Name: detection of protease activity by fluorescent peptide zymography
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography at JoVE.com

Financiering verstrekt door The Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering afdeling en de uitgebreide Cancer Center - Arthur G. James kanker ziekenhuis en Richard J. Solove Research Institute.

1. bereiding van de oplossing laag van Gel
<ol><li>Voorbereiden van een 10%-polyacrylamide oplossen van gel oplossing volgens tabel 1. Voeg de Tetramethylethylenediamine (TEMED) en Ammonium Persulfate (APS) onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert.</li>
	<li>Vul een lege 1,5 mm mini gel cassette halverwege (5 mL) met de 10%-oplossing voor oplossen gel.</li>
	<li>Een dun laagje van isopropanol (~ 500 µL) toevoegen aan de bovenkant van het polyacrylam...

<ol>
	<li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes.">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li><li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Gelatinases+(MMP-2+and+MMP-9)+by+Gelatin+Zymography.">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).</li><li>Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+zymography+as+a+sensitive+and+specific+technique+for+the+determination+of+subpicogram+levels+of+interstitial+collagenase.">Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase.</a> Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).</li><li>Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+collagen+zymography+approach+for+evaluating+the+collagenases+MMP-1,+MMP-8,+and+MMP-13.">An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13.</a> BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).</li><li>Perera, H. K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Aspartic+Proteinase+Activities+Using+Gel+Zymography.">Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography.</a> Zymography. , 43-52 (2017).</li><li>van Beurden, P. A. M. S. n. o. e. k. -., Vonden Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).</li><li>Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymography,+Casein+Zymography,+and+Reverse+Zymography:+Activity+Assays+for+Proteases+and+their+Inhibitors.">Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors.</a> Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , 63-76 (1999).</li><li>Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+proteolytic+activity+by+covalent+tethering+of+fluorogenic+substrates+in+zymogram+gels.">Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels.</a> BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).</li><li>Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+proteolytic+activity+by+fluorescent+zymogram+in-gel+assays.">Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays.</a> BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).</li><li>Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+3D+cellular+microenvironments+using+a+fluorogenic+peptide+substrate.">Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate.</a> Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).</li><li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition.">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li><li>Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymography+as+a+Research+Tool+in+the+Study+of+Matrix+Metalloproteinase+Inhibitors.">Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1626, 79-102 (2017).</li><li>Nagase, H., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+matrix+metalloproteinase+specificity+studies+using+collagen+sequence-based+synthetic+peptide.">Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide.</a> Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).</li><li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1&#8242;+Positions.">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1&#8242; Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li><li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -. L., Gatti, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry.">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li><li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva.">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li><li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases.">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li></ol>

Huidige zymographic technieken, is afhankelijk van de opneming van een native substraten in polyacrylamide gels voor de detectie van proteolyse. Terwijl deze technieken hebt opgeslaen wijdverbreide gebruik, zijn ze nog steeds beperkt in het aantal proteasen die ze kunnen detecteren. Hier werd een protocol beschreven in welke TL, protease-afbreekbaar peptiden zijn opgenomen in de polyacrylamide oplossen van gel. Covalente koppelen met behulp van een azido-PEG3-maleimide linker molecuul in staat stelt de scheiding en opspo...

Gel zymography is een biologische techniek voor het meten van proteolytic activiteit binnen biologische monsters, zoals lichaamsvloeistoffen of cel voedingsbodems1,2,3. De monsters worden gescheiden door hun molecuulgewicht met elektroforese via een polyacrylamidegel ingebed met een afbreekbare substraat. Gemeenschappelijke afbreekbaar substraten omvatten gelatine, caseïne, collageen en elastine, die zijn gebruikt voor het meten van de activiteit van matrix metalloproteinasen (MMP) -1 -2, -3, -7, -8, -9, en -11, naast een verscheidenheid van cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. na elektroforese, de enzymen zijn renatured en toegestaan te degraderen de eiwit binnen de gel. In traditionele gel zymography, de gel is gekleurd met een eiwit kleurstof, zoals Coomassie Blue, en protease-activiteit wordt gedetecteerd als een verlies van signaal, dat wil zeggen, witte banden (afbraak van eiwitten) op een donker blauwe achtergrond.
Hier beschrijven we een protocol voor een alternatieve methode van gel zymography, waarin het afbreekbaar substraat een korte, fluorogenic peptide covalent opgenomen in het polyacrylamidegel (Figuur 1 is). De vervanging van synthetische peptides als de afbreekbaar substraten maakt detectie van een breder scala van proteasen in vergelijking met traditionele gel zymography met inheemse proteïnen9. Covalente koppeling van de fluorogenic peptide verhindert diffusie van peptide en migratie tijdens gelelektroforese waargenomen met vorige methoden9,10. Het gebruik van een substraat fluorogenic maakt bovendien direct opsporen van protease-activiteit zonder extra kleuring en -kleuring stappen. Het algemene doel van deze methode is het opsporen van protease-activiteit in biologische monsters via de covalente opneming van fluorogenic peptiden in zymogram gels.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mm Empty Gel Cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x Zymography Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>087721B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammounium Persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-PEG3-Maleimide Kit</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP510100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N N N&#39; N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Hypodermic Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Flask (100 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-873-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septum Rubber Stopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-872-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochlroide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 Molecular Imager</td>
			<td>GE Amersham</td>
			<td>8149-30-9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protease activity by fluorescent peptide zymography

Het doel van deze methode is voor het meten van de proteolytic activiteit van complexe biologische monsters. De monsters worden gescheiden door molecuulgewicht met behulp van elektroforese via een oplossen gel ingebed met een afbreekbare substraat. Deze methode verschilt van de traditionele gel zymography daarin een gehard fluorogenic peptide covalent is opgenomen in het oplossen gel in plaats van volledige lengte eiwitten, zoals gelatine of caseïne. Gebruik van de fluorogenic peptiden kan directe detectie van proteolytic activiteit zonder extra kleuring stappen. Enzymen in de biologische monsters klieven de gehard fluorogenic peptide, resulterend in een verhoging in fluorescentie. De fluorescerende signaal in de gels is dan beeld met een standaard TL gel scanner en gekwantificeerd aan de hand van densitometrie. Het gebruik van peptiden als het afbreekbaar substraat sterk breidt de mogelijke proteasen aantoonbaar met zymographic technieken.

Met behulp van de methode beschreven hier, twee fluorescerende protease-afbreekbaar peptiden werden ingelijfd bij polyacrylamide gels: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (afgekort als QGIW in de gehele tekst en cijfers) en GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (afgekort als LACW in de gehele tekst en cijfers). ↓ geeft aan de site van decollete. QGIW is een collageen-ik afgeleid reeks ontworpen voor het opsporen van cellulaire collagenases14. LACW is een ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography at JoVE.com

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een gewijzigde zymographic techniek waarin fluorescerende peptides worden gebruikt als het afbreekbaar substraat in plaats van de inheemse proteïnen. Elektroforese van biologische monsters in fluorescerende peptide zymograms maakt detectie van een breder scala van proteasen dan vorige zymographic technieken.

Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Huidige zymografische technieken detecteren een beperkt aantal proteasen. Fluorescerende peptide zymografie maakt gebruik van fluorescerende peptiden als het afbreekbare substraat dat het meten van een groter bereik van proteasen mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze methode is het modulaire ontwerp.De volgorde van het fluorescerende peptide bepaalt welke proteasen worden gedetecteerd en het fluorescerende peptide kan gemakkelijk worden verwisseld met een peptide van een andere sequentie, een vermogen om andere proteasen te detecteren. Deze techniek kan helpen bij het ontwerp van peptiden's gebruik als afbreekbare cross-linkers in gemanipuleerde biomaterialen zoals die worden gebruikt voor de levering van geneesmiddelen of weefsel engineering toepassingen. Integratie van dit peptide in deze techniek kan weefsel gedetgeheimde proteasen identificeren die verantwoordelijk zijn voor biomateriële afbraak.Demonstratie van deze techniek is belangrijk om de meerlaagse aanpak te visualiseren die uniek is in vergelijking met andere zymografietechnieken. Het aantonen van deze techniek zal zijn, Ameya Deshmukh, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om te beginnen, bereid een 10%polyacrylamide oplossen gel oplossing zoals beschreven in tabel een van de tekst protocol.Voeg onmiddellijk voor het gieten van de gel de TEMED en APS toe. Vul vervolgens halverwege de 1,5 millimeter minigelcassette met de oplossende geloplossing. Voeg een dun laagje isopropanol toe aan de bovenkant van de polyacrylamidegel om een levelgel te produceren en bubbels te voorkomen.Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing om de voortgang van de polymerisatiereactie bij te houden. Wanneer de polyacrylamide in de buis volledig gestold is, is de reactie compleet. Terwijl de eerste oplossende gellaag polymeriseert, haalt u de Azido-PEG3-Maleimide-kit uit de opslag bij 20 graden Celsius en laat u de componenten op kamertemperatuur komen.Los vervolgens de componenten van flacon twee op in het aanbevolen volume van DMSO van de fabrikant. En vortex voor 30 seconden om ervoor te zorgen dat de vloeistoffen goed gemengd zijn. Breng de inhoud van flacon een in een schone, droge 100 millileter ronde bodemkolf die een roerstaaf bevat.Steek onmiddellijk een rubberen septumstopper met een diafragma dat met een spuit in de mond van de kolf kan worden doorboord. Steek vervolgens twee 18-gauge spuitnaalden in het middenrif. Sluit een van de spuitnaalden aan op een inerte gastank en laat het gas de ronde bodemkolf gedurende drie minuten vullen.Sluit vervolgens het inerte gas af en maak het los van de naald. Met behulp van een spuit, injecteer de volledige inhoud van flacon twee in de kolf. Verwijder zowel de naalden als de spuit.Laat de componenten 30 minuten mengen bij kamertemperatuur tijdens het roeren. Verwijder hierna de rubberen septumstopper en breng de inhoud over naar een schone vijf milliliter centrifugebuis. Zodra de eerste oplossende gellaag heeft gepolymeriseerd giet de isopropanol laag.Pipet een milliliter gedeïoniseerd water op de top van de gel en giet het water af om de gel te spoelen. Haal de thiol gefunctionaliseerde fluorescerende peptide uit de opslag op 80 graden Celsius. Laat het ontdooien bij kamertemperatuur.Bereid een 10%resolving gel oplossing met de Azido-PEG3-Maleimide linker molecuul en de fluorescerende peptide zoals beschreven in tabel een van de tekst protocol. Voeg onmiddellijk voor het gieten van de gel de TMED en APS toe. Vul vervolgens de helft van het resterende gedeelte van de gelcassette met de peptide resolving gel oplossing.Voeg een dun laagje isopropanol toe aan de bovenkant van de polyacrylamidegel om een levelgel te produceren en bubbels te voorkomen. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing om de voortgang van de polymerisatiereactie bij te houden. Nadat de reactie is voltooid, giet de isopropanollaag af.Pipet een milliliter gedeïoniseerd water op de top van de gel en giet het water af om de gel te spoelen. Als u de gels niet onmiddellijk gebruikt, bewaar ze dan door ze onder te dompelen in een plastic doos gevuld met 100 milliliter 1x PBS bij vier graden Celsius. Wikkel de doos in aluminiumfolie om fotobleaching te voorkomen.Bereid eerst een stapelgeloplossing van 5% voor, zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol. Voeg onmiddellijk voor het gieten van de gel de TMED en APS toe. Vul het resterende lege gedeelte van de gelcassette met de stapelgeloplossing.Steek snel een 1,5 millimeter gelkam in de stapelen gel laag ervoor te zorgen dat er geen bubbels blijven gevangen onder de putten. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing om de voortgang van de polymerisatiereactie bij te houden. Wanneer de reactie is voltooid, verwijder dan voorzichtig de kam en de tape van de achterkant van de gelcassette.Los om te beginnen monsters op in conventionele zymografiemonsterbuffer. Voeg 400 milliliter besturingssysteem 1X tris glycene SDS running buffer toe aan het gel apparaat. Laad tot 35 microliter monster per put.Voer de monsters op 120 volt op vier graden Celsius gedurende anderhalf uur of totdat de moleculaire gewicht normen geven aan dat de proteases van belang zijn binnen de peptide-oplossende gel laag. Verwijder hierna de gels uit de plastic cassette. Was de gels drie keer in een herbenaringende buffer bij kamertemperatuur onder zachte agitatie.Bij elke wasbeurt van 10 minuten. Breng gels gedurende 15 minuten over naar een ontwikkelende bufferoplossing. Vervang vervolgens de oplossing door verse ontwikkelende buffer en incubeer bij 37 graden Celsius onder zachte agitatie gedurende 24 uur.Gebruik hierna een fluorescerende gelscanner imager met de juiste excitatie- en emissiefilters om de gels in beeld te brengen. In deze studie naar fluorescerende protease afbreekbare peptiden zijn opgenomen in polyacrylamide gels. QGIW is een collageen een afgeleide sequentie ontworpen om cellulaire collagenesis te detecteren, terwijl LACW is een sequentie die is geoptimaliseerd voor de detectie van MMP-14 en MMP-11.Fluorescerende beeldvorming onthult tal van banden binnen de LACW peptide gels, Terwijl slechts een enkele band wordt gezien in de QGIW gels. In vergelijking met gelatinezymografie zijn LACW-gels in staat om meer proteolytische banden te detecteren, wat het vermogen van peptide zymografie aantoont om een breder scala aan proteasen te detecteren die aanwezig zijn in biologische monsters dan traditionele methoden met behulp van inheemse substraten. Peptide zymografie cellen worden vervolgens geïncubeerd in de ontwikkeling buffer met ofwel GM6001, een breed spectrum MMP-remmer, of E64, een algemene cathepsin remmer.Behandeling van de LACW peptide gels met GM6001, vermindert de intensiteit van de banden. Terwijl de behandeling met E64 geen waarneembaar effect heeft. Behandeling van de QGIQ peptide gels met GM6001 resulteert in volledige ablatie van de eerder vertoonde banden.Terwijl E64 geen effect heeft. Gelatine zymografie wordt uitgevoerd met behulp van gezuiverde, geactiveerde MMP-9 om de gevoeligheid van peptide zymografie te vergelijken met de huidige gouden standaard. LACW gels zijn in staat om de kleinste concentraties MMP-9 te detecteren.Proteases vereisen specifieke voorwaarden om de natuur te herstellen en geactiveerd te worden. Bereid de bufferoplossingen zorgvuldig voor om ervoor te zorgen dat de samenstelling en PH correct zijn. Deze methode kan worden aangevuld met bestaande technieken om de identiteit te verifiëren en verdere analyse van de gemeten proteasen uit te voeren.Dit omvat westerse blotting, real-time PCR, en massaspectrometrie. Wees voorzichtig bij het hanteren van polyacrylamide. Ongepolymeriseerde oplossing wordt beschouwd als een krachtige neurotoxine en passende persoonlijke beschermingsmiddelen moeten altijd worden gedragen bij de behandeling ervan.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescerende orthotope Muis Model van pancreaskanker

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging en kwantificering van de Drug Targeting Efficiency van fluorescent gelabelde GnRH analogen

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detectie van een CDH1 zeldzame Transcript Variant in vers bevroren maagkanker weefsels door Chip gebaseerde digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiëring van antikanker antilichaam werkzaamheid door Antineoplastische Drugs: detectie van antilichaam-drug synergie met de combinatie Index vergelijking

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

Detectie van de Retrotransponerings activiteit van Hot LINE-1S door de lange afstand inverse PCR

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Oncogene Genfusie detectie met behulp van verankerde multiplex polymerase kettingreactie gevolgd door sequenties van de volgende generatie

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Detectie van longtumorprogressie bij muizen door echografie

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...