Name: simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential at JoVE.com

Författarna vill tacka medlemmarna i forskningsprogrammet ICREC (IGTP, Badalona) och Elektro och biomedicinsk Instrumentation grupp (UPC, Barcelona), särskilt Prof. J. Rosell-Ferrer. Dessutom bekräftar författarna STAMCELLER translationell medicin journal och AlphaMed tryck för att tillåta anpassning av tidigare publicerade siffror (Llucià-Valldeperas, et al. 30). utvecklingen av denna prototyp och utformningen av protokollet stöddes av Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), Europeiska kommissionen () 7: e ramprogrammet RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502), och Fundación para la Innovación y la Prospectiva sv Salud sv España (FIPSE; 06-00001396-15).

Denna studie använder mänskliga hjärt ATDPCs från patientprover. Deras användning har godkänts av den lokala etiska kommittén, och alla patienter gav informerat samtycke. Studieprotokollet överensstämmer med principerna i Helsingforsdeklarationen.
1. förberedelser
<ol><li>Autoklav två pincett, 12 platina PTFE elektroder för elektrisk stimulering, och några pappershanddukar, vid 121 ° C i 20 min.</li>
	<li>
Sterilisera 12 PDMS skräddarsydda konstruktioner (<strong class...

Elektromekaniska stimulering verkar vara ett säkert alternativ för att förbereda celler för en fientlig hjärt miljö och förbättra deras kardiella engagemang. Här, rapporterade ett protokoll som beskrivs för hjärt stamceller ökat uttryck av huvudsakliga kardiella markörer och för att vara till nytta för deras nästa implantation på infarcted murina myokardiet30. Generellt ökade elektromekaniskt stimuleras hjärt ATDPCs uttrycket av gener besläktade med tidigt, strukturella och kal...

Hjärtats funktion är baserad på kopplingen av elektrisk magnetisering och mekaniska kontraktion. Kort, tillåta hjärtmuskelcellen intercellulära junctions elektriska signalen förökning producera nästan synkron sammandragningar av hjärtat att pumpa blod systemiskt och via systemets pulmonell. Hjärtats celler, genomgå således både elektriska och mekaniska krafter som reglerar geners uttryck och cellulär funktion. Följaktligen har många grupper försökte utveckla kultur plattformar som efterliknar hjärt fysiologiska miljön för att förstå rollen av mekanisk och elektrisk stimulering på hjärt utveckling, funktion och mognad. In vitro elektriska och mekaniska stimuli har individuellt tillämpats i stor utsträckning hjärt vävnadsteknik att förbättra funktionella egenskaper, öka cell mognad eller förbättra cell cell koppling och kalcium hantering1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. dock synkron elektromekaniska luftkonditionering förblir outnyttjade på grund av utmaningen att utveckla en stimulator och protokoll, och den obligatoriska optimering22.
Förberedande arbetet behandlas elektromekaniska stimulering som en kombination av elektrisk stimulering och media perfusion; dock innebär inte flödet stam-baserade deformation typiska ventrikulära fyllning23,24,25. Senare, kombinerat mer fysiologiska metoder elektriska stimuli med fysiska deformering eller stretch att efterlikna isovolumetric sammandragning26,27,28,29,30 ,31. Feng et al. beskrivs den första demonstrationen av elektromekaniska stimulering i 2005, rapportering enhanced hjärtmuskelcellen storlek och kontraktila egenskaper26. Wang et al. förbehandlats mesenkymala stamceller med 5-azacytidine och tillämpas samtidig elektriska och mekaniska luftkonditionering, förbättra recellularization, cellernas viabilitet, hjärt differentiering och vävnad remodeling27. Sedan dessa publikationer, fler grupper har rapporterats på elektromekaniska stimulering av cell enskiktslager eller konstruerad vävnader (t.ex. svart28, Vunjak-Novakovic29,31och vår grupp30) med den första luftkonditionerade celler testade i vivo30. Kort, Morgan och svart testade flera kombinationer av elektriska och mekaniska stimuli, rapportering att tajmingen mellan stimuli var avgörande eftersom försenade kombinerade elektromekaniska stimulering gav den bästa results28. Nästa, Godier-Furnémont och medarbetare optimerad en elektromekanisk stimulering protokoll för bakåtkompilerade hjärtat muskler konstruktioner från neonatal råtta hjärtats celler och uppnås, för första gången, en positiv kraft-frekvens relation29. Efteråt, rapporterade vår grupp att elektromekaniskt betingade celler ökat uttryck av huvudsakliga kardiella markörer i vitro och bred välgörande effekter in vivo, såsom förbättrad hjärtfunktion eller ökade fartyget täthet i infarct gränsen region30. Senaste publikationen visade att hjärt vävnader från stem-cell-derived hjärtmuskelcellerna utsätts för elektromekaniska luftkonditionering nått en mognad nivå närmare mänskliga vuxen hjärt struktur och funktion31. Dessutom alternativa tredimensionella stimulering plattformar omfattar elektroaktiva ställningar som ger elektriska, mekaniska och topografiska ledtrådar till cellerna fäst32. Dessutom kan mekanisk deformation (cell enskiktslager stretching och komprimering) också induceras med töjbart elektroder härma normala fysiologiska förhållanden samt extrema förhållanden33.
Syftet är därför att in vitro-elektromekaniska stimuli utifrån fysiologiska förhållanden skulle kunna öka cardiomyogenic potentialen i en cell. Denna stimulering kunde faktiskt gynna ytterligare integrationer av terapeutiska celler i hjärtmuskeln i kliniska scenario eller öka vävnad mognad för drogkontroll applikationer.
Dessutom vi isolerade och kännetecknas en befolkning av mänsklig fettvävnad-derived stamceller av hjärt ursprung (hjärt ATDPCs)34. Dessa celler är belägna i epikardiell fettet. Dessa celler Visa positiva histopatologiska och funktionella effekter i behandling av hjärtinfarkt och även underhålla hjärt- och endotelceller differentiering potentiella. 30 , 35. vi hypotesen att dessa fördelar skulle öka biofysiska stimulation.
Därför vi utvecklat en enhet och en stimulering regim för cell befolkningen av intresse och undersökt effekterna. Detta elektromekaniska protokoll är en ny strategi att inducera aktiv cell sträcker sig i ett sterilt sätt och jämfört noninvasivt med tidigare publikationer36, i kombination med elektriskt fält stimulering. Den teknik som redovisas här förklarar i detalj enheten och metod som används för elektriska, mekaniska och elektromekaniska stimulering av celler.
Denna enhet kan ge både elektrisk och mekanisk stimulering, självständigt eller samtidigt. Stimulering utförs med en icke-invasiv och aseptiska ny metod som inkluderar presterilized cell support, elektroder placeras inuti en standard kultur-tallrik och en plattform som inducerar de mekaniska och elektriska krafterna (figur 1).
Plattformen rymmer upp till sex kultur plattor och består av en smörgås struktur av laserskuren poly(methyl methacrylate) och kretskort bitar. Plattformen prototypen bygger på en kombination av en monofasiska programmerbara datorstyrda elektrisk stimulator, ett tryckt kretskort för robust anslutning av elektroder och sex 10 x 10 mm x 5 mm förnicklat neodymium-fasta magneter placeras nära en sida om kultur plattorna. Det finns också en aluminium bar med sex drivande magneter (samma modell) placeras framför den andra sidan av kultur plattorna och flyttade med en linjär servomotor. Motorn drivs av en motor controller, drivs via en RS-232 port av kommersiell programvara (se Tabell för material). Genom användargränssnittet och programmerbara stimulator är det möjligt att programmera elektriska intensiteten, puls varaktighet och frekvens, frekvensen av mekanisk stimulering, dess arbetscykel, antalet pulser, puls amplituden (magnet utflykt), och lutningen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> Figur 1 : Elektromekaniska stimulator. (A), PDMS konstruktion används för cellen att villkora. (B) ritning av den PDMS bygga, inklusive elektroder och magneter. (C) detalj av kretskortet (plattform) används för att utföra de elektromekaniska konditionering. Denna panel har ändrats från Llucià-Valldeperas et al.30. (D) bild av det elektromekaniska stimulering plattform och användargränssnittet (dator). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Både stimulatorn och metoden för elektromekaniska luftkonditionering beskrivs fullt i två internationella patent, WO-2013185818-A137 och WO-2017125159-A138.
Biokompatibelt silikon konstruktioner avsedda att ge strukturellt stöd till celler, elektroder och magneter har beskrivits tidigare10,21. Kort, de består av Polydimetylsiloxan (PDMS), gjutna och härdas vid rumstemperatur, med Youngs modulus av 1.3 MPa, nära fysiologiska nivåer. Konstruktionen innehåller en cell kultur pool i ett flexibelt område (10 x 10 x 2 mm), två inre tvärgående slots att hålla elektroderna och två inbäddade 6 x 2 mm x 4 mm förnicklat neodymiummagneter. Elektroderna är byggda med 0,2 mm platina tråd vriden runt en 2 x 3 mm 12 mm polytetrafluoreten (PTFE) core bar (21 cm per elektrod, cirka 23 varv) och placerade på motsatta sidor av flexibla området för att skapa ett elektriskt fält för att inducera elektrisk stimulering. Mekaniska stretching uppnås genom magnetisk attraktion mellan magneter inbäddade i stöd och yttre magneter som placeras bredvid kultur plattan och på de rörliga aluminium-arm. På detta sätt kan cellen stödet förlängas utan att bryta den sterila barriären. Denna metod är lämplig för en cell enskiktslager men kan anpassas till tredimensionella konstruktioner, samt.
Dessutom kan ett regelbundet mönster vara präglade där cellerna är seedade, använder styrde diffraktion galler (1,250 räfflor/mm). Direkt visualisering av celler odlade på den PDMS bygga under brightfield och fluorescerande Mikroskop är möjligt på grund av dess öppenhet och 0,5 mm tjocklek. I det aktuella fallet har PDMS kultur poolen en vertikal ytmönster, vinkelrätt mot den stretching kraften, att anpassa cellerna vinkelrätt till det elektriska fältet, vilket minimerar elektriska fältet övertoningen över cellen.
Figur 1 visar en detaljerad beskrivning av konstruktion och enhet som används för att stimulera. PDMS konstruera och egenskaper är optimerade för cell stretching (figur 1A, B). Stimulatorn är utvecklats och validerats för en effektiv tillämpning av önskad elektrisk och mekanisk stimulering till celler som bifogas den PDMS konstruktion. Denna process omfattar att säkerställa bra anslutningsmöjligheter och användaren användbarhet genom programvarugränssnitt (figur 1 c, D).
Förfarandet för cell stimulering använder denna specialtillverkade enhet beskrivs i avsnittet protokoll.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-10-10-05-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nickel-plated neodymium magnets</td>
			<td >Supermagnete</td>
			<td >Q-06-04-02-HN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td >Dow Corning Corp</td>
			<td >184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)</td>
			<td >Newport</td>
			<td >05RG150-1250-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motor controller</td>
			<td >Faulhaber</td>
			<td>MCLM-3006-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Labview</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >70013-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>45353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Glutamine 200 mM, 100x</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>M4526-24x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein &amp; RNA analyses</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AllPrep RNA/Protein Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>50980404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rneasy mini kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td >172-5140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random hexamers</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >79236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan PreAmp MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4391128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TaqMan Universal PCR MasterMix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >4324018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immunostaining</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% formalin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >HT-501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >horse serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumina (BSA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PARAFILM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phalloidin Alexa 568</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S8032-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoechst 33342</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Connexin-43 rabbit primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>C6219 lot#061M4823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sarcomeric &#945;-actinin mouse primary antibody</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7811 lot#080M4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GATA-4 goat primary antibody</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>AF2606 VAZ0515101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEF2 rabbit primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-313 lot#E0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SERCA2 goat primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8095 lot#D2709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-165-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >712-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >715-225-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >711-225-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy2 secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >705-225-147</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous electrical and mechanical stimulation to enhance cells' cardiomyogenic potential

Hjärt-och kärlsjukdomar är den vanligaste dödsorsaken i utvecklade länder. Efterfrågan på effektiv hjärt cellterapi har följaktligen motiverat forskare i bioteknik fälten och stamceller att utveckla in vitro- HiFi-mänskliga myokardiet för både grundforskning och kliniska tillämpningar. Omogna fenotypen av hjärtats celler är dock en begränsning på att erhålla vävnader som funktionellt härmar vuxna hjärtmuskeln, som kännetecknas främst av mekaniska och elektriska signaler. Syftet med detta protokoll är således att förbereda och mogen cell målpopulationen genom elektromekaniska stimulering, går igenom fysiologiska parametrar. Hjärt vävnadsteknik utvecklas mot mer biologiska metoder och strategier utifrån biofysiska stimuli, således fart. Enheten för detta ändamål är unik och tillåter enskilda eller samtidiga elektrisk och mekanisk stimulering, noggrant kännetecknas och valideras. Dessutom, även om metoden har optimerats för denna stimulator och en viss cell befolkningen, kan det enkelt anpassas till andra enheter och cellinjer. Resultatet här erbjuda bevis på ökad hjärt engagemang i cell befolkningen elektromekaniska stimulation. Elektromekaniskt stimuleras cellerna visar ett ökat uttryck av huvudsakliga kardiella markörer, inklusive tidiga, strukturella och kalcium-reglerande gener. Denna cell konditionering kan vara användbar för ytterligare regenerativ cellterapi, sjukdom modellering och hög genomströmning drogkontroll.

Figur 2 representerar allmänna schemat följt för cell stimulering. Kortfattat, celler var seedade på den PDMS konstruktionen och genomgå elektromekaniska stimulering, med en media förändring utförs två gånger i veckan. Nonstimulated celler användes som kontroll för elektromekaniska konditionering. Dessutom har vi lagt en extra kontroll till experimentet och subkutan ATDPCs användes som en kontroll för hjärt ATDPCs. Subkutana ATDPCs erhålls fr?...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential at JoVE.com

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Här presenterar vi ett protokoll för att utbilda en cell befolkningen som använder elektriska och mekaniska stimuli efterlikna hjärtats fysiologi. Denna elektromekaniska stimulering förbättrar cardiomyogenic potentialen hos de behandlade cellerna och är en lovande strategi för ytterligare cellterapi, sjukdom modellering och drogkontroll.

Samtidiga elektrisk och mekanisk stimulering att öka cellernas Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Detta är en metod för att tillämpa elektromekanisk stimulering på celler. Den har flera ansökningar för att studera dess effekter på en cellpopulation, förutbildning för in vivo leverans, och cell mognad. Fördelen är att elektriska och mekaniska stimuli kan appliceras med samma enhet individuellt eller samtidigt samtidigt som steril viral intakt.Denna teknik är en indirekt strategi för vår terapi. Cellterapi anses elektromekaniskt stimuleras celler kan vara en intressant cellpopulation att behandla intro-myokardium. Denna metod tillhör i allmänhet det kardiovaskulära fältet, men det skulle också kunna tillämpas på nervsystemet.Detta är en enkel teknik som kräver tålamod. Den svåraste delen kommer att arbeta med de små bitarna, och hålla sterilitet hela. Det finns små detaljer om manipulation som är svåra att förklara, så den visuella demonstrationen är verkligen hjälpsam.Börja med att överföra 12 rengjorda PDMS konstruktioner för att sterilisera 10 centimeter plattor. För att försäkra fullständig sterilisering, exponera plattorna för UV-ljus i fem minuter. Överför sedan varje konstruktion till en separat 35 millimeter cellkulturplatta, eller 6-brunnsplattor för omedelbar cellsådd.För att starta cellsådd, tvätta först en konfluent T75-kolv hjärt-ATDC med fem milliliter på 1x PBS. Om du vill ta bort cellerna lägger du till en milliliter på 0,05%trypsin-EDTA. Och inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter.Lägg sedan till fem milliliter komplett medium för att inaktivera trypsin-EDTA. Samla alla fristående celler i ett 15 milliliter rör. Tvätta cellglaset två gånger med fem milliliter PBS för att samla in eventuella kvarvarande celler och tillsätt dem i 15 milliliterröret.Centrifugera vid 230 g i fem minuter vid 22 grader Celsius. Ta bort supernatanten, och åter upphäva cellerna i två milliliter av komplett medium, och räkna dem med hemocytometern. Frö 200 mikroliter av hjärt ATDC i varje platta med PDMS konstruktioner för att få cirka 80%av sådd yta som omfattas av celler följande dag.Inkubera vid 37 grader Celsius, och 5%CO2. Tillsätt försiktigt 2 milliliter förvuppverat komplett medium per platta. Inkubera cellerna med konstruktionerna vid 37 grader Celsius, och 5%CO2 över natten.Innan du börjar detta förfarande, tilldela sex av 12 konstruktioner för elektromekanisk stimulering, och hålla sex för icke-stimulerade kontroller. Använd 70%etanol för att rengöra stimuleringsenheten. Placera stimuleringsenheten, sterila elektroder och pincett inuti flödesskåpet.För att enkelt manipulera elektroderna och konstruktionerna, ta bort 90%av mediet från varje cellodlingsplatta. Placera PDMS-konstruktionerna i rätt läge mot magneten för att försäkra magnetisk attraktion mellan både fasta och mobila magneter. Dessa två tidigare steg där du manipulera cellens seedade PDMS konstruktioner och elektroderna samtidigt som steriliteten under hela processen är de mest kritiska.Anslut sedan platinatråden till elektrodkontakterna. Orientera PTFE-delen av elektroderna i deras avsedda utrymmen i PDMS-konstruktionerna. Tillsätt 2,5 milliliter färskt, förvörd komplett medium till varje konstruktion.När alla PDMS konstruktioner är placerade och elektriskt anslutna till plattformen, placera plattformen tillbaka till 37 grader Celsius, och 5%CO2 inkubator. Anslut sedan den elektriska och mekaniska källan. För att konfigurera stimuleringsprogrammet, specificera elektriska och mekaniska stimuleringsregimer genom användargränssnitten för den elektriska stimulatorn och applikationen, som styr den mekaniska stimuleringen.Om du vill ställa in synkronismen kopplar du på den elektriska stimulatorn och väntar tills huvudmenyn visas på displayen. Välj sedan alternativ två, redigera sekvens, plus Retur. För att redigera sekvensmenyn, använd fliken läge för att välja aktuell "genom att klicka plus"och trycka Enter"För perioden, välja 1000"med plus/minus och tryck enter"Och för fliken triggerläge, välj externt efter programvara och tryck på Enter"För amplitudfliken, välj 1"med plus/minus och tryck enter"Sedan, tillbaka i huvudmenyn, välj alternativ 4 och sedan generera sekvens, och tryck på Retur"I den mekaniska stimuleringen av kontrollapplikationspanelen, skriv först 1000"i plusperiodens textkontroll.Skriv sedan 500"i ON tid textkontroll, för att ställa in den mekaniska pulsen varaktighet. Slutligen, skriv 2000 "i utflykten textkontroll för att leverera en 10%konstruera töjning. Byt cellmedia två gånger i veckan, genom att först ta bort det gamla mediet och sedan lägga till varma, fräscha medier på sidorna av PDMS-stödet.På dag sju, i slutet av experimentet, samla in proverna som beskrivs i manuskriptet. Elektromekaniskt stimuleras hjärt ATDPCs förbättrat sin kardiomyogenic potential. Detta indikerades av realtids-PCR visar ökat uttryck för tidiga och sena hjärt gener specifikt hjärt transkriptionsfaktorn GATA-4, den strukturella markören beta-myosin tung kedja och kalcium relaterade genen Connexin43.Phalloidin färgning mot aktin fibrer visade att majoriteten av celler i linje enligt det vertikala mönstret. Connexin43 distribution var mestadels i cytoplasman, och vid plasmamembranet, bidrar till intracellulära kommunikation genom gap korsningar. MEF2 och GATA-4 transkriptionsfaktorer var belägna vid atomkärnorna i hjärt ATDC.Men GATA-4 upptäcktes inte i subkutana ATDPCs. Cytoplasmatiska markörer SERCA2, och sarcomeric alpha-aktinin, visade inte en mogen sarkomer organisation typiska för kardiomyocyter. Och misshandel observerades inte i kontroll och stimulerade cellpopulationer.En frisk cell monolayer i början av detta protokoll och hålla sterilitet under hela förfarandet är avgörande. Efter provsamling kan standard-proteinuttryckstekniken för genom utföras. Denna teknik hjälper till att bättre förstå effekten av cell elektriska och / eller mekaniska stimuli.Tills nyligen var det omöjligt att använda samma enhet för både stimulering, vilket gjorde resultaten svårare att jämföra.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Alternating-Current Circuits

SCIENTISTS IN ACTION

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Separera Pärlor och celler i flera kanaler mikroflödessystem enheter Använda Dielectrophoresis och laminär strömning

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Samtidig Syntes av Single vägg kolnanorör och grafen i ett magnetiskt utökad Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering Skelettmuskulatur Vävnader från murinceller myoblast progenitorceller och tillämpning av elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Distinkt kapillärverkan från Micro-kanaler i benliknande mallar kan förbättra Rekrytering av celler för Restaurering av stora Bony Defect

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk kontroll av levande celler elektrisk aktivitet av konjugerade polymerer

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Cardiac Muscle Cell Based Actuator och självstabiliserande Biorobot - DEL 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Cardiac Muscle Cell-baserad Actuator och självstabiliserande Biorobot - Del 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Gel-seq: En metod för samtidig sekvensering bibliotek beredning av DNA och RNA med hjälp av Hydrogel matriser

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Konstruktion och användning av en elektrisk stimulering kammare för att förbättra osteogent differentiering i mesenkymala stamceller/stromaceller In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Självmontering av gammamodifierad peptidnukleinsyror till komplexa nanostrukturer i organiska lösningsmedelsblandningar

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...