Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
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Die Autoren danken Dr. Gil Mor für die Bereitstellung der Sw.71 Zellen. Diese Forschung wurde durch eine Albert McKern Scholar Award, S.W unterstützt.

1. Zelle-Vorbereitung
<ol><li>Zellen in T-75 Flaschen in standard Wachstumsmedien bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit zu erhalten. Hinweis: In diesen Experimenten verwendeten Zellen wurden die verewigt Ersttrimester-Trophoblast Zellen Linien Swan.71 (Sw.71) und HTR-8/SVneo9,10. Die Sw.71 Zellen wurden in DMEM/F-12 mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 1,0 mM Natrium Pyruvat, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM ni...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+implantation+and+placentation:+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications.">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li><li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia.">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li><li>Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion.">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li><li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#x3b1;-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8/SVneo+Trophoblast+Cells.">TNF&#x3b1;-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li><li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion.">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li><li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+(MMP)-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy.">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li><li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line,+Swan+71.">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li><li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan.">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71.">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).</li><li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

Dieses Verfahren stützt sich auf die Verwendung von Migration und Invasion Assays um die Rate der Zellproliferation als möglicher Beitrag zum gemessenen Unterschiede in der Trophoblast Zellbewegung erweitert. Diese in-vitro-Untersuchungen sind zusammen verwendet werden, einfache und effektive Methoden, die verwendet werden können, um die zelluläre Signalwege zu identifizieren, die Trophoblast Migration zu regulieren. Wie oben beschrieben, können Trophoblast Zellen Hormone, Zytokine, Wachstumsfaktoren oder andere Mol...

Plazentar Entwicklung ist ein entscheidender Schritt bei der Einrichtung der Schwangerschaft Auswirkungen auf die Gesundheit von Müttern und fetalen. Allerdings ist die mechanistische Grundlage, dieser Vorgang wird, nicht vollständig verstanden. Zellmigration ist ein wichtiger biologischer Prozess, der für die Errichtung und die Funktionen der Plazenta während der Schwangerschaft beiträgt. Nach Implantation der Blastozyste unterscheidet die Trophektoderm in Zotten Trophoblasten, die bedecken die Oberfläche der Chorionzotten und Gas- und Nährstoffaustausch beteiligt sind, und extravillous Trophoblasten (EVTs), die heraus von der Zotten migrieren und dringen in die mütterliche Decidua und Gefäßsystem1. Migration von der EVTs ist essentiell für mütterliche Spirale Arterien Umbau und Einrichtung uteroplazentalen Umlauf um fetale Wachstum2zu unterstützen. Unzureichende Trophoblast Invasion während der Schwangerschaft führt zu abnormalen plazentar Entwicklung und kann dazu beitragen, Komplikationen während der Schwangerschaft wie Präeklampsie, Schwangerschafts-Hypertonie, intrauterine Wachstumsretardierung und Frühgeburt3, 4. Daher ist es wichtig zu bestimmen, die Wege für normale Einpflanzung erforderlich, Verständnis der Faktoren, die Trophoblast Motilität zu beeinflussen.
Trophoblast Migration wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalmoleküle, einschließlich angiogenen Faktoren5, Wachstumsfaktoren, Zytokine und Hormone gesteuert. Aufgrund der Einschränkungen des Studiums der Plazenta in-vivo verewigt in-vitro-Untersuchungen mit menschlichen Trophoblast Zellen Linien wurden entscheidend zur Identifizierung von Faktoren, die zu Trophoblast Motilität. Kratzer und Invasion Assays wurden ausgiebig zur quantitativ bewerten die Rolle einzelner Moleküle am Trophoblast Zelle Migration6,7,8. Jedoch während nützlich im Tandem zu untersuchen, wie Änderungen in der Migration durch Änderungen in Zelle Invasivität verursacht werden können, erklären diese beiden Tests nicht zusätzliche Mechanismen, die zu veränderten Zellwanderung beitragen können. Senkung der Rate der Zellproliferation können beispielsweise weniger Zellen zur Migration führen.
Hier beschreiben wir quantitative in-vitro-Methoden zur Bewertung der Trophoblast Migration mit Scratch, Zellproliferation und Zelle Invasion Assays. In der Scratch-Test eine einheitliche Wunde entsteht in einer Zelle monomolekularen Film, und die Wanderung von Zellen, die Lücke durch automatisierte, Time-Lapse Bildgebung der Wunde Größe und Dichte der Zellen in der Wunde gemessen. Die Zelle Verbreitung Assay basiert auf das Verhältnis von Zellen zu jedem Zeitpunkt im Vergleich zu einer bekannten Ausgangspunkt Menge von Zellen berechnen. In der Zelle Invasion Assay Zellen sind auf eine extrazelluläre Matrix-beschichtete Zelle Kultur einfügen Kammer (z.B. Transwell) gesät, und die Anzahl der Zellen, die durch die extrazelluläre Matrix als Reaktion auf die Chemo-Lockstoff eindringen werden gezählt.
Der Scratch-Test ist ein einfaches und effektives Werkzeug, das verwendet wird, um festzustellen, wie die verschiedenen Umweltbedingungen beeinflussen Zellmigration. Die Proliferation und Invasion Assays können anschließend verwendet werden, um den Beitrag der Zellproliferation und Invasivität zu allgemeinen Änderungen in Zelle Migration zu bestimmen. Zusammen bieten diese Assays robuste Messungen der biologischen Prozesse, die zur Zelle Motilität beitragen können. Zwei verewigt Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien wurden im beschriebenen Assays, Swan.71 (Sw.71) und HTR-8/SVneo9,10verwendet. Allerdings können diese Tests auch für den Einsatz in anderen Zelltypen, wichtige Modulatoren der Zelle Migration und Invasion zu identifizieren optimiert werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

Zelle Bewegung ist eine wichtige Eigenschaft des Trophoblasten während plazentar Entwicklung und frühe Schwangerschaft. Die Bedeutung der richtigen Trophoblast Migration und Invasion zeigt Schwangerschaft Erkrankungen wie der Präeklampsie und intrauteriner Wachstumsretardierung, die mit unzureichenden Trophoblast Einmarsch in das mütterliche Gefäßsystem verbunden sind. Leider, unser Verständnis der Mechanismen, durch die die Plazenta von Migration entwickelt Trophoblasten ist begrenzt. In-vitro-Analyse der Zellwanderung über der Scratch-Test ist ein nützliches Werkzeug bei der Identifizierung von Faktoren, die Trophoblast wandernden Kapazität zu regulieren. Dieser Assay allein definiert jedoch nicht die Zellveränderungen, die veränderte Zelle Migration führen können. Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene in-vitro-Untersuchungen, die gemeinsam verwendet werden, um Trophoblast Zelle Bewegung zu bewerten: der Scratch-Test, die Invasion-Assay und der Verbreitung Assay. Die hier beschriebenen Protokolle können auch für den Einsatz in anderen Zelllinien zur Quantifizierung der Zellbewegung in Reaktion auf Reize geändert werden. Diese Methoden können Forscher, einzelne Faktoren zu identifizieren, die dazu beitragen, die Zellbewegung und bieten eine gründliche Prüfung der möglichen Mechanismen, die offensichtlichen Veränderungen der Zellmigration.

Verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zell-Linien Sw.71 und HTR-8/SVneo dienten in diesen Experimenten um die Rolle von Glucocorticoiden in Trophoblast Zelle Migration12zu bestimmen. Glukokortikoide wurden in diesen Experimenten verwendet, als sie vor kurzem gezeigt worden, um Trophoblast Funktionen ändern obwohl alternative Behandlungen verwendeten12sein könnte. Beide Zelllinien wurden behandelt mit Fahrzeug (1 X PBS) oder 100 n...

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In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Hier präsentieren wir eine hochverfügbare Protokoll für die Bewertung der Zellbewegung in menschlichen Trophoblast Zellen mit drei in-vitro-Tests: der Scratch-Test, Transwell Invasion Assay und der Zelle Verbreitung Assay.

In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Diese Methoden können verwendet werden, um Faktoren zu bestimmen, die Trophoblast Invasion beeinflussen, die Einblick in wichtige negative geburtshilfliche Ergebnisse bieten können. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie eine visuelle und quantitative Analyse mehrerer Faktoren bietet, die die Trophoblasteninvasion beeinflussen können, einschließlich Proliferation und Migration. Um den Kratztest zu beginnen, säen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen in eine 24-Well-Platte, um 100% Zusammenfluss in 48 Stunden zu erreichen.Am nächsten Tag, ändern Sie die Medien auf phenolrote freie Medien mit Wärme inaktivierte Kohle dextran entfernt FBS ergänzt. Am Tag des Kratzers, fügen Sie die gewünschte Behandlung zu den Medien in jedem Brunnen, um die Zellen für 30 Minuten zu pziehen. Um gleichmäßige Wunden zu erzeugen, legen Sie sterile 10 Mikroliter Pipettenspitzen auf die Stifte des Wundmacherwerkzeugs.Senken Sie die Spitzen in die erste Reihe der Brunnen und bewegen Sie die Platte entlang der Spur des Wundmachers, bis die Pipettenspitzen die andere Seite des Brunnens erreichen. Dann bewegen Sie die Platte zurück in die Ausgangsposition, um eine konstante Wunde über den Durchmesser des Brunnens zu gewährleisten. Senken Sie die Spitzen in die nächste Reihe von Brunnen und wiederholen Sie, bis alle Brunnen zerkratzt sind.Bestätigen Sie, dass der Kratzer die Breite des Brunnens bedeckt, indem Sie die Platte unter dem Mikroskop beobachten. Als nächstes die Medien vorsichtig ansaugen und die Zellen zweimal mit 1x PBS vorsichtig waschen. Nach einer letzten Wäsche, fügen Sie ergänzt phenolrot frei abgestreift oder niedrige FBS-Medien mit einer gewünschten Behandlung.Als nächstes legen Sie die Platte mit den zerkratzten Brunnen in einem automatisierten Zeitraffer-Imager in einem Inkubator, der 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre enthält. Stellen Sie die Zellen in regelmäßigen Abständen nach Bedarf ab, damit die Zellen die Wundheilung abschließen können. Um den Invasionstest zu beginnen, säen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen in Sechs-Brunnen-Platten in einem Inkubator, der 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre hält.Lassen Sie Zellen 90% Zusammenfluss in 48 Stunden erreichen. Am nächsten Tag, ändern Sie die Medien auf phenolrote freie Medien mit Wärme inaktivierte Kohle dextran entfernt FBS ergänzt. Eine Durchstechflasche mit 10 Milligramm pro Milliliter extrazelluläre Matrix in einen Kühlschrank auf Eis legen und über Nacht auftauen lassen.Verwenden Sie am Tag danach gekühlte Pipettenspitzen, um 10 Milligramm pro Milliliter der extrazellulären Matrix mit den phenolroten freien Serum-freien Medien auf eine Endkonzentration von fünf Milligramm pro Milliliter zu verdünnen. Dann 100 Milliliter der verdünnten extrazellulären Matrix zu gekühlten Einsätzen hinzufügen, die in die gekühlte 24-Well-Platte gelegt wurden. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, damit die Matrix aushärten kann.Um Zellen für den Invasionstest vorzubereiten, waschen Sie Zellen mit einem Milliliter 1x PBS. Dann aspirieren Sie die PBS und fügen Sie 500 Mikroliter von 1x Trypsin EDTA zu jedem Brunnen. Legen Sie die Sechs-Brunnen-Platte in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre hält, bis alle Zellen von der Unterseite der Platte gelöst haben.Sobald sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie 500 Mikroliter des phenolroten freien Serums freien Medien zu jedem Brunnen der trypsinisierten Zellen hinzu. Dann 1.000 Mikroliter freigelöster Zellen in ein Mikrozentrifugenrohr geben und fünf Minuten bei 400 mal g bei vier Grad Celsius nach unten drehen. Als nächstes die Medien ansaugen und die Zellen im phenolroten freien Serumfreie Medium wieder aussetzen.Zählen Sie Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und passen Sie das Volumen der Zellsuspension für eine Endkonzentration von 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter an. Fügen Sie 600 Mikroliter des gesamten Wachstumsmediums in jeden Brunnen der 24-Well-Platte und legen Sie den vorbeschichteten Einsatz hinein. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Zellen auf jedem vorbeschichteten Zelleinsatz für insgesamt 0,1 Millionen Zellen hinzu.Legen Sie die 24-Well-Platte in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre für 24 Stunden hält. Nach der nächtlichen Inkubation die restlichen Medien aus den oberen und unteren Kammern ansaugen, ohne die extrazelluläre Matrix zu stören. Dann entfernen Sie vorsichtig die extrazelluläre Matrix und nicht eingedrungene Zellen aus dem oberen Teil der Einsätze mit einem Wattestäbchen.Waschen Sie jeden Einsatz dreimal, indem Sie 1x PBS sowohl in die oberen als auch in die unteren Kammern des Brunnens einbauen. PBS nach jeder Wäsche aspirieren. Um die an den Einsätzen befestigten Zellen zu fixieren, legen Sie die Einsätze 30 Minuten lang in 100% eiskaltes Methanol bei vier Grad Celsius.Waschen Sie Einsätze dreimal mit 1x PBS und entfernen Sie PBS nach der letzten Wäsche. Färben Sie die an den Einsätzen befestigten Zellen 10 Minuten lang mit 0,2% Kristallviolett in 20% Ethanol. Spülen Sie mit entionisiertem Wasser dreimal und aspirieren deionisiertes Wasser nach der letzten Wäsche.Lufttrockene Einsätze bei Raumtemperatur für eine Stunde. Schließlich mit Zange und eine Rasierklinge, sorgfältig schneiden Sie die untere Membran des Einsatzes und montieren Sie es auf einem Glasschlitten mit der untere Seite nach oben. Mit einem Lichtmikroskop mit einem 20-fachen Objektiv erhalten Sie mindestens vier einzigartige Bilder der eingedrungenen Zellen pro Probe.Um den Proliferationstest zu beginnen, verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die trypsinisierten Zellen aus dem Kolben zu zählen. Samenzellen in Sechs-Well-Platten mit einer Dichte von 0,2 Millionen Zellen pro Brunnen in Standard-Wachstumsmedien. Dann legen Sie Zellen in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre für vier Stunden oder bis zellen haftet gehalten.Als nächstes ändern Sie das Medium auf phenolrote freie Medien, ergänzt mit Wärme inaktivierten Holzkohle Dextran abgestreift FBS und gewünschte Behandlung. Legen Sie die Sechs-Brunnen-Platte in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre hält. Dann ersetzen Sie die Medien durch die frischen Medien, die alle 48 Stunden mit der gewünschten Behandlung ergänzt werden.Nach 24, 48 oder 72 Stunden Behandlung, waschen Sie Zellen mit einem Milliliter 1x 1x PBS und fügen Sie 500 Mikroliter Trypsin EDTA zu jedem Brunnen hinzu. Legen Sie eine Sechs-Well-Platte in den Inkubator, bis sich die Zellen von der Platte gelöst haben. Sobald sich die Zellen von der Platte gelöst haben, fügen Sie 500 Mikroliter der ergänzten phenolroten freien Medien hinzu, um Trypsin zu deaktivieren.Zum Schluss fünf Mikroliter der trypsinisierten Zellen zu fünf Mikroliter trypan Blue in einem separaten Rohr hinzufügen und durch Pipettieren mischen. Verwenden Sie einen automatisierten Zellenzähler, um Zellen aus jedem Brunnen in Duplikat zu zählen. Immortalized menschlichen ersten Trimester trophoblast Schwan.71 Zellen wurden für null, acht und 18 Stunden mit Fahrzeug 1x PBS oder 100 Mikromolar des synthetischen Glukokortikoiddztoxons im Kratztest behandelt. Messung der Wundgröße und der Wunddichte in Swan. 71 und HTR-8/SVneo-Zellen, die mit Fahrzeug oder 100 nanomolar dex behandelt wurden, zeigten, dass die Dex-Behandlung die Rate des Wundverschlusses reduzierte, was darauf hindeutet, dass Glukokortikoide die Zellmigration hemmen könnten.Nach dem Invasionstest reduzierte die Glukokortikoid-Behandlung die Zellinvasivität, wie eine 15%ige Verringerung der Zahl der eingedrungenen Schwanen zeigt. 71 und HTR-8/SVneo-Zellen, die 24 Stunden lang mit 100 nanomolarer Dex behandelt wurden, im Vergleich zu Zellen, die mit dem Fahrzeug behandelt wurden. Nach dem Zellproliferationstest reduzierte die Glukokortikoid-Behandlung die Zellproliferation, wie sie durch weniger Swan angezeigt wird.71 und HTR-8/SVneo-Zellen, die mit 100 nanomolaren Dex behandelt wurden, im Vergleich zu Zellen, die mit Fahrzeug behandelt wurden. Methoden zur Bewertung des Zelltodes könnten in Verbindung mit diesem Verfahren verwendet werden, um festzustellen, ob Apoptose oder Nekrose zu veränderten Trophoblastenfunktionen beitragen. Wir haben den Einsatz von Standardtechniken, die routinemäßig in der Krebsbiologie für die Untersuchung der Trophoblastenfunktion verwendet werden, auf einzigartige Weise übernommen.Mit diesen Methoden sind keine Gefahren verbunden. Die einzige Vorsichtsmaßnahme, die Der Betrachter treffen sollte, ist die Verwendung steriler Technik für die Gewebekultur.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Forschung

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Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Hornhautgewebe Engineering: Eine In-vitro- Modell der Stromazellen Nerv Interaktionen der menschlichen Hornhaut

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...