Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

המחברים מודים ד ר גיל מור על מתן התאים Sw.71. מחקר זה נתמך על ידי פרס אלברט מלומד מק'קרן כדי ייגמר בתיקו

1. תא הכנה
<ol><li>לשמור על תאים T-75 מבחנות בתקשורת צמיחה רגיל-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% לחות. הערה: התאים המשמשים ניסויים אלה היו immortalized בטרימסטר הראשון trophoblast תא קווים Swan.71 (Sw.71) לתיקוני-8/SVneo9,10. התאים Sw.71 היו בהשתתפות DMEM/F-12 בתוספת 10% לא פעיל חום העובר...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+implantation+and+placentation:+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications.">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li><li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia.">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li><li>Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion.">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li><li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#x3b1;-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8/SVneo+Trophoblast+Cells.">TNF&#x3b1;-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li><li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion.">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li><li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+(MMP)-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy.">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li><li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line,+Swan+71.">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li><li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan.">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71.">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).</li><li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

הליך זה מתבסס על שימוש ההעברה הפלישה מבחני לכלול קצב התפשטות תאים כמו תורם פוטנציאלי להבדלים נמדד בתנועת התא trophoblast. נעשה שימוש יחד, מבחני במבחנה אלה הן שיטות פשוטה ויעילה שיכול לשמש כדי לזהות המסלולים הסלולר המסדירים trophoblast ההעברה. כפי שתואר לעיל, ניתן לטפל trophoblast תאים עם הורמונים, ציטוקינ...

פיתוח היפרדות היא שלב חיוני בהקמה של ההריון, להשפיע על בריאות האמהי וגם העובר. עם זאת, הבסיס מכניסטית שבו מתרחש תהליך זה אינו מובן במלואו. נדידת תאים הוא תהליך ביולוגי חשוב אשר תורם הקמתה ואת הפונקציות של השליה במהלך ההריון. בעקבות ההשתלה הבלסטוציסט, מבדילה trophectoderm לתוך trophoblasts villous חלקית, אשר לכסות את המשטח של villi כוריוני מעורבים גז וחילופי מזין, trophoblasts extravillous (EVTs), אשר להעביר החוצה villi לפלוש אימהי רותמי, להערכת1. העברה של EVTs חיוני עבור שיפוץ ספירלה אימהי העורקים ויצירת מחזור uteroplacental כדי לתמוך גידול העובר2. הפלישה trophoblast לקויה במהלך ההריון התוצאה היא התפתחות לא תקינה היפרדות, עשוי לתרום הריון סיבוכים כגון רעלת, הריון יתר לחץ דם, גדילה המושבחים לידה לידה מוקדמת3, 4. לכן, להבין את הגורמים המשפיעים על תנועתיות trophoblast הוא חיוני לקביעת המסלולים הדרושים עבור placentation רגיל.
Trophoblast ההעברה נשלטת על ידי רשת מורכבת של מולקולות, לרבות גורמי גדילה, ציטוקינים, ההורמונים גורמי אנגיוגנזה5איתות. בגלל המגבלות של הלומדים את השליה ויוו, מבחני במבחנה ניצול מונצחים תא trophoblast האנושי קווים הייתה מכרעת לזיהוי גורמים שתורמים trophoblast תנועתיות. מבחני שריטה ופלישה נעשה שימוש נרחב להעריך באופן כמותי את התפקיד של מולקולות בודדות על trophoblast תא העברה6,7,8. עם זאת, בעוד שימושי במשולב כדי לחקור כיצד שינויים ההעברה עלולה להיגרם על ידי שינויים ב- invasiveness תא, אלה שני מבחני להסביר מנגנונים נוספים שעשויים לתרום שיעור שונה של נדידת תאים. לדוגמה, הנחות על קצב התפשטות תאים עלול לגרום תאים פחות זמין להעביר.
כאן, אנו מתארים במבחנה שיטות כמותיות להערכת trophoblast ההעברה באמצעות שריטות, התפשטות תאים מבחני חדירה לתא. ב וזמינותו מאפס, פצע אחיד נוצר בטפט התא, ההעברה של תאים כדי למלא את הפער נמדד על ידי הדמיה אוטומטית, בצילום מואץ של גודל הפצע צפיפות של תאים בתוך הפצע. תא התפשטות וזמינותו מבוסס על חישוב היחס בין תאים בכל נקודה בזמן לעומת כמות ההתחלתי ידוע של תאים. ב תא הפלישה וזמינותו, התאים הם נזרע על גבי תא הוספה התרבות תאים מצופים מטריצה חוץ-תאית (למשל Transwell), מספר תאים לפלוש דרך מטריצה חוץ-תאית, בתגובה כימותרפיה-attractant נספרים.
וזמינותו הזמני הוא כלי פשוט ויעיל יכול לשמש כדי לקבוע תנאים סביבתיים שונים איך להשפיע על נדידת תאים. מבחני התפשטות ופלישה עשוי לשמש לאחר מכן כדי לקבוע את התרומה של התפשטות תאים, invasiveness לשינויים הכוללת נדידת תאים. באופן קולקטיבי, מבחני אלה מספקים מדידות חזקים של תהליכים ביולוגיים שעשויים לתרום תא תנועתיות. שתי שורות תאים מונצחים בטרימסטר הראשון trophoblast שימשו מבחני המתואר, Swan.71 (Sw.71), תיקוני-8/SVneo9,10. עם זאת, אלה מבחני עשוי גם ממוטב לשימוש בסוגי תאים אחרים כדי לזהות מאפננים מפתח של נדידת תאים, הפלישה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

תנועת התא הוא מאפיין קריטי של trophoblasts במהלך הריון מוקדם ופיתוח היפרדות. המשמעות של הגירה trophoblast נאות ופלישה מומחש הפרעות ההריון כגון הגבלת גדילה תוך רחמי, רעלת היריון, אשר משויכות trophoblast לקוי הפלישה להערכת אימהית. למרבה הצער, שלנו להבנת המנגנונים מאת אשר השליה מתפתח נודדות trophoblasts מוגבל. ניתוח במבחנה של נדידת תאים באמצעות וזמינותו הזמני הוא כלי שימושי בזיהוי גורמים לווסת את קיבולת נודדות trophoblast. עם זאת, זו assay לבד אינו מגדיר את השינויים הסלולר שיכול לגרום נדידת תאים שהשתנו. פרוטוקול זה מתאר שלושה מבחני במבחנה שונים המשמשים יחדיו כדי להעריך את תנועת התא trophoblast: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה ואת וזמינותו התפשטות. ניתן לשנות את הפרוטוקולים המתוארים כאן גם לשימוש במבנים אחרים תא לכמת תנועת התא בתגובה לגירויים. שיטות אלה מאפשרות חוקרים כדי לזהות גורמים בודדים לתרום תנועת התא, לספק בדיקה יסודית של מנגנונים פוטנציאליים שבבסיס לכאורה לשינויים נדידת תאים.

הקווים תא מונצחים trophoblast בטרימסטר הראשון האנושית Sw.71, תיקוני-8/SVneo שימשו בניסויים אלה כדי לקבוע את התפקיד של glucocorticoids trophoblast תא ההעברה12. Glucocorticoids שימשו בניסויים אלה כפי שהם לאחרונה הוכחו לשנות פונקציות trophoblast, למרות טיפולים אלטרנטיביים יכול להיות בשימוש<sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ונגישות גבוהה להערכת תנועת התא בתאים trophoblast האנושי באמצעות שלושת מבחני במבחנה: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה transwell ואת וזמינותו התפשטות תאים.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

שיטות אלה יכולות להיות מנוצלות כדי לקבוע גורמים המשפיעים על פלישת trophoblast אשר עשוי לספק תובנה לתוצאות מיילדותיות שליליות גדולות. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מספקת ניתוח חזותי וכמותי של מספר גורמים שעשויים להשפיע על פלישת trophoblast כולל התפשטות והגירה. כדי להתחיל את מרד השריטה, זרע את המספר המתאים של תאים לתוך צלחת 24 באר כדי להשיג 100% confluence ב 48 שעות.למחרת, לשנות את התקשורת כדי פנול אדום חינם מדיה בתוספת חום dextran פחם שהופשט FBS. ביום השריטה, מוסיפים את הטיפול הרצוי לתקשורת בכל באר כדי לפנות את התאים במשך 30 דקות. כדי ליצור פצעים אחידים, מניחים 10 טיפים פיפטה microliter סטרילי על הסיכות של כלי יצרנית הפצע.מנמיך את הטיפים לשורה הראשונה של בארות ומזיזים את הצלחת לאורך המסלול של יצרנית הפצעים עד שטיפים פיפטה להגיע לצד השני של הבאר. ואז להזיז את הצלחת בחזרה למצב ההתחלה כדי להבטיח פצע מתמיד על פני קוטר הבאר. מנמיך את הטיפים לשורה הבאה של בארות וחוזר חלילה עד שכל הבארות שרוטות.אשר כי השריטה מכסה את רוחב באר על ידי התבוננות הצלחת תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, בזהירות שאפו את המדיה ושטפו בעדינות את התאים עם 1x PBS פעמיים. לאחר שטיפה סופית, להוסיף תוספת פנול אדום חינם הפשיטו או מדיה נמוכה FBS עם הטיפול הרצוי.לאחר מכן, מניחים את הצלחת עם הבאר השרוטה בתמונה אוטומטית timelapse שוכנת באינקובטור המכיל 37 מעלות צלזיוס טמפרטורה ו 5% פחמן דו חמצני ב 95% לחות האטמוספירה. תמונה התאים במרווחי זמן קבועים לפי הצורך כדי לאפשר לתאים להשלים ריפוי פצעים. כדי להתחיל את בדיקת הפלישה, זורעים את המספר המתאים של תאים לתוך צלחות שש בארות באינקובטור השומר על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באטמוספירה של 95%.אפשר לתאים להגיע ל- 90%confluence ב- 48 שעות. למחרת, לשנות את התקשורת כדי פנול אדום חינם מדיה בתוספת חום dextran פחם שהופשט FBS. מניחים בקבוקון של 10 מיליגרם למטריצה חוץ-תאית מיליליטר במקרר על קרח ונותנים להפשיר בן לילה.יום לאחר מכן, השתמש טיפים פיפטה מצוננת לדלל 10 מיליגרם למיליליטר של מטריצה חוץ תאית עם פנול אדום חופשי סרום חינם מדיה לריכוז סופי של חמישה מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 100 מיליליטר של מטריצה חוץ-תאית מדוללת לתוספים מצוננים שהונחו בצלחת 24 המצוננת. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למטריצה להקשיח.כדי להכין תאים למבחן הפלישה, לשטוף תאים עם מיליליטר אחד של 1x PBS. לאחר מכן שאפו את ה-PBS והוסיפו 500 מיקרוליטרים של 1x טריפסין EDTA לכל באר. מניחים את צלחת שש באר באינקובטור אשר שומר על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני ב 95% לחות האטמוספירה עד שכל התאים התנתקו מתחתית הצלחת.לאחר התאים התנתקו, להוסיף 500 microliters של פנול אדום חופשי סרום מדיה חופשית לכל באר של תאים טריפסיניים. ואז להעביר 1,000 microliters של תאים מנותקים לצינור microcentrifuge ולסובב למטה במשך חמש דקות ב 400 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את המדיה והשקיעו מחדש את התאים במדיה החופשית החופשית של הסרום האדום של פנול.לספור תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי ולהתאים את נפח ההשעיה התא לריכוז סופי של 0.5 מיליון תאים למיליליטר. הוסיפו 600 מיקרוליטרים של מדיית הצמיחה המלאה לכל באר של צלחת ה-24 באר והכניסו לתוכה את התוספת מצופה מראש. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תאים מעל כל הוספת תא מצופה מראש עבור סך של 0.1 מיליון תאים.מניחים את צלחת 24 באר באינקובטור אשר שומר על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני ב 95% לחות האטמוספירה במשך 24 שעות. לאחר הדגירה הלילית, יניקת התקשורת הנותרת מהתא העליון והתחתון מבלי להפריע למטריצה החוץ-תאית. לאחר מכן להסיר בזהירות את מטריצה חוץ תאית ותאים שאינם פולשים מהחלק העליון של מוסיף עם ספוגית כותנה.לשטוף כל הכנס שלוש פעמים על ידי הוספת 1x PBS הן התאים העליונים והתחתון של באר. שאפו PBS לאחר כל שטיפה. כדי לתקן תאים המחוברים לתוספות, הנח את המכניסים לתוך 100% מתנול קר כקרח בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לשטוף מוסיף שלוש פעמים עם 1x PBS ולהסיר PBS לאחר לשטוף הסופי. הכתם את התאים המחוברים לתוספות עם 0.2% סגול קריסטל ב 20%אתנול במשך 10 דקות. יש לשטוף במים שעברו דה-יון שלוש פעמים ולשוטוף מים שעברו דה-יון לאחר הכביסה הסופית.אוויר יבש מוסיף בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לבסוף באמצעות מדפים וסכין גילוח, בזהירות לחתוך את הממברנה התחתונה של הכנס ולהוות אותו על מגלשת זכוכית עם הצד התחתון פונה כלפי מעלה. באמצעות מיקרוסקופ אור עם מטרה 20X, להשיג לפחות ארבע תמונות ייחודיות של התאים פלשו לכל מדגם.כדי להתחיל בהתנגדות לתפוצה, השתמש ב מונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים המהונעים מהבקבוקון. תאי זרעים לתוך שש בארות צלחות בצפיפות של 0.2 מיליון תאים לגם במדיה צמיחה סטנדרטית. לאחר מכן מניחים תאים באינקובטור השומר על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באטמוספירה של 95% לחות במשך ארבע שעות או עד שהתאים נדבקו.לאחר מכן, לשנות את התקשורת כדי פנול אדום חינם מדיה בתוספת חום dextran פחם שהופשט FBS ואת הטיפול הרצוי. מניחים את צלחת שש באר באינקובטור אשר שומר על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני ב 95% לחות האטמוספירה. לאחר מכן החלף את התקשורת במדיה הטרייה בתוספת הטיפול הרצוי כל 48 שעות.לאחר 24, 48, או 72 שעות טיפול, לשטוף תאים עם מיליליטר אחד של 1x PBS ולהוסיף 500 microliters של טריפסין EDTA לכל באר. מניחים צלחת שש באר באינקובטור עד התאים התנתקו מהצלחת. לאחר שתאים התנתקו מהצלחת, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של המדיה הפנולית האדומה של פנול כדי להשבית את טריפסין.לבסוף להוסיף חמישה microliters של תאים טריפסיניים לחמישה microliters של טריפאן כחול בצינור נפרד ומערבבים על ידי צינור. השתמש ב מונה תאים אוטומטי כדי לספור תאים מכל באר בשכפול. הנצחת האדם בשליש הראשון של הברבור הטרופובלסט.71 תאים טופלו במשך אפס, שמונה, ו 18 שעות עם רכב 1x PBS או 100 micromolar של דקסמתזון glucocorticoid סינתטי בהסטת השריטה. מדידה של גודל הפצע וצפיפות הפצע בסוואן. 71 ו HTR-8/SVneo תאים שטופלו ברכב או 100 dex nanomolar הראו כי טיפול דקס הפחית את קצב סגירת הפצע המציין כי glucocorticoids יכול לעכב את נדידת התא.בעקבות הפלישה, טיפול glucocorticoid מופחת פולשנות התא כפי שמוצג על ידי ירידה של 15% במספר הברבור פלש. 71 ותאי HTR-8/SVneo שטופלו ב-100 ננו-מולאר דקס במשך 24 שעות בהשוואה לתאים שטופלו ברכב. בעקבות התפשטות התאים, טיפול glucocorticoid מופחת התפשטות התא כפי שצוין על ידי פחות ברבור.71 ותאי HTR-8/SVneo שטופלו ב-100 דקס ננומולרי בהשוואה לתאים שטופלו ברכב. שיטות להערכת מוות תאי יכול לשמש בשילוב עם הליך זה כדי לקבוע אם אפופטוזיס או נמק לתרום פונקציות trophoblast השתנה. אימצנו באופן ייחודי את השימוש בטכניקות סטנדרטיות המשמשות באופן שגרתי בביולוגיה של סרטן לחקר תפקוד הטרופובלסט.אין סכנות הקשורות לשיטות אלה. אמצעי הזהירות היחיד שצופים צריכים לנקוט הוא שימוש בטכניקה סטרילית לתרבות הרקמות.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני myelination

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation<em&gt; במבחנה</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

הנדסת רקמות הקרנית: במבחנה מודל של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...