Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

يشكر المؤلفون الدكتور جيل مور لتزويد الخلايا Sw.71. أيد هذا البحث "جائزة ألبرت مكيرن الباحث" إلى جنوب غرب

1-إعداد الخلية
<ol><li>الحفاظ على الخلايا في قوارير T-75 في وسائط النمو القياسي في 5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95%. ملاحظة: كانت الخلايا المستخدمة في هذه التجارب مخلدة خطوط الخلية تروفوبلست الاثلوث الأول Swan.71 (Sw.71) و9،HTR-8/سفنيو10. واستمرت الخلايا Sw.71 في ?...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+implantation+and+placentation:+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications.">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li><li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia.">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li><li>Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion.">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li><li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#x3b1;-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8/SVneo+Trophoblast+Cells.">TNF&#x3b1;-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li><li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion.">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li><li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+(MMP)-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy.">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li><li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line,+Swan+71.">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li><li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan.">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71.">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).</li><li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

ويستند هذا الإجراء استخدام الهجرة وغزو فحوصات تشمل معدل انتشار الخلايا كأحد مساهمين المحتملين لقياس الاختلافات في حركة الخلية تروفوبلست. تستخدم معا، هذه فحوصات في المختبر هي الطرق البسيطة والفعالة التي يمكن استخدامها لتحديد المسارات الخلوية التي تنظم الهجرة تروفوبلست. كما هو موضح أعلا?...

التنمية المشيمة خطوة حاسمة في وضع الحمل، والتي تؤثر على صحة الأم والجنين على حد سواء. ومع ذلك، لم يتم فهم أساس الميكانيكية التي تحدث هذه العملية تماما. الهجرة الخلية هو عملية بيولوجية هامة أن يسهم في تأسيس ووظائف المشيمة أثناء الحمل. بعد انغراس الكيسة، يميز تروفيكتوديرم trophoblasts فيلوس، التي تغطي سطح الزوائد المشيمية ويشاركون في الغاز وتبادل المغذيات، وتروفوبلاستس اكسترافيلوس (افتس)، التي تهاجر خارجاً من الزوائد وتقتحم أوروبية والمفرج الأمهات1. هجرة افتس أمر ضروري لإعادة عرض الشرايين لولبية الأمهات وإقامة الدورة الدموية أوتيروبلاسينتال لدعم نمو الجنين2. غزو تروفوبلست غير كافية أثناء الحمل يؤدي إلى وضع المشيمة غير طبيعي وقد تسهم في مضاعفات الحمل مثل بريكلامبسيا ارتفاع ضغط الدم الحملي، وتقييد النمو داخل الرحم والولادة قبل الأوان3، 4. ولذلك، فهم العوامل التي تؤثر في حركية تروفوبلست ضروري لتحديد المسارات المطلوبة من أجل بلاسينتيشن العادية.
ويسيطر الهجرة تروفوبلست شبكة معقدة من إشارات الجزيئات، بما في ذلك عوامل النمو، السيتوكينات والهرمونات و عوامل الأوعية5. بسبب قيود الدراسة المجراة في المشيمة، خلد في المختبر فحوصات استخدام الخلايا البشرية تروفوبلست خطوط كانت حاسمة لتحديد العوامل التي تساهم في حركية تروفوبلست. وقد استخدمت فحوصات الصفر وغزو على نطاق واسع تقييم كمي دور الجزيئات الفردية على تروفوبلست خلية الهجرة6،،من78. ومع ذلك، كانت مفيدة في جنبا إلى جنب للتحقيق في كيفية التغييرات في الهجرة قد يكون سبب تغييرات في الخلية اختزاع، لا تراعي هذه الاختبارات اثنين إضافية من الآليات التي قد تساهم في تغيير معدلات الهجرة الخلية. على سبيل المثال، قد يؤدي تخفيض معدل انتشار الخلايا خلايا أقل المتاحة للهجرة.
هنا، يمكننا وصف الأساليب الكمية في المختبر لتقييم الهجرة تروفوبلست استخدام الصفر، وتكاثر الخلايا، وفحوصات غزو الخلية. في مقايسة الصفر، جرح موحدة يتم إنشاؤه في أحادي الطبقة خلية، ويقاس هجرة الخلايا إلى سد هذه الفجوة بالتصوير الآلي، والوقت الفاصل بين حجم الجرح وكثافة الخلايا داخل الجرح. تحليل انتشار الخلايا يستند حساب نسبة الخلايا في كل وقت نقطة مقارنة بكمية بداية معروفة من الخلايا. في مقايسة غزو الخلية، الخلايا هي تبذر فوق دائرة لإدراج ثقافة خلية المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية (مثل ترانسويل)، ويتم حساب عدد الخلايا التي تغزو عن طريق المصفوفة خارج الخلية استجابة للعلاج الكيماوي-جاذبة.
والرزن الصفر هو أداة بسيطة وفعالة يمكن استخدامها لتحديد ظروف بيئية مختلفة كيف تؤثر الهجرة الخلية. وبعد ذلك يمكن استخدام فحوصات انتشار وغزو لتحديد مساهمة تكاثر الخلايا واختزاع للتغييرات الشاملة في الهجرة الخلية. مجتمعة، هذه فحوصات توفير قياسات قوية للعمليات البيولوجية التي قد تساهم في حركية الخلية. واستخدمت السطرين خلية مخلدة الاثلوث الأول تروفوبلست في فحوصات وصفت، Swan.71 (Sw.71) و HTR-8/سفنيو9،10. ولكن أيضا يمكن تحسين هذه فحوصات لاستخدامها في أنواع الخلايا الأخرى لتحديد المغيرون الرئيسية الخلية الهجرة والغزو.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

حركة الخلية خاصية حرجة من تروفوبلاستس أثناء وضع المشيمة والحمل المبكر. تتجلى أهمية الهجرة تروفوبلست السليم وغزو اضطرابات الحمل مثل تقييد النمو داخل الرحم، ومقدمات الارتعاج، التي ترتبط بغزو تروفوبلست غير كافية للمفرج الأمهات. ولسوء الحظ، أن فهمنا للآليات التي تتطور المشيمة من ترحيل trophoblasts محدود. تحليل في المختبر للهجرة الخلية عن طريق المقايسة الصفر هو أداة مفيدة لتحديد العوامل التي تنظم تروفوبلست القدرات المهاجرة. إلا أن هذا التحليل وحدها تحدد التغيرات الخلوية التي يمكن أن تؤدي الهجرة الخلية المتغيرة. يصف هذا البروتوكول ثلاث فحوصات في المختبر المختلفة التي تستخدم مجتمعة لتقييم حركة الخلية تروفوبلست: مقايسة الصفر والمقايسة الغزو والمقايسة الانتشار. كما يمكن تعديل البروتوكولات المذكورة هنا لاستخدامها في خطوط الخلايا الأخرى لقياس حركة الخلية في الاستجابة للمحفزات. هذه الطرق تسمح للمحققين تحديد العوامل الفردية التي تسهم في حركة الخلية وتوفير إجراء فحص دقيق للآليات المحتملة الكامنة وراء التغيرات الواضحة في الهجرة الخلية.

واستخدمت خطوط خلية مخلدة تروفوبلست الاثلوث الأول البشرية Sw.71 و HTR-8/سفنيو في هذه التجارب لتحديد دور الكورتيزون في تروفوبلست خلية الهجرة12. واستخدمت الكورتيزون في هذه التجارب كما أنها مؤخرا تبين أن تغيير مهام تروفوبلست، على الرغم من أن العلاجات البديلة يمكن أن...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

نقدم هنا، بروتوكول الوصول للغاية لتقييم حركة الخلية في الخلايا البشرية تروفوبلست باستخدام ثلاثة فحوصات في المختبر: مقايسة الصفر والمقايسة غزو ترانسويل والمقايسة انتشار الخلايا.

في المختبر فحوصات تقييم الهجرة، والغزو، وانتشار خطوط الخلايا مخلدة تروفوبلست البشرية في الاثلوث الأول

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

ويمكن استخدام هذه الطرق لتحديد العوامل التي تؤثر على غزو الترودوبياست التي قد توفر نظرة ثاقبة على النتائج الرئيسية السلبية للولادة. وميزة هذه التقنية هي أنها توفر تحليلا بصريا وكميا لعدة عوامل قد تؤثر على غزو الأرموست بما في ذلك الانتشار والهجرة. لبدء فحص الخدش، بذور العدد المناسب من الخلايا في لوحة 24-جيدا لتحقيق التقاء 100٪في 48 ساعة.في اليوم التالي، تغيير وسائل الإعلام إلى الفينول الأحمر وسائل الإعلام الحرة تكملها الحرارة dextran الفحم المعطل جردت FBS. في يوم الصفر، أضف العلاج المطلوب إلى الوسائط في كل بئر للمعالجة المسبقة للخلايا لمدة 30 دقيقة. لإنشاء الجروح موحدة، مكان عقيمة 10 نصائح ماصة ميكرولتر على دبابيس أداة صانع الجرح.خفض النصائح في الصف الأول من الآبار ونقل لوحة على طول المسار من صانع الجرح حتى نصائح ماصة تصل إلى الجانب الآخر من البئر. ثم نقل لوحة العودة إلى وضعية البداية لضمان جرح مستمر عبر قطر البئر. خفض النصائح في الصف التالي من الآبار وكرر حتى يتم خدش جميع الآبار.تأكد من أن الخدش يغطي عرض البئر من خلال مراقبة اللوحة تحت المجهر. المقبل، بعناية التعرق وسائل الإعلام وغسل بلطف الخلايا مع 1X برنامج تلفزيوني مرتين. بعد غسل النهائي, إضافة مكملات الفينول الأحمر مجانا تجريد أو انخفاض وسائل الإعلام FBS مع العلاج المطلوب.بعد ذلك، ضع اللوحة مع الآبار المخدوشة في صورة وقتية آلية تقع في حاضنة تحتوي على درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو الرطوبة 95٪. صورة الخلايا على فترات منتظمة حسب الحاجة للسماح للخلايا لإكمال التئام الجروح. لبدء اختبار الغزو، بذور العدد المناسب من الخلايا في لوحات ستة آبار في حاضنة الذي يحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي رطوبة 95٪.السماح للخلايا للوصول إلى التقاء 90٪في 48 ساعة. في اليوم التالي، تغيير وسائل الإعلام إلى الفينول الأحمر وسائل الإعلام الحرة تكملها الحرارة dextran الفحم المعطل جردت FBS. وضع قارورة من 10 ملليغرام لكل ملليلتر مصفوفة خارج الخلية في ثلاجة على الجليد والسماح هو ذوبان بين عشية وضحاها.في اليوم التالي ، استخدم نصائح الماصات المبردة لتخفيف 10 ملليغرام لكل ملليلتر من المصفوفة خارج الخلية مع سائل الدم المجاني المجاني للفينول الأحمر إلى تركيز نهائي قدره خمسة ملليغرام لكل ملليلتر. ثم إضافة 100 ملليلتر من المصفوفة خارج الخلية المخففة إلى إدراج المبردة التي تم وضعها في لوحة 24-well المبردة. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية للسماح للمصفوفة لتصلب.لإعداد الخلايا لإجراء فحص الغزو، وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من 1X PBS. ثم الطامح برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولترات من 1x تريبسين EDTA إلى كل بئر. ضع لوحة الستة بئراً في الحاضنة التي تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو الرطوبة 95٪ حتى تنفصل جميع الخلايا عن قاع اللوحة.مرة واحدة قد فصلت الخلايا، إضافة 500 ميكرولترات من سائل الدم الحرة الحمراء الفينول إلى كل بئر من الخلايا التربسينized. ثم نقل 1000 ميكرولترات من الخلايا المنفصلة إلى أنبوبrifuge microcentوس وتدور لمدة خمس دقائق في 400 مرة ز في أربع درجات مئوية. المقبل, التعرق وسائل الإعلام وإعادة تعليق الخلايا في الفينول الأحمر حر مصل وسائل الإعلام الحرة.عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا التلقائي وضبط حجم تعليق الخلية لتركيز نهائي من 0.5 مليون خلية لكل ملليلتر. إضافة 600 ميكرولترات من وسائل الإعلام النمو الكامل إلى كل بئر من لوحة 24-well ووضع إدراج قبل المغلفة في ذلك. ثم إضافة 200 ميكرولترات من الخلايا على رأس كل إدراج الخلايا المغلفة مسبقا لما مجموعه 0.1 مليون خلية.ضع اللوح الذي 24 بئرًا في الحاضنة التي تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو الرطوبة بنسبة 95٪ لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، شفط وسائل الإعلام المتبقية من الغرف العلوية والسفلى دون إزعاج المصفوفة خارج الخلية. ثم إزالة بعناية مصفوفة خارج الخلية والخلايا غير الغازية من الجزء العلوي من إدراج مع مسحة القطن.غسل كل إدراج ثلاث مرات عن طريق إضافة 1X برنامج تلفزيوني إلى كل من الغرف العليا والسفلى من البئر. سبيريت برنامج تلفزيوني بعد كل غسل. لإصلاح الخلايا تعلق على إدراج، ضع إدراج في 100٪ الميثانول الباردة الجليد في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.غسل إدراج ثلاث مرات مع 1X برنامج تلفزيوني وإزالة برنامج تلفزيوني بعد الغسيل النهائي. وصمة عار الخلايا المرفقة إدراج مع 0.2٪ البنفسجي الكريستال في 20٪ الإيثانول لمدة 10 دقيقة. شطف مع الماء غير المؤين ثلاث مرات وpirate المياه غير المؤين بعد الغسيل النهائي.إدراج الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. وأخيرا باستخدام ملقط وشفرة حلاقة، وقطع بعناية الغشاء السفلي من إدراج وجبل على شريحة زجاجية مع الجانب السفلي التي تواجه لأعلى. باستخدام مجهر خفيف مع هدف 20X، الحصول على ما لا يقل عن أربع صور فريدة من الخلايا غزا لكل عينة.لبدء التشايس الانتشار، استخدم عداد الخلايا الآلي لحساب الخلايا التربسينية من القارورة. بذور الخلايا في لوحات ستة آبار في كثافة 0.2 مليون خلية في بئر في وسائل الإعلام القياسية النمو. ثم ضع الخلايا في الحاضنة التي تحافظ على 37 درجة مئوية ودرجة الحرارة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 95٪ جو الرطوبة لمدة أربع ساعات أو حتى الخلايا قد التزمت.المقبل, تغيير وسائل الإعلام إلى الفينول الأحمر وسائل الإعلام الحرة تكمل مع الحرارة تنشيط الفحم dextran جردت FBS والعلاج المطلوب. ضع صفيحة الستة في الحاضنة التي تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو الرطوبة 95٪. ثم استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الطازجة تكمل مع العلاج المطلوب كل 48 ساعة.بعد 24، 48، أو 72 ساعة من العلاج، وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من 1X PBS وإضافة 500 ميكرولترات من تريبسين EDTA إلى كل بئر. ضع لوحة ستة بئر في الحاضنة حتى تنفصل الخلايا عن اللوحة. مرة واحدة الخلايا قد فصلت من لوحة, إضافة 500 ميكرولترات من الفينول الأحمر وسائل الإعلام الحرة تكميلية لتعطيل تريبسين.وأخيرا إضافة خمسة microliters من الخلايا التربسينized إلى خمسة microliters من الأزرق Trypan في أنبوب منفصل ومزيج عن طريق الأنابيب. استخدام عداد خلية تلقائي لحساب الخلايا من كل بئر في مكررة. خلدت الإنسان الثلث الأول trophoblast البجعة.71 تم علاج الخلايا 0، ثماني، و 18 ساعة مع مركبة 1x PBS أو 100 micromolar من ديكساميثازون جليكوكورتيكويد الاصطناعية في الخدش. قياس حجم الجرح وكثافة الجرح في سوان. 71 وHTR-8/SVneo الخلايا المعالجة مع السيارة أو 100 نانومولار ديكس أظهرت أن العلاج ديكس خفض معدل إغلاق الجرح مما يدل على أن الجلوكوكورتيكويدات يمكن أن تمنع هجرة الخلايا.بعد فحص الغزو ، قلل علاج الجلوكوكورتيكويد من غزو الخلايا كما يتضح من انخفاض بنسبة 15٪ في عدد البجعة الغازية. 71 وخلايا HTR-8/SVneo تم علاجها بـ 100 نانومولار ديكس لمدة 24 ساعة مقارنة بالخلايا المعالجة بالمركبات. بعد فحص انتشار الخلايا ، قلل علاج الجلوكوكورتيكويد من انتشار الخلايا كما يشير إلى انخفاض البجعة.71 وخلايا HTR-8/SVneo تعالج بـ 100 من الخلايا النانوية المُعالجة بالخلايا التي تعالج بالمركبات. يمكن استخدام طرق تقييم موت الخلايا بالاقتران مع هذا الإجراء لتحديد ما إذا كان المبرمج أو النخر يساهم في وظائف trophoblast المعدلة. لقد اعتمدنا بشكل فريد استخدام التقنيات القياسية المستخدمة بشكل روتيني في بيولوجيا السرطان لدراسة وظيفة trophoblast.لا توجد مخاطر مرتبطة بهذه الطرق. الاحتياط الوحيد الذي يجب على المشاهدين اتخاذها هو استخدام تقنية عقيمة لثقافة الأنسجة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة إلى خلايا انتقائي تنبيغ الابتدائية دبقية قليلة التغصن السلائف ل<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات تكون الميالين

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

تقييم الأم الأوعية الدموية إعادة عرض أثناء الحمل في الرحم ماوس

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

إنشاء الجينوم تحريره المحفزة الإنسان خطوط الخلايا الجذعية: من استهداف لعزل

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

بدء التمايز في الخلايا متعددة القدرات مخلد أذني السلف

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم مقلص وظيفة الخلايا الجذعية الوسيطة التي خضعت طلائي-الوسيطة الانتقالية

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

الإنسان الأرومة الغاذية الابتدائية خلية ثقافة نموذج لدراسة تأثيرات واقية من الميلاتونين ضد نقص الأكسجة / الناجم عن عودة التأكسج تعطيل

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-ماك دوت بلوت الفحص تحديد مستوى الحمض النووي ميثيلاتيون من تشوندروسيت التفرق<em&gt; في المختبر</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

هندسة أنسجة القرنية: في المختبر نموذجا للتفاعلات Stromal العصب القرنية البشرية

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...