Name: detection of protease activity by fluorescent peptide zymography
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography at JoVE.com

يوفر التمويل ولاية أوهايو الدولة جامعة كلية الهندسة وقسم الهندسة الطبية الحيوية، ومركز السرطان الشامل-آرثر ج. جيمس مستشفى السرطان وريتشارد ج. سلف معهد البحوث.

1-إعداد طبقة جل حل
<ol><li>إعداد polyacrylamide 10% من حل حل جل وفقا الجدول 1. إضافة تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) وفوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) مباشرة قبل سكب الهلام كما يبدأ إضافة رد فعل البلمرة.</li>
	<li>ملء كاسيت جل مصغرة فارغة 1.5 مم نصف الطريق (5 مل) مع حل جل حسم 10 في المائة.</li>
	<li>إضافة ط...

<ol>
	<li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes.">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li><li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Gelatinases+(MMP-2+and+MMP-9)+by+Gelatin+Zymography.">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).</li><li>Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+zymography+as+a+sensitive+and+specific+technique+for+the+determination+of+subpicogram+levels+of+interstitial+collagenase.">Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase.</a> Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).</li><li>Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+collagen+zymography+approach+for+evaluating+the+collagenases+MMP-1,+MMP-8,+and+MMP-13.">An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13.</a> BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).</li><li>Perera, H. K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Aspartic+Proteinase+Activities+Using+Gel+Zymography.">Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography.</a> Zymography. , 43-52 (2017).</li><li>van Beurden, P. A. M. S. n. o. e. k. -., Vonden Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).</li><li>Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymography,+Casein+Zymography,+and+Reverse+Zymography:+Activity+Assays+for+Proteases+and+their+Inhibitors.">Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors.</a> Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , 63-76 (1999).</li><li>Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+proteolytic+activity+by+covalent+tethering+of+fluorogenic+substrates+in+zymogram+gels.">Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels.</a> BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).</li><li>Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+proteolytic+activity+by+fluorescent+zymogram+in-gel+assays.">Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays.</a> BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).</li><li>Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+3D+cellular+microenvironments+using+a+fluorogenic+peptide+substrate.">Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate.</a> Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).</li><li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition.">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li><li>Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymography+as+a+Research+Tool+in+the+Study+of+Matrix+Metalloproteinase+Inhibitors.">Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1626, 79-102 (2017).</li><li>Nagase, H., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+matrix+metalloproteinase+specificity+studies+using+collagen+sequence-based+synthetic+peptide.">Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide.</a> Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).</li><li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1&#8242;+Positions.">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1&#8242; Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li><li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -. L., Gatti, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry.">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li><li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva.">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li><li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases.">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li></ol>

تقنيات زيموجرافيك الحالية تعتمد على إدماج ركائز الأصلية في المواد الهلامية polyacrylamide للكشف عن بروتيوليسيس. بينما حصل هذه التقنيات على استخدامها على نطاق واسع، أنها لا تزال محدودة في عدد البروتياز أنها يمكن الكشف عن. هنا، كان وصف بروتوكول في الببتيدات الفلورسنت، والقابلة للتحلل البروتياز ?...

زيموجرافي هلام تقنية بيولوجية المستخدمة لقياس النشاط proteolytic داخل العينات البيولوجية، مثل سوائل الجسم أو الخلية وسائط الثقافة1،،من23. يتم فصل العينات أوزانها الجزيئية مع التفريد خلال جل polyacrylamide المضمنة مع ركيزة القابلة للتحلل. وتشمل مشتركة الركازات التحلل الجيلاتين، الكازين، الكولاجين والايلاستين، التي استخدمت لقياس نشاط ميتالوبروتيناسيس مصفوفة (يتولى)-1،-2،-3،-7،-8،-9، و-11، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من كاثيبسينس1،2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8-بعد التفريد، الإنزيمات ريناتوريد وسمحت للحط من البروتين داخل الجل. في زيموجرافي هلام التقليدية، الهلام هو ملطخة بصبغة بروتين، مثل أخذ الأزرق، وتم الكشف عن نشاط البروتياز كفقدان إشارة، وعصابات (تحلل البروتين) أي أبيض على خلفية زرقاء داكنة.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لطريقة بديلة لجل زيموجرافي، الذي الركيزة القابلة للتحلل قصيرة، الببتيد فلوروجينيك تساهمي أدرجت في جل polyacrylamide (الشكل 1). الاستعاضة عن الببتيدات الاصطناعية كركائز للتحلل تمكن من كشف مجموعة أوسع نطاقا من البروتياز بالمقارنة مع زيموجرافي هلام التقليدية مع البروتينات الأصلية9. الروابط التساهمية من الببتيد فلوروجينيك يمنع نشر الببتيد والهجرة أثناء التفريد جل لاحظ مع الأساليب السابقة9،10. علاوة على ذلك، يمكن استخدام الركيزة فلوروجينيك الكشف المباشر لنشاط البروتياز دون تلطيخ إضافية وخطوات إزالة المصبوغة. والهدف العام لهذا الأسلوب هو الكشف عن نشاط البروتياز في العينات البيولوجية عن طريق إدماج الببتيدات فلوروجينيك في الهلام زيموجرام التساهمية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mm Empty Gel Cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x Zymography Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>087721B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammounium Persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-PEG3-Maleimide Kit</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP510100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N N N&#39; N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Hypodermic Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Flask (100 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-873-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septum Rubber Stopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-872-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochlroide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 Molecular Imager</td>
			<td>GE Amersham</td>
			<td>8149-30-9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protease activity by fluorescent peptide zymography

والغرض من هذا الأسلوب لقياس النشاط proteolytic العينات البيولوجية المعقدة. يتم فصل العينات بالوزن الجزيئي باستخدام التفريد من خلال حل جل المضمنة مع ركيزة القابلة للتحلل. يختلف هذا الأسلوب عن زيموجرافي هلام التقليدية في ببتيد فلوروجينيك مروي تساهمي أدمجت في جل حل بدلاً من كامل طول البروتينات، مثل الجيلاتين أو الكازين. استخدام الببتيدات فلوروجينيك تمكن من كشف مباشرة من نشاط proteolytic دون خطوات إضافية المصبوغة. الإنزيمات في عينات بيولوجية تنشق الببتيد فلوروجينيك مروي، أدى إلى زيادة في الأسفار. إشارة مضيئة في المواد الهلامية ثم تصويرها مع ماسح ضوئي جل فلورسنت قياسية وكمياً باستخدام قياس كثافة. استخدام الببتيدات كالركيزة القابلة للتحلل يوسع إلى حد كبير البروتياز المحتملة القابلة للاكتشاف مع تقنيات زيموجرافيك.

استخدام الطريقة الموصوفة هنا، واثنين من الببتيدات حوزتي التحلل الفلورسنت أدرجت في الهلام polyacrylamide: GGPQG↓IWGQK(PEG)2ج (مختصر النحو قجيو في جميع أنحاء النص والأرقام) و GPLA↓CبميوبزلWARK(PEG)2 (ج) (مختصر النحو لاكو طوال النص والأرقام). ↓ يشير إلى الموقع للانقسام. قجيو ه?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography at JoVE.com

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتقنية زيموجرافيك معدلة التي تستخدم الببتيدات فلوري كالركيزة القابلة للتحلل بدلاً من البروتينات الأصلية. التفريد العينات البيولوجية في الببتيد نيون زيموجرامس تمكن من كشف طائفة أوسع من البروتياز تقنيات زيموجرافيك السابقة.

الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

تقنيات zymographic الحالية الكشف عن عدد محدود من proteases. يستخدم التصوير الببتيد الفلوري الببتيدات الفلورية الببتيدات الفلورية كركيزة قابلة للتحلل مما يتيح قياس مجموعة أكبر من البروتياز. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو انها تصميم وحدات.تسلسل الببتيد الفلورسنت يحدد التي يتم الكشف عن البروتياز ويمكن بسهولة أن يتم تبديل الببتيد الفلوري مع الببتيد من تسلسل مختلف، والقدرة على الكشف عن البروتياز الأخرى. يمكن أن تساعد هذه التقنية في إعلام تصميم الببتيدات'use كموارب قابلة للتحلل في المواد الحيوية المهندسة مثل تلك المستخدمة في توصيل الأدوية أو تطبيقات هندسة الأنسجة. ويمكن أن يؤدي إدماج هذا الببتيد في هذه التقنية إلى تحديد البروتيات التي تفرز الأنسجة المسؤولة عن التحلل الحيوي.إن عرض هذه التقنية مهم من أجل تصور النهج متعدد الطبقات الذي هو فريد من نوعه مقارنة مع تقنيات zymography الأخرى. ومن أجل إظهار هذه التقنية، فإن أميا ديشموخ، وهي طالبة دراسات عليا من مختبري. للبدء، إعداد 10٪ polyacrylamide حل هلام حل كما هو موضح في جدول واحد من بروتوكول النص.مباشرة قبل صب الجل، إضافة TEMED و APS. ثم، ملء وفارغة 1.5 ملليمتر ميني هلام كاسيت في منتصف الطريق مع حل هلام حل. إضافة طبقة رقيقة من الايزوبروبانول إلى الجزء العلوي من هلام البولي أكريلاميد لإنتاج هلام مستوى ومنع فقاعات.استخدم محلول بقايا البوليكريلاميد لتتبع تقدم تفاعل البلمرة. عندما يكون البولي أكرريلاميد في الأنبوب قد توطدت تماما رد الفعل هو كامل. في حين أن أول حل هلام طبقة البلمرة، استرداد مجموعة Azido-PEG3-Maleimide من التخزين في 20 درجة مئوية والسماح للمكونات للوصول إلى درجة حرارة الغرفة.ثم، حل مكونات قارورة اثنين في حجم الشركة المصنعة الموصى بها من DMSO. ودوة لمدة 30 ثانية لضمان خلط السوائل بشكل جيد. نقل محتويات قارورة واحدة إلى نظيفة وجافة 100 ملليلتر جولة أسفل قارورة التي تحتوي على شريط ضجة.على الفور إدراج سدادة الحاجز المطاطي مع الحجاب الحاجز الذي يمكن ثقب مع حقنة في فم القارورة. بعد ذلك، أدخل إبر حقنة قياس 18 في الحجاب الحاجز. قم بتوصيل إحدى إبر الحقن بخزان غاز خامل والسماح للغاز بملء قارورة القاع المستديرة لمدة ثلاث دقائق.ثم، أغلق الغاز الخامل وفصله عن الإبرة. باستخدام حقنة، حقن المحتويات الكاملة من قارورة اثنين في قارورة. إزالة كل من الإبر والحقنة.السماح للمكونات لخلط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء التحريك. بعد هذا إزالة سدادة الحاجز المطاطي ونقل محتويات أنبوب جهاز طرد مركزي نظيف خمسة ملليلتر. مرة واحدة أول حل طبقة هلام قد بولمرة صب قبالة طبقة ايزوبروبانول.Pipet ملليلتر واحد من المياه دي المتأينة على رأس الجل ومن ثم صب الماء قبالة لشطف هلام. استرداد الببتيد الفلورسنت ثيول وظيفية من التخزين في 80 درجة مئوية. السماح لها أن تذوب في درجة حرارة الغرفة.إعداد حل هلام حل 10٪ تحتوي على جزيء رابط Azido-PEG3-Maleimide والببتيد الفلورسنت كما هو مبين في جدول واحد من بروتوكول النص. مباشرة قبل صب الجل إضافة TMED و APS. بعد ذلك، تعبئة نصف الجزء المتبقي من الكاسيت هلام مع حل الببتيد هلام حل.إضافة طبقة رقيقة من الايزوبروبانول إلى الجزء العلوي من هلام البولي أكريلاميد لإنتاج هلام مستوى ومنع فقاعات. استخدم محلول بقايا البوليكريلاميد لتتبع تقدم تفاعل البلمرة. بعد اكتمال التفاعل، صب قبالة طبقة ايزوبروبانول.Pipet ملليلتر واحد من المياه دي المتأينة على رأس الجل ومن ثم صب الماء قبالة لشطف هلام. إذا لم يكن استخدام المواد الهلامية على الفور، وتخزينها عن طريق غمرها في مربع من البلاستيك مليئة 100 ملليلتر من 1x PBS في أربع درجات مئوية. التفاف مربع في رقائق الألومنيوم لمنع photobleaching.أولاً، إعداد حل هلام التراص 5٪ كما هو موضح في جدول واحد من بروتوكول النص. مباشرة قبل صب الجل إضافة TMED و APS. املأ الجزء الفارغ المتبقي من الكاسيت الهلامي بمحلول هلام التراص.قم بإدخال مشط هلام 1.5 ملليمتر بسرعة في طبقة هلام التراص مع التأكد من عدم بقاء أي فقاعات محاصرة تحت الآبار. استخدم محلول بقايا البوليكريلاميد لتتبع تقدم تفاعل البلمرة. عندما يكون رد الفعل كاملاً، قم بإزالة المشط والشرائط من الجزء الخلفي من الكاسيت الجل.للبدء، قم بحل العينات في المخزن المؤقت النموذجي التقليدي لـ zymography. إضافة 400 ملليلتر os 1X tris الجليسين SDS تشغيل المخزن المؤقت لجهاز هلام. تحميل ما يصل إلى 35 ميكرولترات من عينة في بئر.تشغيل العينات في 120 فولت في أربع درجات مئوية لمدة ساعة ونصف أو حتى معايير الوزن الجزيئية تشير إلى أن البروتياز من الاهتمام هي ضمن طبقة هلام الببتيد حل. بعد ذلك، قم بإزالة المواد الهلامية من الكاسيت البلاستيكي. غسل المواد الهلامية ثلاث مرات في إعادة naturing العازلة في درجة حرارة الغرفة تحت التحريض لطيف.مع كل غسل، تدوم 10 دقائق. نقل المواد الهلامية إلى محلول التخزين المؤقت المتطور لمدة 15 دقيقة. ثم استبدال الحل مع عازلة النامية الطازجة واحتضان في 37 درجة مئوية تحت التحريض لطيف لمدة 24 ساعة.بعد ذلك، استخدم جهاز تصوير ماسح ضوئي هلامي فلوري مع الإثارة المناسبة ومرشحات الانبعاثات لصورة المواد الهلامية. في هذه الدراسة إلى الببتيدات الفلورية التحلل يتم دمجها في المواد الهلامية البولي أكرريلاميد. QGIW هو الكولاجين واحد مشتق تسلسل مصممة للكشف عن الكولاجين الخلوية، في حين LACW هو التسلسل الذي تم تحسينه للكشف عن MMP-14 و MMP-11.يكشف التصوير الفلوري عن العديد من النطاقات داخل جل الببتيد LACW ، في حين لا يظهر سوى نطاق واحد في المواد الهلامية QGIW. عند مقارنتها بزيموغرافي الجيلاتين، فإن جلات الـ LACW قادرة على اكتشاف نطاقات أكثر بروتوية، مما يدل على قدرة zymography الببتيد على الكشف عن مجموعة أوسع من البروتياز الموجودة داخل العينات البيولوجية من الطرق التقليدية باستخدام ركائز أصلية. ثم يتم احتضان خلايا zymography الببتيد في عازلة التنمية التي تحتوي إما GM6001، وهو مثبط MMP الطيف الواسع، أو E64، وهو مثبط cathepsin العام.علاج المواد الهلامية الببتيد LACW مع GM6001، يقلل من شدة العصابات. في حين أن العلاج مع E64 ليس له تأثير ملحوظ. ينتج عن علاج المواد الهلامية الببتيد QGIQ مع GM6001 الاستئصال الكامل للعصابات التي شوهدت سابقًا.في حين أن E64 ليس له أي تأثير. يتم إجراء zymography الجيلاتين باستخدام تنقية، تنشيط MMP-9 لمقارنة حساسية zymography الببتيد إلى معيار الذهب الحالي. المواد الهلامية LACW قادرة على الكشف عن أصغر تركيزات MMP-9.تتطلب البروتياسات شروطًا محددة لإعادة الطبيعة وتصبح نشطة. إعداد حلول المخزن المؤقت بعناية لضمان أن التكوين و PH صحيحة. ويمكن استكمال هذه الطريقة بتقنيات قائمة للتحقق من الهوية وإجراء مزيد من التحليل للبروتياتيات المقاسة.وهذا يشمل غرب النشاف، PCR في الوقت الحقيقي، وقياس الطيف الشامل. كن حذرا عند التعامل مع البولي أكريلاميد. ويعتبر حل غير اقوياء العصبية وينبغي دائماً ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل معها.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

فلوري مثلي نموذج الفأر من سرطان البنكرياس

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

في المختبر التصوير والكمي لاستهداف الكفاءة المخدرات من النظائر نره Fluorescently إعتبر

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

الكشف عن متغير CDH1 نسخة نادرة في الأنسجة المجمدة الطازجة سرطان المعدة ببكر الرقمية المستندة إلى شرائح

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

الكشف عن حساسية عالية من ميكروميتاستاسيس المتولدة عن التجارة والنقل ترانسدوسيد لينتيفيروس أورجانويدس مثقف من ورم القولون المستمدة من المريض

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

التقوية لكفاءة جسم السرطان بالعقاقير أنتينيوبلاستيك: الكشف عن التآزر جسم-المخدرات باستخدام معادلة الجمع بين مؤشر

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

تقييم مخاطر الإصابة بسرطان القولون والمستقيم وانتشاره عن طريق الكشف عن سلامة الحمض النووي البراز

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

الكشف عن نشاط الرجعية من الخط الساخن-1S من قبل لمسافات طويلة معكوس PCR

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

الكشف عن الانصهار الجيني الأنسيوجيني باستخدام تفاعل سلسلة بوليميراز متعددة المضاعفات متبوعاً بتسلسل الجيل التالي

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

الكشف عن تطور ورم الرئة في الفئران عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

التصوير المتزامن والكشف القائم على قياس التدفق الخلوي لعلامات الشيخوخة الفلورية المتعددة في الخلايا السرطانية الشائخة الناجمة عن العلاج

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...