Name: simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00
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Os autores querem agradecer aos membros do programa de pesquisa ICREC (IGTP, Badalona) e grupo de instrumentação biomédica (UPC, Barcelona), especialmente Prof J. Rosell-Ferrer e eletrônica. Além disso, os autores reconhecem diário de medicina translacional de células-tronco e AlphaMed Press para permitir a adaptação das figuras previamente publicadas (Llucià-vedi, et al 30). o desenvolvimento deste protótipo e o design do protocolo foram apoiadas pelo Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y competitividade (SAF 2014-59892), a Comissão Europeia 7º programa-quadro ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) e Fundación para la Innovación y la Prospectiva en de Salud en España (FIPSE; 06-00001396-15).

Este estudo utiliza ATDPCs cardíacos humanos de amostras de pacientes. Seu uso foi aprovado pelo Comitê de ética local, e todos os pacientes deram consentimento informado. O protocolo do estudo está em conformidade com os princípios delineados na declaração de Helsinque.
1. preparações
<ol><li>Autoclave de duas pinças, 12 eletrodos platina de PTFE para estimulação elétrica e toalhas de papel, a 121 ° C por 20 min.</li>
	<li>
Esterilize 12 construções sob medidas de PD...

Estimulação eletromecânica parece ser uma alternativa segura para preparar células para um ambiente hostil e cardíaco e reforçar seu compromisso cardíaco. Aqui, um protocolo descrito para as células progenitoras cardíacas aumentou a expressão de marcadores cardíacos principais e foi relatado para ser benéfico para a sua próxima implantação no miocárdio murino enfartado30. Em geral, industrial estimulados ATDPCs cardíacas aumentaram a expressão de genes relacionados a cedo, estrut...

Função do coração é baseada no acoplamento da excitação elétrica e a contração mecânica. Brevemente, junções intercelulares casos permitem a propagação do sinal elétrico para produzir quase síncronas contrações do coração bombear o sangue sistemicamente e através do sistema pulmonar. Células cardíacas, assim, passam por forças elétricas e mecânicas que regulam a função celular e a expressão dos genes. Nesse sentido, muitos grupos têm tentado desenvolver plataformas de cultura que imitam o ambiente fisiológico cardíaco para compreender o papel da estimulação mecânica e elétrica em desenvolvimento cardíaco, função e maturação. Em vitro estímulos elétricos e mecânicos individualmente foram aplicados extensivamente em engenharia de tecido cardíaco para melhorar propriedades funcionais, aumentar a maturação celular ou melhorar o acoplamento de célula-célula e cálcio manipulação1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. no entanto, condicionado eletromecânico síncrono permanece inexplorado devido o desafio de desenvolver um estimulador e protocolo e devido a otimização obrigatório22.
Trabalho preliminar dirigida estimulação eletromecânica como uma combinação de estimulação elétrica e perfusão de mídia; no entanto, o fluxo não envolve a deformação baseados em tensão típica de enchimento ventricular23,24,25. Mais tarde, abordagens mais fisiológicas combinados estímulos elétricos com deformação física ou estiramento para imitar o tempo contração26,,27,28,29,30 ,31. Feng et al. descreveram a primeira demonstração de estimulação Eletromecânica em 2005, comunicação aprimorada casos propriedades contráteis e tamanho26. Wang et al. pré-tratados com células-tronco mesenquimais com 5 azacytidine e aplicado simultâneo condicionado elétrico e mecânico, melhorando recellularization, viabilidade celular, diferenciação cardíaca e tecido remodelação27. Desde aquelas publicações, mais grupos têm relatado na estimulação eletromecânica de monocamadas de células ou engenharia de tecidos (por exemplo, preto28,29,de Vunjak-Novakovic31e nosso grupo30) com o primeiras células condicionadas testaram in vivo30. Brevemente, Morgan e preto testaram várias combinações de estímulos elétricos e mecânicos, relatando que o sincronismo entre estímulos foi crucial porque atrasada combinada eletromecânica estimulação rendeu os melhores resultados de28. Em seguida, Godier-Furnémont e colaboradores otimizado um protocolo de estimulação Eletromecânica para construções de músculo coração engenharia de células de coração de rato neonatal e alcançado, pela primeira vez, uma relação de força positiva-frequência29. Depois disso, nosso grupo relatou que células precondicionadas industrial aumentaram a expressão de marcadores cardíacos principais em vitro e ampla benéfica efeitos in vivo, tais como melhorar a função cardíaca ou aumentou a densidade do navio no infarto região de fronteira30. A publicação mais recente demonstrou que os tecidos cardíacos de haste-pilha-derivado cardiomyocytes sujeitos a eletromecânico condicionado alcançado uma maturação nível mais próximo ao ser humano adulto cardíaca estrutura e função de31. Além disso, plataformas alternativas estimulação tridimensional compreendem eletroativos andaimes que fornecem elétrico, mecânico, e topográficas pistas para as células anexado32. Além disso, a deformação mecânica (célula monocamada alongamento e compressão) pode também ser induzida com eletrodos stretchable, simulando as condições fisiológicas normais, bem como condições extremas33.
Portanto, a lógica é que estímulos eletromecânicos in-vitro, com base em condições fisiológicas poderiam aumentar o potencial de cardiomyogenic de uma célula. Na verdade, este estímulo poderia beneficiar ainda mais integrações de células terapêuticas para o miocárdio em um cenário clínico ou aumentar a maturação do tecido para aplicações de despistagem de drogas.
Além disso, estamos isolados e caracteriza-se uma população de células progenitoras derivadas de tecido adiposo humano de cardíaco de origem (ATDPCs cardíacas)34. Estas células estão localizadas na gordura Epicárdica. Estas células exibir efeitos benéficos de histopatológicos e funcionais no tratamento de infarto do miocárdio e também mantenham a diferenciação cardíaca e endotelial potenciais. 30 , 35. formulamos a hipótese que estes benefícios aumentaria após estimulação Biofísica.
Consequentemente, desenvolvemos um dispositivo e um regime de estimulação para a população de células de interesse e investigou os efeitos. Este protocolo eletromecânico é uma nova estratégia para induzir a célula ativa, estendendo-se de forma estéril e canaliza em comparação com anteriores Publicações36, em combinação com a estimulação do campo elétrico. A técnica aqui relatada explica em detalhe o dispositivo e o método utilizado para a estimulação elétrica, mecânica e eletromecânica de células.
Este dispositivo pode fornecer estimulação elétrica e mecânica, isoladamente ou em simultâneo. A estimulação é realizada com uma abordagem de romance não-invasiva e asséptica que inclui suporte a célula presterilized, eletrodos colocados dentro de uma placa de cultura padrão e uma plataforma que induz as forças mecânicas e elétricas (Figura 1).
A plataforma pode conter até seis cultura placas e consiste de uma estrutura de sanduíche de poly(methyl methacrylate) cortados a laser e peças de placa de circuito impresso. O protótipo de plataforma se baseia em uma combinação de um monofásico programáveis controlados por computador estimulador elétrico, uma placa de circuito impresso para a robusta conexão dos eletrodos e seis 10 x 10 mm x 5 mm niquelado fixo de neodímio ímans colocados perto de um dos lados das placas de cultura. Há também uma barra de alumínio com seis ímãs condução (mesmo modelo) colocado na frente do outro lado das placas de cultura e mudou-se com um servomotor linear. O motor é impulsionado por um controlador do motor, operado através de uma porta RS-232 por software comercial (veja a Tabela de materiais). Através da interface do usuário e estimulador programável, é possível programar a intensidade elétrica e frequência, a duração do pulso, a frequência de estimulação mecânica, seu ciclo de trabalho, o número de pulsos, a amplitude de pulso (excursão do ímã), e a inclinação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> Figura 1 : Estimulador eletromecânica. (A) PDMS construção utilizada para o acondicionamento da célula. (B) desenho de construção de PDMS, incluindo eletrodos e ímãs. (C) detalhe da placa de circuito impresso (plataforma), usada para realizar o condicionamento eletromecânico. Este painel foi modificado de Llucià-vedi et al.30. (D) imagens da estimulação eletromecânica plataforma e usuário interface (computador). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tanto o estimulador e o método para o condicionamento de eletromecânico são totalmente descritos em duas patentes internacionais, WO-2013185818-A137 e WO-2017125159-A138.
O silicone biocompatível construções projetadas para fornecer suporte estrutural para as células, eletrodos e ímãs têm sido descritos anteriormente10,21. Resumidamente, eles consistem de polidimetilsiloxano (PDMS), moldado e curado à temperatura ambiente, com um módulo de Young de 1,3 MPa, perto de níveis fisiológicos. A construção contém um pool de cultura de células em uma área de flexível (10 x 10 x 2 mm), dois slots transversais internas para manter os eletrodos e dois incorporado 6 x 2 mm x 4 mm niquelado os ímãs do neodymium. Os eletrodos são construídos com 0,2 platina fio torcido em torno de uma 2 x 3 mm x 12 mm politetrafluoretileno core bar (21 cm por eletrodo, aproximadamente 23 voltas) e colocados em lados opostos da área flexível para criar um campo elétrico por indução estimulação elétrica. Alongamento mecânico é alcançado através da atração magnética entre ímãs encaixados no suporte e externos ímãs colocados ao lado da placa de cultura e o braço de alumínio em movimento. Desta forma, o suporte do celular pode ser estendido sem quebrar a barreira estéril. Esta abordagem é adequada para uma monocamada de células, mas pode ser adaptada para construções tridimensionais, bem como.
Além disso, um padrão regular poderia ser imprimido onde as células são semeadas, usando uma grade de difração regrada (1.250 grooves/mm). A visualização direta das células cultivadas na construção de PDMS sob brightfield e microscópios fluorescentes é possível devido à sua transparência e 0,5 mm de espessura. No presente caso, a piscina de cultura PDMS tem um padrão de superfície vertical, perpendicular à força de alongamento, para alinhar as células perpendicularmente ao campo elétrico, o que minimiza o gradiente do campo elétrico através da célula.
A Figura 1 mostra uma descrição detalhada da construção e o dispositivo usado para a estimulação. Construir os PDMS e características são otimizadas para celular alongamento (figura 1A, B). O estimulador é desenvolvido e validado para a aplicação efectiva da estimulação elétrica e mecânica desejada para células anexado para a construção PDMS. Este processo inclui garantir boa operabilidade de conectividade e usuário através da interface de software (Figura 1, D).
O procedimento para a estimulação de células usando este dispositivo feito por medida é descrito na seção de protocolo.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-10-10-05-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel-plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-06-04-02-HN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td >Dow Corning Corp</td>
			<td >184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)</td>
			<td >Newport</td>
			<td >05RG150-1250-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motor controller</td>
			<td >Faulhaber</td>
			<td>MCLM-3006-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Labview</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >70013-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>45353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 200 mM, 100x</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>M4526-24x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein &amp; RNA analyses</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AllPrep RNA/Protein Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>50980404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rneasy mini kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td >172-5140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random hexamers</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >79236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan PreAmp MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4391128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan Universal PCR MasterMix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immunostaining</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% formalin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >HT-501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >horse serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumina (BSA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PARAFILM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phalloidin Alexa 568</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S8032-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Connexin-43 rabbit primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>C6219 lot#061M4823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sarcomeric &#945;-actinin mouse primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7811 lot#080M4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GATA-4 goat primary antibody</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>AF2606 VAZ0515101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEF2 rabbit primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-313 lot#E0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SERCA2 goat primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8095 lot#D2709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >712-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-225-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-225-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >705-225-147</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential

Doenças cardiovasculares são a principal causa de morte nos países desenvolvidos. Consequentemente, a procura de terapias com células cardíacas eficaz tem motivado pesquisadores nos campos da bioengenharia e células-tronco para desenvolver em vitro alta fidelidade humana miocárdio para investigação fundamental e aplicações clínicas. No entanto, o fenótipo imaturo de células cardíacas é uma limitação na obtenção de tecidos que imitam funcionalmente o miocárdio adulto, que se caracteriza principalmente por sinais mecânicos e elétricos. Assim, o propósito do presente protocolo é preparar e amadurecer o populacao de celula alvo através da estimulação de Eletromecânica, recapitulando parâmetros fisiológicos. Engenharia de tecido cardíaco está evoluindo em direção a abordagens mais biológicas e estratégias baseadas em estímulos biofísicos, assim, estão ganhando impulso. O dispositivo desenvolvido para esta finalidade é único e permite individual ou simultânea elétrica e mecânica estimulação, cuidadosamente caracterizada e validado. Além disso, embora a metodologia foi otimizada para este estimulador e uma população de células específicas, facilmente pode ser adaptado para outros dispositivos e linhas celulares. Os resultados aqui oferecem evidências do compromisso cardíaco aumento da população celular após estimulação eletromecânica. Industrial estimulado as células apresentam um aumento da expressão de marcadores cardíacos principais, incluindo início, estruturais e cálcio-regulação de genes. Este condicionamento celular poderia ser útil para mais longe da terapia com células regenerativas, modelagem de doença e triagem de drogas de alto rendimento.

A Figura 2 representa o esquema geral seguido para a estimulação da célula. Brevemente, as células foram semeadas na construção de PDMS e submetidas à estimulação eletromecânica, com uma mudança de mídia realizada duas vezes por semana. Células nonstimulated foram usadas como um controle para o condicionamento eletromecânico. Além disso, nós adicionamos um controle extra para o experimento, e ATDPCs subcutâneas foram usados como um controle p...

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Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Aqui nós apresentamos um protocolo para a formação de uma população celular usando estímulos elétricos e mecânicos, emulando a fisiologia cardíaca. Esta estimulação eletromecânica aumenta o potencial de cardiomyogenic das células tratadas e é uma estratégia promissora para mais terapia celular, modelagem de doença e despistagem de drogas.

Estimulação simultânea de elétrica e mecânica para aumentar o potencial de Cardiomyogenic das células

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Este é um método para aplicar estimulação eletromecânica nas células. Possui múltiplas aplicações para estudar seus efeitos sobre uma população celular, pré-treinamento para entrega in vivo e maturação celular. A vantagem é que estímulos elétricos e mecânicos podem ser aplicados com o mesmo dispositivo individualmente ou simultaneamente, mantendo intacto o viral estéril.Esta técnica é uma abordagem indireta para nossa terapia. A terapia celular é considerada células eletromecanicamente estimuladas pode ser uma população celular interessante para tratar o intro-miocárdio. Esse método geralmente pertence ao campo cardiovascular, mas também pode ser aplicado ao sistema nervoso.Esta é uma técnica fácil que requer paciência. A parte mais difícil será trabalhar com as pequenas peças, e manter a esterilidade por toda parte. Há pequenos detalhes de manipulação que são difíceis de explicar, por isso a demonstração visual é realmente útil.Comece transferindo 12 construções PDMS limpas para placas estéreis de 10 centímetros. Para assegurar a esterilização completa, exponha as placas à luz UV por cinco minutos. Em seguida, transfira cada construção para uma placa de cultura celular separada de 35 milímetros, ou placas de 6 poços para semeadura celular imediata.Para iniciar a semeadura celular, primeiro lave um frasco confluente T75 de ATDPCs cardíacos com cinco mililitros de 1x PBS. Para desapegar as células, adicione um mililitro de 0,05% de trippsina-EDTA. E incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, adicione cinco mililitros de meio completo para inativar o trypsin-EDTA. Colete todas as células separadas em um tubo de 15 mililitros. Lave o vidro celular duas vezes com cinco mililitros de PBS para coletar quaisquer células restantes, e adicione-as ao tubo de 15 mililitros.Centrífuga a 230 g por cinco minutos a 22 graus Celsius. Remova o supernatário e suspenda as células em dois mililitros de meio completo, e conte-as com o hemótmetro. Semente 200 microliters de ATDPCs cardíacos em cada placa com o PDMS constrói para obter cerca de 80% da superfície de semeadura coberta por células no dia seguinte.Incubar a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Adicione suavemente 2 mililitros de meio completo pré-aquecido por placa. Incubar as células com os construtos a 37 graus Celsius, e 5% de CO2 durante a noite.Antes de iniciar este procedimento, atribua seis das 12 construções para estimulação eletromecânica e mantenha seis para controles não estimulados. Use 70% de etanol para limpar a unidade de estimulação. Coloque a unidade de estimulação, eletrodos estéreis e pinças dentro do armário de fluxo.Para manipular facilmente os eletrodos e construtos, remova 90% do meio de cada placa de cultura celular. Coloque os construções PDMS na posição certa em direção ao ímã para assegurar atração magnética entre ímãs fixos e móveis. Estas duas etapas anteriores em que você manipula as construções PDMS semeadas da célula e os eletrodos, mantendo a esterilidade durante todo o processo são as mais críticas.Em seguida, conecte o fio de platina aos conectores do eletrodo. Oriente a parte PTFE dos eletrodos em seus espaços designados nas construções PDMS. Adicione 2,5 mililitros de meio completo fresco e pré-aquecido a cada construção.Uma vez que todos os construtos PDMS são colocados e conectados eletricamente à plataforma, coloque a plataforma de volta para a incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2. Em seguida, conecte a fonte elétrica e mecânica. Para configurar o programa de estimulação, especifique regimes de estimulação elétrica e mecânica através das interfaces de usuário do estimulador elétrico e da aplicação, que controla a estimulação mecânica.Para definir o sincronizador, ligue o estimulador elétrico e aguarde que o menu principal apareça no visor. Em seguida, selecione a opção dois, edite sequência, além de Enter. Para editar o menu sequência, use a guia de modo para selecionar a corrente"clicando em mais"e pressionando Enter"Para o período, selecione 1000"com mais/menos e pressione Enter"E para a guia do modo de gatilho, selecione externo por software e pressione Enter"Para a guia de amplitude, selecione 1"com mais/menos e pressione Enter"Em seguida, de volta no menu principal, selecione a opção 4 e, em seguida, gere sequência e pressione Enter"Na seção de estimulação mecânica do painel do aplicativo de controle, primeiro escreva 1000"no controle de texto de período mais.Em seguida, escreva 500""no controle de texto on time, para definir a duração do pulso mecânico. Finalmente, escreva 2000"no controle de texto de excursão para entregar um alongamento de construção de 10%. Mude a mídia celular duas vezes por semana, primeiro removendo a mídia antiga e, em seguida, adicionando mídia quente e fresca nas laterais do suporte pdms.No sétimo dia, no final do experimento, colete as amostras conforme descrito no manuscrito. ATDPCs cardíacos eletromecanicamente estimulados aumentaram seu potencial cardiomiogênico. Isso foi indicado pelo PCR em tempo real mostrando aumento da expressão de genes cardíacos precoces e tardios especificamente o fator de transcrição cardíaca GATA-4, a cadeia pesada de marcadores estruturais beta-miosina, e o gene relacionado ao cálcio Connexin43.A mancha de faloides contra fibras de actina mostrou que a maioria das células se alinhava de acordo com o padrão vertical. A distribuição connexin43 foi principalmente no citoplasma, e na membrana plasmática, contribuindo para a comunicação intracelular através de junções de lacunas. Os fatores de transcrição mef2 e GATA-4 foram localizados nos núcleos em ATDPCs cardíacos.Mas o GATA-4 não foi detectado em ATDPCs subcutâneos. Os marcadores citoplasmados SERCA2, e alfa-actinina sarcomeric, não mostraram uma organização sarcomere madura típica para cardiomiócitos. E o espancamento não foi observado no controle e estimulou as populações celulares.Uma monocamada celular saudável no início deste protocolo e manter a esterilidade durante todo o procedimento são cruciais. Após a coleta da amostra, as técnicas padrão de expressão da proteína do genoma podem ser realizadas. Esta técnica ajuda a entender melhor o efeito dos estímulos elétricos e/ou mecânicos das células.Até recentemente, era impossível usar o mesmo dispositivo para ambos os estímulos, o que tornava os resultados mais difíceis de comparar.

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Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Auto-montagem de ácidos nucleicos de peptídeos modificados gama em nanoestruturas complexas em misturas de solventes orgânicos

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...