Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

De auteurs bedanken Dr Gil Mor voor het verstrekken van de Sw.71 cellen. Dit onderzoek werd gesteund door een Albert McKern Scholar Award naar S.W.

1. cel voorbereiding
<ol><li>Cellen in T-75 kolven in de media van de standaard groei bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid te handhaven. Opmerking: De cellen die worden gebruikt in deze experimenten werden de vereeuwigd eerste-trimester trofoblast cel lijnen Swan.71 (Sw.71) en HTR-8/SVneo9,10. De Sw.71 cellen werden onderhouden in DMEM/F-12 aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 1,0 mM natrium pyruva...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+implantation+and+placentation:+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications.">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li><li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia.">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li><li>Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion.">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li><li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#x3b1;-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8/SVneo+Trophoblast+Cells.">TNF&#x3b1;-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li><li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion.">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li><li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+(MMP)-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy.">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li><li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line,+Swan+71.">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li><li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan.">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71.">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).</li><li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

Deze procedure is gebaseerd op het gebruik van migratie en invasie testen als u wilt opnemen van het tarief van celproliferatie als een potentiële bijdrage aan gemeten verschillen in trofoblast cel beweging. Samen gebruikt, zijn deze in-vitrotests eenvoudige en effectieve methoden die kunnen worden gebruikt voor het identificeren van de cellulaire routes die trofoblast migratie regelen. Zoals hierboven beschreven, kunnen cellen van de trofoblast worden behandeld met hormonen, cytokinen, groeifactoren of andere moleculen...

Placenta ontwikkeling is een cruciale stap in de inrichting van de zwangerschap, zowel in moederlijke en foetale gezondheid beïnvloeden. De mechanistische basis waarmee dit gebeurt is echter niet volledig begrepen. Cel migratie is een belangrijke biologisch proces dat aan de totstandkoming en de functies van de placenta tijdens de zwangerschap bijdraagt. Na de implantatie van de blastocyst onderscheidt de trophectoderm in villous trophoblasts, die betrekking hebben op het oppervlak van de verdikte villi en zijn betrokken bij gas en nutriënten uitwisseling, en extravillous trophoblasts (EVTs), die migreren uit van de villi en de moeders decidua en therapieën1binnen te dringen. Migratie van de EVTs is essentieel voor het remodelleren van maternale spiraal slagaders en tot de oprichting van uteroplacental verkeer ter ondersteuning van de foetale groei2. Onvoldoende trofoblast invasie tijdens de zwangerschap leidt tot een abnormale ontwikkeling van de placenta en kan bijdragen aan zwangerschapscomplicaties zoals gestational hypertensie, pre-eclampsie, intra-uteriene groei beperking en vroeggeboorte3, 4. Inzicht in de factoren die invloed hebben op de beweeglijkheid van de trofoblast is daarom essentieel om het bepalen van de trajecten die nodig zijn voor normale placentation.
Trofoblast migratie wordt gecontroleerd door een complex netwerk van signalering van moleculen, met inbegrip van groeifactoren, cytokines, hormonen en angiogenic factoren5. Als gevolg van de beperkingen van het bestuderen van de placenta in vivo, vereeuwigd in-vitrotests gebruik te maken van menselijke trofoblast cel lijnen cruciaal zijn voor het identificeren van de factoren die aan de beweeglijkheid van de trofoblast bijdragen. Kras en invasie testen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van individuele moleculen trofoblast cel migratie6,7,en8kwantitatief te evalueren. Echter, terwijl nuttig om te onderzoeken hoe veranderingen in migratie kunnen worden veroorzaakt door wijzigingen in cel invasiviteit parallel, deze twee testen geen rekening met aanvullende mechanismen die aan de gewijzigde tarieven van cel migratie bijdragen kunnen. Verlagingen van het tarief van celproliferatie kunnen bijvoorbeeld resulteren in minder cellen beschikbaar zijn om te migreren.
Hier beschrijven we kwantitatieve in-vitro methoden voor de beoordeling van de trofoblast migratie met behulp van kras, celproliferatie, en cel invasie testen. In de scratch assay, een uniforme wond wordt gemaakt in een cel enkelgelaagde en de migratie van de cellen om het gat te vullen wordt gemeten door geautomatiseerde, time-lapse beeldvorming van de grootte van de wond en dichtheid van de cellen binnen de wond. De cel proliferatie bepaling is gebaseerd op de berekening van de verhouding tussen cellen op elk punt van de tijd in vergelijking met een bekende startende hoeveelheid cellen. In de cel invasie assay, cellen worden overgeënt bovenop een extracellulaire matrix beklede cel cultuur invoegen kamer (bijvoorbeeld Transwell) en het aantal cellen die via de extracellulaire matrix in reactie op de chemo-lokstof binnenvallen worden geteld.
De kras assay is een eenvoudige en effectieve tool die kan worden gebruikt om te bepalen hoe de verschillende omgevingsfactoren invloed op cel migratie. De proliferatie en invasie testen kunnen vervolgens worden gebruikt om te bepalen van de bijdrage van celproliferatie en invasiviteit aan algemene veranderingen in cel migratie. Gezamenlijk bieden deze gehaltebepalingen robuuste metingen van biologische processen die tot de beweeglijkheid van de cel bijdragen kunnen. Twee vereeuwigd eerste-trimester trofoblast-cellijnen werden gebruikt in de beschreven tests, de Swan.71 (Sw.71) en de HTR-8/SVneo9,10. Deze tests kunnen echter ook worden geoptimaliseerd voor gebruik in andere celtypen te identificeren van de belangrijkste modulatoren van cel migratie en invasie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

Cel verkeer is een essentiële eigenschap van trophoblasts tijdens de ontwikkeling van de placenta en vroege zwangerschap. Het belang van goede trofoblast migratie en invasie wordt aangetoond door zwangerschap aandoeningen zoals pre-eclampsie en uteriene groei beperking, die verband houden met ontoereikende trofoblast invasie van de maternale therapieën. Helaas, onze inzicht in de mechanismen die de placenta ontwikkelt zich uit het migreren trophoblasts is beperkt. In vitro analyse van cel migratie via de kras assay is een nuttig hulpmiddel bij het identificeren van factoren die trofoblast trekkende capaciteit regelen. Deze bepaling alleen geeft echter geen definitie van de cellulaire veranderingen die leiden een gewijzigde cel migratie tot kunnen. Dit protocol beschrijft drie verschillende in-vitrotests die gezamenlijk worden gebruikt voor het evalueren van de trofoblast cel verkeer: de kras assay, de bepaling van de invasie en de bepaling van de proliferatie. De protocollen die hier beschreven kunnen ook worden aangepast voor gebruik in andere cellijnen te kwantificeren van cel mutatie in reactie op stimuli. Deze methoden kunnen onderzoekers individuele factoren die bijdragen tot de beweging van de cel en zorgen voor een grondig onderzoek van mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan de schijnbare wijzigingen in cel migratie te identificeren.

De cellijnen vereeuwigd menselijke eerste-trimester trofoblast Sw.71 en HTR-8/SVneo werden gebruikt in deze experimenten om de rol van glucocorticoïden in trofoblast cel migratie12. Glucocorticoïden werden gebruikt in deze experimenten, zoals zij onlangs is gebleken te wijzigen van de trofoblast functies, hoewel alternatieve behandelingen gebruikte12zou kunnen zijn. Beide cellijnen werden behandeld met voertuig (1 x PBS) of 100 nM van de s...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Hier presenteren we een zeer toegankelijke protocol voor de evaluatie van de beweging van de cel in menselijke trofoblast cellen met behulp van drie in-vitrotests: de kras assay, de transwell invasie assay en de cel proliferatie assay.

In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Deze methoden kunnen worden gebruikt om factoren te bepalen die de trofoblaste invasie beïnvloeden die inzicht kunnen geven in belangrijke negatieve verloskundige resultaten. Het voordeel van deze techniek is dat het een visuele en kwantitatieve analyse van verschillende factoren die van invloed kunnen zijn trofoblast invasie met inbegrip van proliferatie en migratie. Om te beginnen met de scratch test, zaad het juiste aantal cellen in een 24-well plaat tot 100% samenvloeiing te bereiken in 48 uur.De volgende dag, verander de media in fenol rode vrije media aangevuld met warmte geïnactiveerde houtskool dextran gestript FBS. Op de dag van de kras, voeg de gewenste behandeling aan de media in elke put om de cellen voor te behandelen gedurende 30 minuten. Om uniforme wonden te maken, plaatst u steriele 10 microliter pipettips op de pinnen van het gereedschap van de wondmaker.Laat de uiteinden in de eerste rij putten zakken en beweeg de plaat langs het spoor van de wondmaker totdat de pipettetips de andere kant van de put bereiken. Beweeg de plaat vervolgens terug naar de uitgangspositie om een constante wond over de diameter van de put te garanderen. Laat de tips in de volgende rij putten en herhaal totdat alle putten zijn bekrast.Bevestig dat de kras de breedte van de put bedekt door de plaat onder een microscoop te observeren. Vervolgens, zorgvuldig aspirate de media en voorzichtig wassen van de cellen met 1x PBS tweemaal. Na een laatste wasbeurt, voeg aangevuld fenol roodvrij gestript of laag FBS-media toe met een gewenste behandeling.Plaats vervolgens de plaat met de bekraste putten in een geautomatiseerde timelapse imager gehuisvest in een incubator die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide bevat bij 95% luchtvochtigheid atmosfeer. Beeld de cellen op regelmatige tijdstippen als dat nodig is om cellen in staat te stellen wondgenezing te voltooien. Om te beginnen met de invasie test, zaad het juiste aantal cellen in zes-put platen in een incubator die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide onderhoudt op 95%vochtigheid atmosfeer.Laat cellen 90% samenvloeiing bereiken in 48 uur. De volgende dag, verander de media in fenol rode vrije media aangevuld met warmte geïnactiveerde houtskool dextran gestript FBS. Plaats een flesje van 10 milligram per milliliter extracellulaire matrix in een koelkast op ijs en laat 's nachts ontdooien.De dag erna gebruikt u gekoelde pipettips om 10 milligram per milliliter van de extracellulaire matrix te verdunnen met de fenolrode vrije serumvrije media tot een uiteindelijke concentratie van vijf milligram per milliliter. Voeg vervolgens 100 milliliter van de verdunde extracellulaire matrix toe aan gekoelde wisselplaten die in de gekoelde 24-putplaat zijn geplaatst. Broed de plaat uit op 37 graden Celsius om de matrix te laten uitharden.Om cellen voor te bereiden op de invasietest, was cellen met een milliliter 1x PBS. Dan aspirate de PBS en voeg 500 microliter van 1x Trypsin EDTA aan elke put. Plaats de zes-put plaat in de couveuse die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide op 95% vochtigheid atmosfeer handhaaft totdat alle cellen hebben losgemaakt van de onderkant van de plaat.Zodra de cellen zijn losgemaakt, voeg 500 microliters van de fenol rode vrije serum vrije media aan elke put van de trypsinized cellen. Breng vervolgens 1.000 microliter losse cellen over naar een microcentrifugebuis en spin gedurende vijf minuten naar beneden bij 400 keer g bij vier graden Celsius. Vervolgens, aspirate de media en resuspend de cellen in de fenol rode vrije serum vrije media.Tel cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller en pas het volume van de celsuspensie aan voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 miljoen cellen per milliliter. Voeg 600 microliter van de volledige groeimedia toe aan elke put van de 24-putplaat en plaats de voorgecoate insert erin. Voeg vervolgens 200 microliter cellen toe bovenop elke voorgecoate celinvoegsel voor een totaal van 0,1 miljoen cellen.Plaats de 24-put plaat in de couveuse die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide op 95% luchtvochtigheid atmosfeer gedurende 24 uur onderhoudt. Na nachtelijke incubatie, zuig de resterende media uit de bovenste en onderste kamers zonder verstoring van de extracellulaire matrix. Verwijder vervolgens voorzichtig de extracellulaire matrix en niet-binnengevallen cellen uit het bovenste gedeelte van de wisselplaten met een wattenstaafje.Was elke insert drie keer door het toevoegen van 1x PBS aan zowel de bovenste en onderste kamers van de put. Aspirate PBS na elke wasbeurt. Om cellen aan de wisselplaten te bevestigen, plaatst u de wisselplaten gedurende 30 minuten in 100% ijskoude methanol bij vier graden Celsius.Was het drie keer met 1x PBS en verwijder PBS na de laatste wasbeurt. Bevlek de cellen die aan de wisselplaten zijn bevestigd met 0,2% kristal violet in 20% ethanol gedurende 10 minuten. Spoel met gedeïsized water drie keer en aanzuigen gedeïioniseerd water na de laatste wasbeurt.Luchtdroge inzetstukken bij kamertemperatuur gedurende een uur. Ten slotte met behulp van tangen en een scheermesje, zorgvuldig snijd het onderste membraan van de insert en monteer het op een glazen schuif met de onderkant naar boven. Met behulp van een lichtmicroscoop met een 20X-doelstelling, verkrijg ten minste vier unieke beelden van de binnengevallen cellen per monster.Gebruik om te beginnen met de proliferatietest, een geautomatiseerde celteller om de trypsinized cellen uit de kolf te tellen. Zaadcellen in zes-put platen met een dichtheid van 0,2 miljoen cellen per put in standaard groeimedia. Plaats vervolgens cellen in de couveuse die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide op 95% vochtigheid atmosfeer gedurende vier uur of totdat cellen hebben gehecht.Verander vervolgens de media in fenol rode vrije media aangevuld met warmte geïnactiveerde houtskool dextran gestript FBS en gewenste behandeling. Plaats de zes-put plaat in de couveuse die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide op 95% vochtigheid atmosfeer onderhoudt. Vervang vervolgens de media door de verse media aangevuld met de gewenste behandeling om de 48 uur.Na 24, 48 of 72 uur behandeling, was cellen met een milliliter van 1x PBS en voeg 500 microliter trypsin EDTA aan elke put. Plaats een zes-put plaat in de incubator totdat de cellen zijn losgemaakt van de plaat. Zodra cellen zijn losgemaakt van de plaat, voeg 500 microliters van de aangevulde fenol rode vrije media om Trypsin te deactiveren.Voeg ten slotte vijf microliters van de trypsinized cellen toe aan vijf microliter van Trypan Blue in een aparte buis en meng door pipetting. Gebruik een geautomatiseerde celteller om cellen van elke put in tweevoud te tellen. Vereeuwigd menselijke eerste trimester trophoblast Swan.71 cellen werden behandeld voor nul, acht en 18 uur met voertuig 1x PBS of 100 micromolar van de synthetische glucocorticoïde dexamethason in de scratch test. Meting van de wondgrootte en de wonddichtheid in Swan. 71- en HTR-8/SVneo-cellen die met een voertuig of 100 nanomolar dex zijn behandeld, toonden aan dat de dexbehandeling de wondsluiting verminderde, wat aangeeft dat glucocorticoïden de celmigratie kunnen remmen.Na de invasie test, glucocorticoïde behandeling verminderde cel invasie, zoals blijkt uit een 15%-vermindering van het aantal binnengevallen Swan. 71- en HTR-8/SVneo-cellen die gedurende 24 uur met 100 nanomolar dex zijn behandeld in vergelijking met met voertuigen behandelde cellen. Na de celproliferatietest verminderde de glucocorticoïde behandeling de celproliferatie, zoals aangegeven door minder Zwaan.71- en HTR-8/SVneo-cellen behandeld met 100 nanomolar dex in vergelijking met met voertuigen behandelde cellen. Methoden om celdood te evalueren kunnen worden gebruikt in combinatie met deze procedure om te bepalen of apoptose of necrose bijdragen aan veranderde trofoblastfuncties. We hebben uniek het gebruik van standaard technieken routinematig gebruikt in de kanker biologie voor de studie van trofoblast functie.Er zijn geen gevaren verbonden aan deze methoden. De enige voorzorgsmaatregel die kijkers moeten nemen is het gebruik van steriele techniek voor weefselkweek.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor<em&gt; In Vitro</em&gt; Myelination Testen

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Beoordeling van de moeder Vasculaire Verbouwing tijdens de zwangerschap in de muis Baarmoeder

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiëren Differentiatie in Onsterfelijk Multipotent Otic Progenitor Cellen

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Een 5-m-dot-blot-analyse die het DNA-methyleringsniveau van chondrocytedifferentiatie quantificeert<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Hoornvlies weefselengineering: Een In Vitro Model van de interacties die stromale-zenuwen van het hoornvlies, menselijke

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...