Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

Forfatterne takke Dr. Gil Mor for at give Sw.71 cellerne. Denne forskning blev støttet af en Albert McKern Scholar Award til S.W.

1. celle forberedelse
<ol><li>Vedligeholde celler i T-75 kolber i standard vækst medier ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed. Bemærk: De celler, der bruges i disse eksperimenter var den udødeliggjort første trimester trofoblast celle linjer Swan.71 (Sw.71) og HTR-8/SVneo9,10. Sw.71 cellerne blev opretholdt i DMEM/F-12 suppleret med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS), 1.0 mM natrium pyruvat, 10 mM HEPES, 0,10 m...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+implantation+and+placentation:+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications.">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li><li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia.">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li><li>Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion.">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li><li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#x3b1;-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8/SVneo+Trophoblast+Cells.">TNF&#x3b1;-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li><li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion.">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li><li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+(MMP)-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy.">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li><li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line,+Swan+71.">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li><li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan.">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71.">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).</li><li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

Denne procedure bygger på anvendelse af migration og invasion assays til også at omfatte satsen for celledelingen som en potentiel bidragyder til målte forskelle i trofoblast celle bevægelse. Bruges sammen, er disse in vitro-assays enkle og effektive metoder, der kan bruges til at identificere den cellulære veje, der regulerer trofoblast migration. Som beskrevet ovenfor, kan trofoblast celler behandles med hormoner, cytokiner, vækstfaktorer, eller andre molekyler til at bestemme deres indflydelse på trofoblast bev...

Placenta udvikling er et afgørende skridt i etableringen af graviditet, påvirker både moderens og fostrets sundhed. Men den mekanistiske grundlag, som denne proces sker er ikke fuldt forstået. Celle migration er en vigtig biologisk proces, der bidrager til oprettelsen og funktioner i moderkagen under graviditet. Efter blastocyst implantation, trophectoderm differentierer til villøs trophoblasts, der dækker overfladen af chorion villi, og er involveret i gas og næringsstof exchange og extravillous trophoblasts (EVTs), som vandrer ud fra villi og invadere den maternelle decidua og Vaskulaturen1. Migration af EVTs er afgørende for remodeling maternel spiral arterier og oprettelse af uteroplacental omsætning til støtte for fostrets vækst2. Utilstrækkelig trofoblast invasion under graviditet medfører unormal placenta udvikling og kan bidrage til graviditetskomplikationer såsom preeclampsia, svangerskabsuge hypertension, intra uterin vækst restriktioner og præterm fødsel3, 4. Derfor er forstå de faktorer, der påvirker trofoblast motilitet afgørende for at bestemme de veje, der er nødvendige for normal placentation.
Trofoblast migration er kontrolleret af et komplekst netværk af signalering molekyler, herunder vækstfaktorer, cytokiner, hormoner og angiogene faktorer5. På grund af begrænsninger af at studere moderkagen in vivo, in vitro-assays udnytte udødeliggjort menneskelige trofoblast celle linjer har været afgørende for at identificere faktorer, der bidrager til trofoblast motilitet. Bunden og invasion assays er blevet brugt flittigt til kvantitativt at vurdere rollen af individuelle molekyler på trofoblast celle migration6,7,8. Men nyttige sideløbende at undersøge, hvordan ændringer i migration kan være forårsaget af ændringer i celle invasionsevne, disse to assays skal redegøre for yderligere mekanismer, der kan bidrage til ændrede priser i celle migration. For eksempel, kan reduktioner satsen for celledelingen resultere i færre celler tilgængelige til at migrere.
Her beskriver vi kvantitative in vitro-metoder til vurdering af trofoblast migration ved hjælp af scratch, celleproliferation og celle invasion assays. I scratch analysen et ensartet sår er lavet i en celle éncellelag og migration af celler til at fylde hullet er målt ved automatiseret, time-lapse billeder af sår størrelse og tæthed af celler i såret. Celle spredning analyse er baseret på beregning af forholdet mellem celler på hvert tidspunkt, i forhold til en kendt udgangspunkt mængde af celler. I celle invasion assay, cellerne udsås på toppen af en ekstracellulære matrix-belagt celle kultur Indsæt kammer (f.eks. Transwell), og antallet af celler, der invaderer gennem den ekstracellulære matrix i svar på kemo-attractant tælles.
Scratch-analysen er en enkel og effektiv værktøj, der kan bruges til at bestemme, hvordan forskellige miljøforhold påvirker celle migration. Spredning og invasion assays kan efterfølgende bruges til at bestemme celleproliferation og invasiv overordnede ændringer i celle migration bidrag. Kollektivt, giver disse assays robust målinger af biologiske processer, der kan bidrage til celle motilitet. To udødeliggjort første trimester trofoblast cellelinjer blev brugt i den beskrevne assays, Swan.71 (Sw.71) og HTR-8/SVneo9,10. Disse assays kan dog også være optimeret til brug i andre celletyper til at identificere centrale modulatorer af celle migration og invasion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

Celle bevægelse er en vigtig egenskab for trophoblasts under placenta udvikling og tidligt i graviditeten. Betydningen af ordentlig trofoblast migration og invasion fremgår af graviditet lidelser såsom præeklampsi og intrauterin vækst begrænsning, der er forbundet med utilstrækkelig trofoblast invasion af maternel Vaskulaturen. Desværre er vores forståelse af mekanismerne af hvor moderkagen udvikler fra migrere trophoblasts er begrænset. In vitro-analyse af celle migration via scratch analysen er et nyttigt værktøj til at identificere faktorer, der regulerer trofoblast vandrende kapacitet. Men denne analyse alene ikke definerer de cellulære ændringer, der kan resultere i ændrede celle migration. Denne protokol beskriver tre forskellige in vitro-assays, der bruges kollektivt til at evaluere trofoblast celle bevægelse: scratch analysen, invasion analysen og spredning assay. De protokoller er beskrevet her kan også ændres til brug i andre cellelinjer til at kvantificere celle bevægelse som svar på stimuli. Disse metoder tillade efterforskere at identificere individuelle faktorer, der bidrager til den celle bevægelse og giver en grundig gennemgang af potentielle mekanismer bag tilsyneladende ændringer i celle migration.

Udødeliggjort menneskers første trimester trofoblast cellelinjer Sw.71 og HTR-8/SVneo blev brugt i disse eksperimenter til at bestemme rollen af glukokortikoider i trofoblast celle migration12. Glukokortikoider blev anvendt i disse eksperimenter, som de har for nylig vist at ændre trofoblast funktioner, selv om alternative behandlinger kunne være brugt12. Begge cellelinjer blev behandlet med køretøjet (1 x PBS) eller 100 nM af syntetis...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Vi præsenterer her, en meget tilgængelig protokol for at vurdere den celle bevægelse i menneskelige trofoblast celler ved hjælp af tre in vitro-assays: scratch analysen, transwell invasion analyse og celle spredning assay.

I in vitro-Assays at evaluere Migration, Invasion og spredning af udødeliggjort menneskers første trimester trofoblast cellelinjer

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Disse metoder kan udnyttes til at bestemme faktorer, der påvirker trophoblast invasion, som kan give indsigt i store negative obstetriske resultater. Fordelen ved denne teknik er, at det giver en visuel og kvantitativ analyse af flere faktorer, der kan påvirke trophoblast invasion, herunder spredning og migration. For at begynde bunden assay, frø det passende antal celler i en 24-brønd plade for at opnå 100% sammenløb i 48 timer.Den næste dag, ændre medierne til phenol røde frie medier suppleret med varme inaktiveret trækul dextran strippet FBS. På dagen for bunden, tilføje ønskede behandling til medierne i hver brønd til at forbehandle cellerne i 30 minutter. For at skabe ensartede sår, placere sterile 10 mikroliter pipette tips på benene på såret maker værktøj.Sænk spidserne ind i den første række af brønde og flyt pladen langs såret maker, indtil pipettespidserne nå den anden side af brønden. Flyt derefter pladen tilbage til udgangspositionen for at sikre konstant sår over brøndens diameter. Sænk spidserne ind i den næste række af brønde og gentag indtil alle brønde er ridset.Bekræft, at ridset dækker brøndens bredde ved at observere pladen under et mikroskop. Derefter skal du forsigtigt aspirere mediet og forsigtigt vaske cellerne med 1x PBS to gange. Efter en endelig vask, tilføje suppleret phenol rød fri strippet eller lav FBS medier med en ønsket behandling.Dernæst placere pladen med ridset brønde i en automatiseret timelapse imager anbragt i en kuvøse, der indeholder 37 grader Celsius temperatur og 5% kuldioxid ved 95% fugtighed atmosfære. Billede cellerne med jævne mellemrum efter behov for at tillade celler at fuldføre sårheling. For at begynde invasionen assay, frø det passende antal celler i seks-brønd plader i en kuvøse, der opretholder 37 grader Celsius temperatur og 5% kuldioxid ved 95% fugtighed atmosfære.Tillad celler at nå op på 90 %sammenløb i 48 timer. Den næste dag, ændre medierne til phenol røde frie medier suppleret med varme inaktiveret trækul dextran strippet FBS. Placer et hætteglas på 10 mg pr. milliliter ekstracellulær matrix i et køleskab på is og lad det tø natten over.Dagen efter anvendes kølede pipettespidser til at fortynde 10 mg/milliliter af den ekstracellulære matrix med phenolrødfri serumfrie medier til en endelig koncentration på 5 mg/ml. Derefter tilsættes 100 milliliter af den fortyndede ekstracellulære matrix til kølede skær, der er placeret i den kølede 24-brøndplade. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius for at gøre det muligt for matrixen at hærde.At prep celler til invasionen assay, vaske celler med en milliliter 1x PBS. Derefter aspirere PBS og tilsæt 500 mikroliter af 1x Trypsin EDTA til hver brønd. Placer seks-brønd plade i inkubatoren, som opretholder 37 grader Celsius temperatur og 5% kuldioxid ved 95% luftfugtighed atmosfære, indtil alle celler har løsrevet fra bunden af pladen.Når cellerne er afmonteret, tilsættes 500 mikroliter af phenolrødfri serumfrie medier til hver brønd af trypsiniserede celler. Derefter overføres 1,000 mikroliter af fritliggende celler til et mikrocentrifugerør og drejer ned i fem minutter ved 400 gange g ved fire grader Celsius. Dernæst aspirere medierne og resuspend cellerne i phenol rød fri serum frie medier.Tæl celler ved hjælp af en automatiseret celletæller, og juster cellesuspensionens volumen for en endelig koncentration på 0,5 millioner celler pr. milliliter. Tilføj 600 mikroliter af det komplette vækstmedie til hver brønd af 24-brøndpladen, og placer den forbelagte indsats i den. Derefter tilsættes 200 mikroliter celler oven på hver forbelagt celleindsats til i alt 0,1 millioner celler.Placer 24-brønd plade i inkubatoren, som opretholder 37 grader Celsius temperatur og 5% kuldioxid ved 95% luftfugtighed atmosfære i 24 timer. Efter inkubation natten suges de resterende medier fra de øvre og nedre kamre uden at forstyrre den ekstracellulære matrix. Fjern forsigtigt den ekstracellulære matrix og ikke-invaderede celler fra den øverste del af skær med en vatpind.Vask hver indsats tre gange ved at tilføje 1x PBS til både over- og underkamrene i brønden. Aspirate PBS efter hver vask. For at fastsætte celler fastgjort til skær, placere skær i 100% iskold methanol ved fire grader Celsius i 30 minutter.Der vaskes indsats tre gange med 1x PBS, og PBS fjernes efter den endelige vask. Plet cellerne fastgjort til skær med 0,2% krystal violet i 20% ethanol i 10 minutter. Skyl med deioniseret vand tre gange og aspirere deioniseret vand efter den endelige vask.Lufttørrede skær ved stuetemperatur i en time. Endelig ved hjælp af hændekar og et barberblad, omhyggeligt skære bundmembranen af indsatsen og montere den på et glas dias med den nederste side opad. Ved hjælp af et lysmikroskop med et 20X mål skal du opnå mindst fire unikke billeder af de invaderede celler pr. prøve.For at begynde spredning assay, bruge en automatiseret celle tæller til at tælle trypsinized celler fra kolben. Frø celler i seks-brønd plader på en tæthed på 0,2 millioner celler pr brønd i standard vækstmedier. Derefter placere celler i inkubatoren, som fastholder 37 grader Celsius temperatur og 5% kuldioxid ved 95% luftfugtighed atmosfære i fire timer, eller indtil cellerne har overholdt.Dernæst ændre medierne til phenol røde frie medier suppleret med varme inaktiveret trækul dextran strippet FBS og ønskede behandling. Placer seks-brønd plade i inkubatoren, som opretholder 37 grader Celsius temperatur og 5% kuldioxid ved 95% luftfugtighed atmosfære. Derefter erstatte medierne med de friske medier suppleret med den ønskede behandling hver 48 timer.Efter 24, 48 eller 72 timers behandling vaskes celler med en milliliter 1x PBS og tilsættes 500 mikroliter Trypsin EDTA til hver brønd. Anbring en seks-brønds plade i inkubatoren, indtil cellerne er taget af pladen. Når cellerne er afmonteret fra pladen, tilsættes 500 mikroliter af de supplerede phenolrøde frie medier for at deaktivere Trypsin.Endelig tilføje fem mikroliter af trypsinized celler til fem mikroliter af Trypan Blue i et separat rør og blandes ved pipettering. Brug en automatiseret celletæller til at tælle celler fra hver brønd i dublet. Udødeliggjort menneske første trimester trophoblast Swan.71 celler blev behandlet for nul, otte og 18 timer med køretøjet 1x PBS eller 100 mikromolar af den syntetiske glukokortikoid dexamethason i ridseanalysen. Måling af sårstørrelse og sårtæthed i Svane. 71 og HTR-8/SVneo-celler behandlet med køretøj eller 100 nanomolar dex viste, at dexbehandling reducerede sårlukningen, hvilket indikerer, at glukokortikoider kunne hæmme cellemigration.Efter invasionsanalysen reducerede glukokortikoidebehandling celleinvasiv, hvilket fremgår af en 15% reduktion i antallet af invaderede Swan. 71 og HTR-8/SVneo celler behandlet med 100 nanomolar dex i 24 timer sammenlignet med celler behandlet med køretøj. Efter celleprolifetionsanalysen reducerede glukokortikoidebehandling celleproliferation som indikeret af færre Svane.71 og HTR-8/SVneo celler behandlet med 100 nanomolar dex sammenlignet med celler behandlet med køretøj. Metoder til at evaluere celledød kan anvendes i forbindelse med denne procedure til at afgøre, om apoptose eller nekrose bidrager til ændrede trophoblast funktioner. Vi har entydigt vedtaget brugen af standard teknikker rutinemæssigt anvendes i kræft biologi til studiet af trophoblast funktion.Der er ingen farer forbundet med disse metoder. Den eneste forholdsregel seerne bør tage, er at bruge steril teknik til væv kultur.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Produktion og anvendelse af Lentivirus til selektivt at transducere Primary oligodendrocyt precursorceller for<em&gt; In vitro</em&gt; myelinering Analyser

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Vurdering af Maternal Vascular Remodeling under graviditet i Mus livmoderen

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Etablering af Genome-redigerede human pluripotente stamcellelinjer: Fra Målretning til Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Start af Differentiering i Immortaliserede multipotent Otic progenitorceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Udvikling af et<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til Evaluer kontraktionsfunktion af mesenchvmal-celler der undergik Epithelial-Mesenchymal Overgangseffekter

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Menneskelig Primær trofoblasten Cell Culture Model at studere de beskyttende virkninger af melatonin Against Hypoksi / reoxygenering-induceret Forstyrrelse

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC prikkeblot-analyse, der kvantificerer DNA-methyleringsniveauet for chondrocyt-differentiering<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Hornhindevæv Engineering: En In Vitro Model af den menneskelige hornhinden stromale-nerve interaktioner

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af Drosophila Notch med Trans-ligander og dens hæmning af Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...