Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

Les auteurs remercient Dr Gil Mor pour fournir les cellules Sw.71. Cette recherche a été financée par une bourse de chercheur de McKern Albert à S.W.

1. préparation de la cellule
<ol><li>Maintenir les cellules dans des flacons de T-75 dans les milieux de croissance standard à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité. Remarque : Les cellules utilisées dans ces expériences étaient l’immortalisé les cellules Trophoblastiques au premier trimestre des lignes Swan.71 (Sw.71) et DB-8/SVneo9,10. Les cellules Sw.71 ont été gardés en DMEM/F-12 additionné de 10 % inactivés p...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

Cette procédure s’appuie sur l’utilisation de la migration et l’invasion des essais afin d’inclure le taux de prolifération cellulaire comme un facteur potentiel de différences mesurées dans le mouvement de cellules Trophoblastiques. Utilisés ensemble, ces essais in vitro sont des méthodes simples et efficaces qui peuvent servir à identifier les voies cellulaires qui régulent la migration de trophoblaste. Comme décrit ci-dessus, cellules Trophoblastiques peuvent être traitées avec des hormones, cytokin...

Développement placentaire est une étape cruciale dans la mise en place de la grossesse, un impact sur la santé maternelle et fœtale. Toutefois, les bases mécanistiques par lesquels ce processus se produit ne sont pas entièrement comprise. La migration cellulaire est un processus biologique important qui contribue à la mise en place et les fonctions du placenta pendant la grossesse. Après l’implantation du blastocyste, le trophectoderme se différencie en villositaire trophoblastes, qui recouvrent la surface des villosités choriales et sont impliqués dans l’échange de nutriments et de gaz, et de trophoblaste extravilleux (tte), qui migrent à partir des villosités et envahissent la caduque et le système vasculaire maternelle1. Migration de la tte est essentielle pour remodelage des artères spirale maternelle et établissant la circulation utéro pour soutenir la croissance foetale2. Invasion du trophoblaste insuffisants pendant la grossesse se traduit par un développement anormal placentaire et peut-être contribuer à des complications de la grossesse comme la pré-éclampsie, hypertension gravidique, restriction de croissance intra-utérine et prématurité3, 4. Comprendre les facteurs qui affectent la motilité trophoblaste est donc essentiel de déterminer les voies nécessaires à placentation normale.
Migration de trophoblaste est contrôlée par un réseau complexe de molécules, y compris les facteurs de croissance, les cytokines, les hormones et de facteurs angiogéniques5de signalisation. En raison des limitations de l’étude du placenta in vivo, essais in vitro utilisant immortalisé les cellules Trophoblastiques humaines lignes ont été essentielles pour identifier les facteurs qui contribuent à la motilité de trophoblaste. Essais sur zéro et invasion ont été utilisés intensivement pour évaluer quantitativement le rôle des molécules individuelles sur trophoblaste cell migration6,7,8. Cependant, bien qu’utiles en tandem pour étudier comment des changements dans la migration peuvent être causés par des changements dans envahissant de la cellule, ces deux tests ne tiennent pas compte des mécanismes supplémentaires qui peuvent contribuer à des taux altérés de la migration cellulaire. Par exemple, des réductions du taux de prolifération cellulaire peuvent entraîner moins de cellules disponibles à migrer.
Nous décrivons ici les méthodes in vitro quantitatives pour l’évaluation de migration de trophoblaste à l’aide de scratch, prolifération cellulaire et analyses d’invasion cellulaire. Dans l’essai de gratter, une plaie uniforme est créée dans une monocouche de cellules, et la migration des cellules pour combler le vide est mesurée par imagerie automatisée, time-lapse de la taille de la plaie et la densité des cellules au sein de la plaie. Le test de prolifération cellulaire est basé sur le calcul du ratio de cellules à chaque point dans le temps par rapport à une quantité connue de départ des cellules. Dans l’essai d’invasion cellulaire, les cellules sont ensemencées au sommet d’une chambre d’insertion culture cellulaire d’enduit de matrice extracellulaire (p. ex. Transwell), et le nombre de cellules qui envahissent par le biais de la matrice extracellulaire en réponse à la chimio-attractant est compté.
L’essai de scratch est un outil simple et efficace qui peut être utilisé pour déterminer comment les différentes conditions environnementales affectent la migration cellulaire. Les prolifération et invasion épreuves peuvent par la suite être utilisées pour déterminer la contribution de la prolifération cellulaire et son caractère invasif à l’évolution globale de la migration cellulaire. Collectivement, ces tests fournissent des mesures robustes des processus biologiques qui peuvent contribuer à la motilité cellulaire. Deux lignées de cellules immortalisées trophoblaste au premier trimestre ont été utilisées dans les essais décrits, la Swan.71 (Sw.71) et la HTR-8/SVneo9,10. Toutefois, ces tests peuvent également être optimisés pour dans d’autres types de cellules pour identifier les principaux modulateurs de la migration cellulaire et l’invasion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

Mouvement cellulaire est une propriété essentielle de trophoblastes durant le développement placentaire et début de grossesse. Les troubles de la grossesse tels que la restriction de croissance intra-utérine et de la prééclampsie, qui sont associés à l’invasion du trophoblaste inadéquate du système vasculaire maternelle attestent l’importance de la migration correcte de trophoblaste et invasion. Malheureusement, notre compréhension des mécanismes par lequel le placenta se développe de migrer trophoblaste est limitée. Analyse in vitro de la migration cellulaire via le dosage zéro est un outil utile pour identifier les facteurs qui régissent la capacité migratoire de trophoblaste. Toutefois, ce test seul ne définit pas les modifications cellulaires qui peuvent se traduire par la migration des cellules altérées. Ce protocole décrit trois différents essais in vitro utilisés collectivement pour évaluer le mouvement des cellules Trophoblastiques : le test de gratter, le dosage de l’invasion et le test de prolifération. Protocoles décrits ici peuvent également être modifiées pour utilisation dans les autres lignées de cellules afin de quantifier le mouvement cellulaire en réponse à des stimuli. Ces méthodes permettent d’identifier les facteurs individuels qui contribuent à la circulation de cellules et d’effectuer un examen approfondi des mécanismes éventuels changements apparents dans la migration cellulaire, les enquêteurs.

Les lignées de cellules immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste HTR-8/SVneo et Sw.71 ont été utilisées lors de ces expériences pour déterminer le rôle des glucocorticoïdes dans le trophoblaste cell migration12. Les glucocorticoïdes ont été utilisés dans ces expériences qu’elles ont été récemment montrées d’altérer les fonctions de trophoblaste, même si les traitements alternatifs peuvent être utilisé12</su...

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In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Nous présentons ici un protocole très accessible pour évaluer le mouvement cellulaire dans les cellules Trophoblastiques humaines à l’aide de trois essais in vitro : le test de gratter, le dosage d’invasion de transwell et le test de prolifération cellulaire.

Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Ces méthodes peuvent être utilisées pour déterminer les facteurs qui influencent l’invasion trophoblaste qui peuvent fournir un aperçu des principaux résultats obstétricaux indésirables. L’avantage de cette technique est qu’elle fournit une analyse visuelle et quantitative de plusieurs facteurs qui peuvent influencer l’invasion des trophoblastes, y compris la prolifération et la migration. Pour commencer l’analyse à gratter, ensemencer le nombre approprié de cellules dans une plaque de 24 puits pour atteindre 100% confluence en 48 heures.Le lendemain, changer les médias en phénol rouge médias libres complétés par la chaleur inactivée charbon de bois dextran dépouillé FBS. Le jour de l’égratignure, ajouter le traitement désiré aux médias dans chaque puits pour prétratre les cellules pendant 30 minutes. Pour créer des plaies uniformes, placez des pointes stériles de pipette de 10 microlitres sur les broches de l’outil de fabricant de plaies.Abaissez les pointes dans la première rangée de puits et déplacez la plaque le long de la voie du fabricant de plaies jusqu’à ce que les pointes de pipette atteignent l’autre côté du puits. Déplacez ensuite la plaque vers la position de départ pour assurer une plaie constante sur le diamètre du puits. Abaissez les pointes dans la rangée suivante de puits et répétez jusqu’à ce que tous les puits soient rayés.Confirmez que l’égratignure couvre la largeur du puits en observant la plaque au microscope. Ensuite, aspirez soigneusement le média et lavez doucement les cellules avec 1x PBS deux fois. Après un lavage final, ajouter le phénol complété rouge dénudé ou faible teneur en FBS avec un traitement désiré.Ensuite, placez la plaque avec les puits rayés dans un imageur de timelapse automatisé logé dans un incubateur qui contient 37 degrés Celsius de température et 5% de dioxyde de carbone à 95% d’humidité atmosphère. Imagez les cellules à intervalles réguliers au besoin pour permettre aux cellules d’achever la cicatrisation des plaies. Pour commencer l’analyse d’invasion, ensemencer le nombre approprié de cellules dans des plaques de six puits dans un incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone à 95% d’humidité atmosphérique.Permettre aux cellules d’atteindre 90% de confluence en 48 heures. Le lendemain, changer les médias en phénol rouge médias libres complétés par la chaleur inactivée charbon de bois dextran dépouillé FBS. Placer un flacon de 10 milligrammes par matrice extracellulaire millilitre dans un réfrigérateur sur la glace et laisser décongeler toute la nuit.Le lendemain, utilisez des pointes de pipette réfrigérées pour diluer 10 milligrammes par millilitre de la matrice extracellulaire avec le phénol rouge libre de sérum médias libres à une concentration finale de cinq milligrammes par millilitre. Ajouter ensuite 100 millilitres de matrice extracellulaire diluée aux inserts réfrigérés qui ont été placés dans la plaque réfrigérée de 24 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pour permettre à la matrice de durcir.Pour préparer les cellules pour l’analyse d’invasion, laver les cellules avec un millilitre de 1x PBS. Ensuite, aspirez le PBS et ajouter 500 microlitres de 1x Trypsin EDTA à chaque puits. Placez la plaque de six puits dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans l’atmosphère de 95 % d’humidité jusqu’à ce que toutes les cellules se soient détachées du fond de la plaque.Une fois que les cellules se sont détachées, ajouter 500 microlitres du phénol rouge libre sérum médias libres à chaque puits des cellules trypsinisées. Ensuite, transférez 1000 microlitres de cellules détachées dans un tube de microcentrifugeuse et tournez vers le bas pendant cinq minutes à 400 fois g à quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez les médias et resuspendez les cellules dans le phénol rouge libre sérum médias libres.Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé et ajustez le volume de la suspension cellulaire pour une concentration finale de 0,5 million de cellules par millilitre. Ajouter 600 microlitres du média de croissance complet à chaque puits de la plaque de 24 puits et y placer l’insert pré-enduit. Ajoutez ensuite 200 microlitres de cellules au-dessus de chaque insert cellulaire pré-enduit pour un total de 0,1 million de cellules.Placez la plaque de 24 puits dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 95 % d’humidité pendant 24 heures. Après l’incubation pendant la nuit, aspiration du reste des médias des chambres supérieures et inférieures sans perturber la matrice extracellulaire. Retirez ensuite soigneusement la matrice extracellulaire et les cellules non envahies de la partie supérieure des inserts à l’aide d’un coton-tige.Lavez chaque insert trois fois en ajoutant 1x PBS aux chambres supérieures et inférieures du puits. Aspirer PBS après chaque lavage. Pour fixer les cellules attachées aux inserts, placez les inserts dans du méthanol froid à 100 % glacé à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Lavez les inserts trois fois avec 1x PBS et retirez PBS après le lavage final. Tacher les cellules attachées aux inserts avec 0,2% de violet cristal dans 20% d’éthanol pendant 10 minutes. Rincer à l’eau déionisée trois fois et aspirer l’eau déionisée après le lavage final.Inserts secs à l’air à température ambiante pendant une heure. Enfin à l’aide de forceps et d’une lame de rasoir, couper soigneusement la membrane inférieure de l’insert et le monter sur une glissière de verre avec le côté inférieur face vers le haut. À l’aide d’un microscope léger dont l’objectif est de 20 X, obtenez au moins quatre images uniques des cellules envahies par échantillon.Pour commencer l’analyse de prolifération, utilisez un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules trypsinisées du flacon. Cellules de graine dans des plaques de six puits à une densité de 0,2 million de cellules par puits dans les médias de croissance standard. Placez ensuite les cellules dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 95 % d’humidité pendant quatre heures ou jusqu’à ce que les cellules aient adhéré.Ensuite, changer les médias en phénol rouge médias libres complétés par la chaleur inactivée charbon de bois dextran dépouillé FBS et le traitement désiré. Placez la plaque de six puits dans l’incubateur qui maintient une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 95 % d’humidité atmosphérique. Remplacez ensuite les médias par les médias frais complétés par le traitement désiré toutes les 48 heures.Après 24, 48 ou 72 heures de traitement, laver les cellules avec un millilitre de 1x PBS et ajouter 500 microlitres de Trypsin EDTA à chaque puits. Placer une plaque de six puits dans l’incubateur jusqu’à ce que les cellules se soient détachées de la plaque. Une fois que les cellules se sont détachées de la plaque, ajouter 500 microlitres du phénol supplémentaire rouge médias libres pour désactiver trypsine.Enfin, ajouter cinq microlitres des cellules trypsinisées à cinq microlitres de Trypan Blue dans un tube séparé et mélanger par pipetting. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour compter les cellules de chaque puits en double. Immortalisé humain premier trimestre trophoblast Swan.71 cellules ont été traitées pendant zéro, huit, et 18 heures avec le véhicule 1x PBS ou 100 micromolar de la dexaméthasone glucocorticoid synthétique dans l’essai de éraflure. Mesure de la taille de la plaie et de la densité de la plaie dans Swan. Les cellules 71 et HTR-8/SVneo traitées avec un véhicule ou une dex de 100 nanomolaires ont montré que le traitement par dex réduisait le taux de fermeture des plaies, ce qui indique que les glucocorticoïdes pouvaient inhiber la migration cellulaire.Après l’essai d’invasion, le traitement glucocorticoid a réduit l’envahissement cellulaire comme montré par une réduction de 15% du nombre de cygne envahi. 71 cellules HTR-8/SVneo traitées avec 100 nanomolaires dex pendant 24 heures par rapport aux cellules traitées avec le véhicule. Après l’essai de prolifération cellulaire, le traitement glucocorticoïde a réduit la prolifération cellulaire comme indiqué par moins de cygne.71 cellules HTR-8/SVneo traitées avec 100 nanomolaires dex par rapport aux cellules traitées avec le véhicule. Des méthodes pour évaluer la mort cellulaire pourraient être employées en même temps que cette procédure pour déterminer si l’apoptose ou la nécrose contribuent aux fonctions altérées de trophoblaste. Nous avons adopté de façon unique l’utilisation de techniques standard couramment utilisées en biologie du cancer pour l’étude de la fonction trophoblaste.Il n’y a aucun danger associé à ces méthodes. La seule précaution que les téléspectateurs devraient prendre est d’utiliser une technique stérile pour la culture des tissus.

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A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

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Un dosage de point à 5 mC Quantification du niveau de méthylation d&#39;ADN de la Dedifférenciation des chondrocytes<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Ingénierie du tissu cornéen : Un In Vitro modèle des Interactions stroma-nerf de la cornée humaine

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...