Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
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लेखक दप. 71 कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए डॉ गिल मोर धंयवाद । इस शोध को एक अल्बर्ट mckern विद्वान पुरस्कार द्वारा समर्थित था S.W.

1. सेल तैयारी
<ol><li>में कोशिकाओं को बनाए रखने टी-७५ बोतल में मानक विकास मीडिया पर ३७ ° c, 5% सह2, और ९५% आर्द्रता. नोट: इन प्रयोगों में प्रयुक्त कोशिकाएं अमर पहली-तिमाही ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइंस हंस. 71 (S...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. 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यह प्रक्रिया माइग्रेशन और आक्रमण assays के उपयोग पर बनाता है कोशिका प्रसार की दर को एक संभावित योगदानकर्ता के रूप में शामिल करने के लिए ट्रोफोब्लास्ट सेल आंदोलन में मापा मतभेद । एक साथ इस्तेमाल किया, इन वि?...

गर्भनाल विकास गर्भावस्था की स्थापना में एक महत्वपूर्ण कदम है, दोनों मातृ और भ्रूण स्वास्थ्य को प्रभावित । हालांकि, यंत्रवत आधार जिसके द्वारा यह प्रक्रिया होती है पूरी तरह से समझ में नहीं आता है । सेल माइग्रेशन एक महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया है जो गर्भावस्था के दौरान प्लेसेंटा की स्थापना और कार्यों में योगदान देती है । ब्लास्टोसिस्ट प्रत्यारोपण के बाद, trophectoderm, जो चोरोनिक विली की सतह को कवर और गैस और पोषक तत्वों के आदान-प्रदान में शामिल हैं, और extravillous ट्रोफोब्लास्ट्स (evts), जो विली से बाहर पलायन में विलेउस trophoविस्फोटों में differentiates और मातृ पाती और vasculature1आक्रमण । evts के प्रवास मातृ सर्पिल धमनियों remodeling और भ्रूण विकास2का समर्थन करने के लिए uteroplacental परिसंचरण की स्थापना के लिए आवश्यक है । गर्भावस्था के दौरान अपर्याप्त ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण असामान्य अपरा विकास में परिणाम और गर्भावस्था जटिलताओं के लिए योगदान कर सकते हैं जैसे preeclampsia, गर्भावधि उच्च रक्तचाप, अंतर-गर्भाशय विकास प्रतिबंध, और अपरिपक्व जन्म3, 4. इसलिए, उन कारकों को समझना जो ट्रोफोब्लास्ट गतिशीलता को प्रभावित करते हैं, सामान्य placentation के लिए आवश्यक रास्ते का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है ।
ट्रोफोब्लास्ट माइग्रेशन को संकेतन अणुओं के एक जटिल नेटवर्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें वृद्धि कारक, साइटोकिन्स, हार्मोन, और एंजिजेनिक कारक5शामिल हैं । vivo में अपरा का अध्ययन करने की सीमाओं के कारण, इन विट्रो assays में अमर मानव ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइनों का उपयोग कारकों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है जो ट्रोफोब्लास्ट गतिशीलता में योगदान देते हैं । खरोंच और आक्रमण assays के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है मात्रात्मक ट्रोफोब्लास्ट सेल माइग्रेशन6,7,8पर व्यक्तिगत अणुओं की भूमिका का आकलन । हालांकि, इस बात की जांच करने के लिए अग्रानुक्रम में उपयोगी है कि माइग्रेशन में परिवर्तन कक्ष असावधानी में परिवर्तन के कारण कैसे हो सकते हैं, इन दो assays अतिरिक्त मेकेनिज़्म के लिए नहीं खाते जो कक्ष माइग्रेशन की परिवर्तित दरों में योगदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, सेल प्रसार की दर में कटौती के परिणामस्वरूप कम कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए उपलब्ध हो सकता है ।
यहाँ, हम खरोंच, कोशिका प्रसार, और सेल आक्रमण assays का उपयोग कर ट्रोफोब्लास्ट माइग्रेशन का आकलन करने के लिए विट्रो तरीकों में मात्रात्मक का वर्णन. खरोंच परख में, एक समान घाव एक सेल मोनोलेयर में बनाया जाता है, और अंतर को भरने के लिए कोशिकाओं के प्रवास को स्वचालित, घाव के आकार और घाव के भीतर कोशिकाओं के घनत्व के समय-चूक इमेजिंग द्वारा मापा जाता है । सेल प्रसार परख कोशिकाओं की एक ज्ञात प्रारंभिक मात्रा की तुलना में हर समय बिंदु पर कोशिकाओं के अनुपात की गणना पर आधारित है । सेल आक्रमण परख में, कोशिकाओं के ऊपर एक extracellular मैट्रिक्स-लेपित सेल संस्कृति डालने के चैंबर (जैसे transwell), और कोशिकाओं की संख्या कि chemo के जवाब में extracellular मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण-आकर्षी गिना जाता है वरीयता प्राप्त कर रहे हैं ।
खरोंच परख एक सरल और प्रभावी उपकरण है कि कैसे विभिंन पर्यावरणीय स्थितियों सेल प्रवास को प्रभावित निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रसार और आक्रमण assays बाद सेल प्रसार के योगदान को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कोशिका प्रवास में समग्र परिवर्तन करने के लिए invasiveness । सामूहिक रूप से, इन assays जैविक प्रक्रियाओं है कि कोशिका गतिशीलता के लिए योगदान कर सकते हैं की मजबूत माप प्रदान करते हैं । दो अमर पहले trimester ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइनों वर्णित assays में इस्तेमाल किया गया, हंस. 71 (Sw. 71) और htr-8/svneo9,10. हालांकि, इन assays भी सेल प्रवास और आक्रमण की कुंजी नियन्त्रक की पहचान करने के लिए अन्य सेल प्रकार में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

कोशिका संचलन प्लेसेंटल विकास और प्रारंभिक गर्भावस्था के दौरान ट्रोफोब्लास्ट का एक महत्वपूर्ण गुण है । उचित ट्रोफोब्लास्ट माइग्रेशन और आक्रमण के महत्व को गर्भावस्था के विकारों जैसे प्री-एक्लैम्पसिया और इंट्रायूटरिन विकास प्रतिबंध के द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, जो मातृ वैक्लचर के अपर्याप्त ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण से जुड़े होते हैं । दुर्भाग्य से, तंत्र के बारे में हमारी समझ जिसके द्वारा प्लेसेंटा माइग्रेट ट्रोफोब्लास्ट से विकसित होता है सीमित है । में खरोंच परख के माध्यम से सेल प्रवास के विट्रो विश्लेषण कारकों की पहचान करने में एक उपयोगी उपकरण है कि ट्रोफोब्लास्ट प्रवासी क्षमता को विनियमित है । हालांकि, इस परख अकेले सेलुलर परिवर्तन है कि बदल सेल प्रवास में परिणाम कर सकते है परिभाषित नहीं करता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन तीन विट्रो assays में अलग है कि सामूहिक रूप से उपयोग किया जाता है ट्रोफोब्लास्ट सेल आंदोलन का मूल्यांकन: खरोंच परख, आक्रमण परख, और प्रसार परख । यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी अन्य कोशिका लाइनों में उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है करने के लिए उत्तेजना के जवाब में सेल आंदोलन यों तो. इन पद्धतियों जांचकर्ताओं व्यक्तिगत कारकों है कि सेल आंदोलन में योगदान की पहचान करने और सेल प्रवास में स्पष्ट परिवर्तन अंतर्निहित संभावित तंत्र की एक पूरी तरह से परीक्षा प्रदान करने के लिए अनुमति देते हैं ।

अमर मानव पहली तिमाही ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइनों Sw. 71 और htr-8/svneo ट्रोफोब्लास्ट सेल माइग्रेशन12में ग्लुकोकोर्टिकोइड की भूमिका निर्धारित करने के लिए इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया । glu...

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In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

खरोंच परख, transwell आक्रमण परख, और सेल प्रसार परख: यहां, हम मानव ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं में सेल आंदोलन का मूल्यांकन करने के लिए एक उच्च सुलभ प्रोटोकॉल वर्तमान में तीन विट्रो assays में का उपयोग कर ।

विट्रो में प्रवास का मूल्यांकन करने के लिए assays, आक्रमण, और अमर मानव के प्रसार के पहले-trimester ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइनों

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

इन तरीकों का उपयोग उन कारकों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जो ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण को प्रभावित करते हैं जो प्रमुख प्रतिकूल प्रसूति परिणामों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इस तकनीक का लाभ यह है कि यह कई कारकों का एक दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करता है जो प्रसार और प्रवासन सहित ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण को प्रभावित कर सकता है। खरोंच परख शुरू करने के लिए, 48 घंटे में 100% संगम प्राप्त करने के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं की उचित संख्या बीज।अगले दिन, मीडिया को फेनोल रेड फ्री मीडिया में बदलें, जो गर्मी में निष्क्रिय चारकोल डेक्सटरान छीन लिया गया एफबीएस के साथ पूरक है। खरोंच के दिन, 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को प्रीट्रीट करने के लिए प्रत्येक कुएं में मीडिया में वांछित उपचार जोड़ें। एक समान घाव बनाने के लिए, घाव निर्माता उपकरण के पिन पर बाँझ 10 माइक्रोलीटर पिपेट टिप्स रखें।कुओं की पहली पंक्ति में सुझावों को कम करें और घाव निर्माता के ट्रैक के साथ प्लेट को तब तक ले जाएं जब तक कि पिपेट टिप्स कुएं के दूसरी तरफ न पहुंच जाएं। फिर अच्छी तरह से व्यास के पार लगातार घाव सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को शुरुआती स्थिति में वापस ले जाएं। कुओं की अगली पंक्ति में सुझावों को कम करें और तब तक दोहराएं जब तक कि सभी कुओं को खरोंच न हो जाए।पुष्टि करें कि खरोंच एक माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट को देख कर कुएं की चौड़ाई को कवर करता है। इसके बाद, ध्यान से मीडिया को एस्पिरेट करें और धीरे-धीरे कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, वांछित उपचार के साथ पूरक फिनोल लाल मुक्त छीन लिया या कम एफबीएस मीडिया जोड़ें।इसके बाद, प्लेट को एक इनक्यूबेटर में रखे स्वचालित टाइमलैप्स इमेजर में खरोंच वाले कुओं के साथ रखें जिसमें 95% आर्द्रता वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस तापमान और 5% कार्बन डाइऑक्साइड शामिल है। कोशिकाओं को घाव भरने को पूरा करने की अनुमति देने के लिए आवश्यक नियमित अंतराल पर कोशिकाओं की छवि। आक्रमण परख शुरू करने के लिए, एक इनक्यूबेटर में छह अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं की उचित संख्या बीज जो ९५% आर्द्रता वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस तापमान और 5% कार्बन डाइऑक्साइड का कहना है ।कोशिकाओं को 48 घंटे में 90% संगम तक पहुंचने दें। अगले दिन, मीडिया को फेनोल रेड फ्री मीडिया में बदलें, जो गर्मी में निष्क्रिय चारकोल डेक्सटरान छीन लिया गया एफबीएस के साथ पूरक है। बर्फ पर एक रेफ्रिजरेटर में मिलीलीटर बाह्य मैट्रिक्स प्रति 10 मिलीग्राम की एक शीशी रखें और रात भर गल जाता है।दिन के बाद, पांच मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए फेनोल रेड फ्री सीरम फ्री मीडिया के साथ एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर को पतला करने के लिए ठंडा पिपेट टिप्स का उपयोग करें। फिर ठंडा 24-अच्छी प्लेट में रखे गए ठंडा आवेषण में पतला एक्सपेरि्युलर मैट्रिक्स के 100 मिलीलीटर जोड़ें। मैट्रिक्स को कठोर करने की अनुमति देने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।आक्रमण परख के लिए कोशिकाओं को प्रस्तुत करने के लिए, 1x PBS के एक मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं। फिर पीबीएस को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से 1x ट्रिप्पसिन ईडीटीए के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। इनक्यूबेटर में छह अच्छी तरह से थाली रखें जो ३७ डिग्री सेल्सियस तापमान और ५% कार्बन डाइऑक्साइड को ९५% आर्द्रता वातावरण में रखता है जब तक कि सभी कोशिकाएं प्लेट के नीचे से अलग न हो जाएं ।एक बार कोशिकाओं को अलग कर दिया है, फीनॉल लाल मुक्त सीरम मुक्त मीडिया के ५०० माइक्रोलीटर ट्राइपसिनाइज्ड कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें । फिर अलग कोशिकाओं के 1, 000 माइक्रोलीटर को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और चार डिग्री सेल्सियस पर 400 बार जी पर पांच मिनट के लिए नीचे स्पिन करें। इसके बाद, मीडिया को एस्पिरेट करें और फेनोल रेड फ्री सीरम फ्री मीडिया में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें और प्रति मिलीलीटर 0.5 मिलियन कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता के लिए सेल निलंबन की मात्रा को समायोजित करें। 24-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में पूर्ण विकास मीडिया के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसमें प्री-कोटेड डालने रखें। फिर कुल 0.1 मिलियन कोशिकाओं के लिए प्रत्येक प्री-कोटेड सेल डालने के शीर्ष पर कोशिकाओं के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।इनक्यूबेटर में 24 अच्छी प्लेट रखें जो 24 घंटे के लिए 95% आर्द्रता वातावरण पर 37 डिग्री सेल्सियस तापमान और 5% कार्बन डाइऑक्साइड को बनाए रखता है। रात भर इनक्यूबेशन के बाद, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स को परेशान किए बिना ऊपरी और निचले कक्षों से शेष मीडिया को सक्शन करें। फिर ध्यान से एक कपास झाड़ू के साथ आवेषण के ऊपरी हिस्से से बाहूदार मैट्रिक्स और गैर-आक्रमण कोशिकाओं को हटा दें।अच्छी तरह से ऊपरी और निचले दोनों कक्षों में 1x पीबीएस जोड़कर प्रत्येक डालें तीन बार धोएं। प्रत्येक धोने के बाद पीबीएस को एस्पिरेट करें। आवेषण से जुड़ी कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, आवेषण को 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 100% बर्फ ठंडे मेथनॉल में रखें।1x PBS के साथ तीन बार आवेषण धोएं और अंतिम धोने के बाद PBS को हटा दें। 10 मिनट के लिए 20% इथेनॉल में 0.2% क्रिस्टल वायलेट के साथ आवेषण से जुड़ी कोशिकाओं को दाग दें। तीन बार डिएकोनाइज्ड पानी से कुल्ला करें और अंतिम धोने के बाद पानी को एस्पिरेट करें।एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हवा सूखी आवेषण। अंत में संदंश और एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके, सावधानी से डालने की निचली झिल्ली को काट दें और इसे नीचे की ओर सामना करने के साथ एक ग्लास स्लाइड पर माउंट करें। 20X उद्देश्य के साथ एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, प्रति नमूना हमला कोशिकाओं की कम से कम चार अनूठी छवियां प्राप्त करें।प्रसार परख शुरू करने के लिए, फ्लास्क से ट्राइपसिनाइज्ड कोशिकाओं को गिनने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें। मानक विकास मीडिया में 0.2 मिलियन कोशिकाओं के घनत्व पर छह-अच्छी प्लेटों में बीज कोशिकाएं। फिर कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में रखें जो चार घंटे तक या कोशिकाओं के पालन तक 95% आर्द्रता वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस तापमान और 5% कार्बन डाइऑक्साइड को बनाए रखता है।इसके बाद, मीडिया को फेनोल रेड फ्री मीडिया में बदलें, जो गर्मी में निष्क्रिय चारकोल डेक्सटरान के साथ पूरक एफबीएस और वांछित उपचार छीन लिया। इनक्यूबेटर में छह अच्छी प्लेट रखें जो 95% आर्द्रता वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस तापमान और 5% कार्बन डाइऑक्साइड को बनाए रखता है। फिर हर 48 घंटे में वांछित उपचार के साथ पूरक ताजा मीडिया के साथ मीडिया की जगह।24, 48, या 72 घंटे के उपचार के बाद, 1x पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं और प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रिप्सिन ईडीटीए के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। इनक्यूबेटर में एक छह अच्छी तरह से थाली रखें जब तक कोशिकाओं थाली से अलग हो गया है । एक बार कोशिकाओं को प्लेट से अलग कर दिया है, पूरक फिनॉल लाल मुक्त मीडिया के ५०० माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए Trippsin निष्क्रिय ।अंत में ट्राइपैन ब्लू के पांच माइक्रोलीटर को एक अलग ट्यूब में ट्राइपैन ब्लू के पांच माइक्रोलीटर में जोड़ें और पिपटिंग द्वारा मिलाएं। डुप्लिकेट में प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें। अमर मानव पहली तिमाही ट्रोफोब्लास्ट हंस।७१ कोशिकाओं को शून्य, आठ, और 18 घंटे के लिए वाहन 1x पीबीएस या खरोंच परख में सिंथेटिक ग्लूकोकॉर्टिकोइड dexamethasone के १०० माइक्रोमॉलर के साथ इलाज किया गया । घाव के आकार और हंस में घाव घनत्व का माप। ७१ और एचटीआर-8/एसवीएनईओ कोशिकाओं को वाहन या १०० नैनोमोल्लर डेक्स के साथ इलाज से पता चला है कि डेक्स उपचार ने घाव बंद होने की दर को कम कर दिया जो यह दर्शाता है कि ग्लूकोकॉर्टिकोइड सेल माइग्रेशन को बाधित कर सकता है ।आक्रमण परख के बाद, ग्लूकोकॉर्टिकोइड उपचार ने सेल आक्रामकता को कम कर दिया जैसा कि आक्रमण हंस की संख्या में 15% की कमी से दिखाया गया है। ७१ और एचटीआर-8/एसवीएनईओ कोशिकाओं को वाहन के साथ इलाज की कोशिकाओं की तुलना में 24 घंटे के लिए १०० नैनोमोलर डेक्स के साथ इलाज किया गया । सेल प्रसार परख के बाद, ग्लूकोकॉर्टिकोइड उपचार ने कम हंस द्वारा इंगित सेल प्रसार को कम कर दिया।७१ और एचटीआर-8/एसवीएनओ कोशिकाओं को वाहन के साथ इलाज कोशिकाओं की तुलना में १०० नैनोमोलर डेक्स के साथ इलाज किया गया । सेल मृत्यु का मूल्यांकन करने के तरीकों का उपयोग इस प्रक्रिया के साथ मिलकर किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि एपोप्टोसिस या नेक्रोसिस परिवर्तित ट्रोफोब्लास्ट कार्यों में योगदान देते हैं या नहीं। हम विशिष्ट मानक नियमित रूप से ट्रोफोब्लास्ट समारोह के अध्ययन के लिए कैंसर जीव विज्ञान में इस्तेमाल तकनीकों के उपयोग को अपनाया है ।इन तरीकों से जुड़े कोई खतरे नहीं हैं। केवल एहतियात दर्शकों को ले जाना चाहिए ऊतक संस्कृति के लिए बाँझ तकनीक का उपयोग कर रहा है ।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

उत्पादन और चुनिंदा transduce प्राथमिक Oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं को lentivirus के उपयोग के लिए<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

माउस गर्भाशय में गर्भावस्था के दौरान मातृ संवहनी remodeling के आकलन

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

जीनोम संपादित मानव स्टेम सेल लाइनों की स्थापना: अलगाव को लक्षित से

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

अमर multipotent Otic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में भेदभाव की शुरुआत

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

एक का विकास<em&gt; इन विट्रो</em&gt; परख mesenchymal कोशिकाओं कि कराना पड़ा उपकला-mesenchymal संक्रमण की सिकुड़ा समारोह का मूल्यांकन करने के लिए

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

मानव प्राथमिक ट्रोफोब्लास्ट खिलाफ हाइपोक्सिया मेलाटोनिन के सुरक्षात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सेल संस्कृति मॉडल / reoxygenation प्रेरित विघटन

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

5-एमसी डॉट ब्लाट परख डीएनए मेथिलिकेशन लेवल ऑफ़ चॉन्ड्रोसाइट डिडिएफेनिफिकेशन<em&gt; विट्रो में</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

माउस द्वितीयक ताललेट फ्यूजन की लाइव इमेजिंग

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal टिशू इंजीनियरिंग: एक इन विट्रो मॉडल के Stromal-तंत्रिका बातचीत के मानव कॉर्निया

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

सेल एकत्रीकरण परख सीआईएसद्वारा ट्रांस-लाइगैंडों और उसके निषेध के साथ Drosophila पायदान के बंधन का मूल्यांकन करने के लिए-लाइगैंडों

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...