene ved 37 grader Celsius, og 5% CO2 over natten.Før du starter denne prosedyren, tilordne seks av 12 konstruksjoner for elektromekanisk stimulering, og hold seks for ikke-stimulerte kontroller. Bruk 70 % etanol til å rengjøre stimuleringsenheten. Plasser stimuleringsenheten, sterile elektroder og pinsett inne i strømningskabinettet.For å enkelt manipulere elektrodene og konstruksjonene, fjern 90% av mediet fra hver cellekulturplate. Plasser PDMS-konstruksjonene i riktig posisjon mot magneten for å sikre magnetisk tiltrekning mellom både faste og mobile magneter. Disse to foregående trinnene der du manipulerer cellens seedede PDMS konstruerer og elektrodene samtidig som steriliteten gjennom hele prosessen er de mest kritiske.Koble deretter platinaledningen til elektrodekontaktene. Orienter PTFE-delen av elektrodene i deres utpekte områder i PDMS-konstruksjonene. Tilsett 2,5 milliliter friskt, forvarmet komplett medium til hver konstruksjon.Når alle PDMS-konstruksjoner er plassert og elektrisk koblet til plattformen, plasserer du plattformen tilbake i 37 grader Celsius og 5% CO2 inkubator. Koble deretter til den elektriske og mekaniske kilden. For å konfigurere stimuleringsprogrammet, spesifiser elektriske og mekaniske stimuleringsregimer gjennom brukergrensesnittene til den elektriske stimulatoren og applikasjonen, som styrer den mekaniske stimuleringen.Hvis du vil angi synkroniseringen, slår du på den elektriske stimulatoren og venter til hovedmenyen vises på displayet. Velg deretter alternativ to, rediger sekvens, pluss Enter. For å redigere sekvensmenyen, bruk modusfanen til å velge gjeldende"ved å klikke pluss"og trykke Enter"For perioden, velg 1000 "med pluss / minus og trykk Enter"Og for trigger modus kategorien, velg ekstern av programvare og trykk Enter"For amplitude kategorien, velg 1 "med pluss / minus og trykk Enter"Deretter, tilbake i hovedmenyen, velg alternativ 4, og deretter generere sekvens, og trykk Enter"I mekanisk stimulering delen av kontrollapplikasjonspanelet, først skrive 1000"i pluss periode tekstkontroll.Deretter skriver du 500 "i ON tid tekstkontroll, for å angi mekanisk puls varighet. Til slutt, skrive 2000 "i utflukt tekstkontroll for å levere en 10% konstruere forlengelse. Endre cellemediet to ganger i uken, ved først å fjerne det gamle mediet, og deretter legge til varme, friske medier på sidene av PDMS-støtten.På dag sju, på slutten av eksperimentet, samle prøvene som beskrevet i manuskriptet. Elektromekanisk stimulert hjerte ATDPCs forbedret deres kardiomyogene potensial. Dette ble indikert av sanntid PCR viser økt uttrykk for tidlig og sent hjerte gener spesielt hjerte transkripsjon faktor GATA-4, strukturell markør beta-myosin tung kjede, og kalsium relatert genet Connexin43.Falloidin farging mot actin fibre viste at de fleste celler justert i henhold til det vertikale mønsteret. Connexin43-fordelingen var for det meste i cytoplasma, og ved plasmamembranen bidro han til intracellulær kommunikasjon gjennom gapkryss. MEF2 og GATA-4 transkripsjonsfaktorer ble plassert ved kjernene i hjerte-ATDPCer.Men GATA-4 ble ikke oppdaget i subkutane ATDPCer. De cytoplasmatiske markørene SERCA2, og sarkomeriske alfa-actinin, viste ikke en moden sarkomerorganisasjon som er typisk for kardiomyocytter. Og juling ble ikke observert i kontroll og stimulert cellepopulasjoner.En sunn celle monolayer i begynnelsen av denne protokollen og holde steriliteten gjennom hele prosedyren er avgjørende. Etter prøvesamling kan standard genomproteinuttrykksteknikker utføres. Denne teknikken bidrar til å bedre forstå effekten av celle elektriske og / eller mekaniske stimuli.Inntil nylig var det umulig å bruke samme enhet for både stimulering, noe som gjorde resultatene vanskeligere å sammenligne.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Alternating-Current Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Samtidig Synthesis of Single-vegger karbon nanorør og Graphene i en Magnetisk forbedret Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering skjelettmuskulatur vev fra Murine Myoblast stamceller og anvendelse av elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Særpreget Handlekraft av mikrokanaler i Bone-lignende Maler kan forbedre Rekruttering av celler for Restaurering av Large Bony Defect

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk Kontroll av levende celler elektrisk aktivitet ved Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Kardial muskelcellebasert aktuator og selvstabiliserende biorobot - DEL 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Kardial muskelcellebasert aktuator og selvstabiliserende biorobot - del 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Gel-seq: En metode for samtidige sekvensering biblioteket utarbeidelse av DNA og RNA bruker Hydrogel matriser

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Bygging og bruk av en elektrisk stimulering kammer for å styrke Osteogenic differensiering i Mesenchymal Stem/Stromal celler i Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Selvmontering av gammamodifiserte peptidkjerner i komplekse nanostrukturer i organiske løsemiddelblandinger

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...