Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
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著者は、博士 Gil Mor が Sw.71 細胞を提供することをありがちましょう。この研究は、南西にアルバート McKern 学者賞によって支えられました。

1. セル準備
<ol><li>湿度 95%、5% CO2、37 ° C で標準的な成長媒体に T-75 フラスコ細胞を維持します。 注:これらの実験で使用される細胞が不死妊娠初期絨毛細胞線 Swan.71 (Sw.71) と HTR-8/SVneo9,10。DMEM/F - 12 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)、ピルビン酸ナトリウム 1.0 mM、10 mM HEPES、0.10 mM MEM 非必須アミノ酸、100 単位/ml ペニシリン、100 μ...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

この手順は、絨毛細胞運動の計測違いに潜在的な貢献者として細胞増殖率を含めるアッセイ移行および侵略の使用に基づいています。一緒に使用すると、これらの生体外の試金は、絨毛の移行を調節する細胞の経路を識別するために使用することができますシンプルで効果的な方法です。前述のように、栄養膜細胞は、ホルモン、サイトカイン、成長因子、または絨毛運動に与える影響を決?...

胎盤発育、妊娠、母体と胎児の健康に影響を与えるの確立の重要なステップです。ただし、このプロセスが発生するメカニズムの基礎は完全には理解されていません。細胞遊走は妊娠成立と胎盤の機能に貢献する重要な生物学的プロセスです。胚盤胞移植後, 栄養外胚葉は絨毛トロホブ、絨毛膜絨毛の表面をカバーし、ガスと栄養の交換に関与していると絨毛から移行を外トロホブ (EVTs) に区別します。母体の脱落膜と血管系1に侵入します。EVTs の移行は母体らせん動脈を改造して胎児の成長2をサポートする子宮循環を確立するために不可欠です。妊娠中に不十分な栄養膜浸潤異常胎盤の発育結果し、子癇前症、妊娠高血圧症候群や子宮内の成長の制限、早産3などの妊娠合併症に貢献するかもしれない 4。したがって、絨毛運動に影響を与える要因を理解することは、通常胎盤に必要な経路を決定するのに不可欠です。
胎盤絨毛細胞の移行は、細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、血管新生因子5などの複雑なネットワークによって制御されます。体内の胎盤を勉強の制限のための in vitro アッセイを利用したラインは絨毛運動に寄与する要因を特定することが重要されている絨毛細胞を不死化。傷や浸潤アッセイは、絨毛細胞移行6,7、8に個々 の分子の役割を定量的に評価するため広く使用されています。ただし、タンデム移行の変化を細胞侵襲性の変更によって引き起こされるかもしれない方法を調査するために便利ですが、これらの 2 つの試金は細胞遊走の変更の率に貢献するかもしれない追加のメカニズムを説明しません。たとえば、移行に利用できるより少ないセル細胞増殖率を削減可能性があります。
ここでは、スクラッチ、細胞増殖、細胞浸潤アッセイを使用して栄養移行を評価するための定量体外法について述べる。スクラッチのアッセイで制服傷は単層の細胞で作成され細胞のギャップを埋めるための移動は、創傷サイズの自動、タイムラプス イメージングと創内の細胞の密度で測定します。セル拡散の試金はセルの既知の開始量と比較して各時点でのセルの比率の計算に基づいています。細胞浸潤アッセイの細胞が細胞外マトリックス コート細胞培養挿入室 (例えば Transwell) 上にシードし、化学誘引物質への応答における細胞外マトリックスを介して侵入する細胞数がカウントされます。
スクラッチのアッセイは、細胞の移動に影響を与えるどのように異なる環境条件を決定するために使用可能性がありますシンプルで効果的なツールです。増殖と浸潤アッセイは、続いて細胞増殖と細胞移動の全体的な変化に侵襲性の寄与を決定する使用されるかもしれない。総称して、これらの試金は細胞の運動性に貢献するかもしれない生物的プロセスの堅牢な測定を提供します。2 つの不死化妊娠初期絨毛細胞ラインは説明アッセイ、Swan.71 (Sw.71)、HTR-8/SVneo9,10で使用されました。ただし、これらの試金はキー変調器の細胞の遊走・浸潤を識別する他の細胞型での使用にも最適化可能性があります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

細胞運動は胎盤発育、妊娠初期に絨毛トロホブ ラストの重要なプロパティです。適切な栄養の移行と侵略の意義が母体の血管の不十分な栄養膜浸潤と関連付けられる子癇前症と子宮内の成長の制限など妊娠障害によって実証します。残念ながら、メカニズムの理解、胎盤を移行するから開発されるトロホブは制限。スクラッチのアッセイによる細胞遊走の in vitro 解析は、絨毛渡り鳥容量を規制する要因を識別するに便利なツールです。ただし、本法だけでは変えられた細胞の移動につながる携帯電話の変更を定義しません。このプロトコルは、まとめて使用して絨毛細胞運動を評価する 3 つの異なる体外の試金を記述する: スクラッチ アッセイ、浸潤能の測定と拡散の試金。ここで説明されているプロトコルは、刺激に応じて細胞運動を定量化する他の細胞で使用するため修正されるかもしれません。これらのメソッドは、細胞運動に貢献し、潜在的なメカニズムで細胞変化の徹底的な検査を提供する個々 の要因を識別するために研究者を許可します。

不死化妊娠初期絨毛細胞株 Sw.71 および HTR-8/SVneo は、絨毛細胞移行12グルココルチコイドのロールを確認するこれらの実験で使用されました。グルココルチコイドは、彼ら最近示されている絨毛の機能を変更する代替治療に使用される12の場合がありますので、これらの実験で使用されました。両方の細胞が車両 (1 x PBS) または 100 と...

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In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

ここでは、3 つの生体外の試金を使用して絨毛細胞における細胞運動を評価するため非常にアクセス プロトコルを提案: スクラッチ アッセイ、transwell 浸潤アッセイと細胞増殖アッセイ。

移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

これらの方法は、主要な有害な産科の結果への洞察を提供することができるトロフォ芽細胞の侵略に影響を与える要因を決定するために利用することができます。この技術の利点は、増殖および移動を含むトロホブラストの侵入に影響を与える可能性のあるいくつかの要因の視覚的および定量的分析を提供することです。スクラッチアッセイを開始するには、適切な数の細胞を24ウェルプレートに播種し、48時間で100%合流を達成します。翌日、熱不活性炭デキストラン剥がされたFBSを補ったフェノールレッドフリーメディアにメディアを変更する。スクラッチの日に、各ウェルの培地に所望の治療を加え、細胞を30分間退出させる。均一な創傷を作成するには、創傷メーカーツールのピンに無菌10マイクロリットルピペットチップを置きます。先端を井戸の最初の列に下げ、ピペットの先端が井戸の反対側に届くまで、創傷メーカーのトラックに沿ってプレートを動かします。その後、プレートを開始位置に戻し、ウェルの直径を横切って一定の巻き傷を確保します。井戸の次の行にチップを下げ、すべての井戸が傷つくまで繰り返します。顕微鏡で板を観察して、傷がウェルの幅を覆っていることを確認します。次に、慎重に培地を吸引し、1x PBSで細胞を2回軽く洗います。最後の洗浄の後、補充されたフェノール赤を無料で剥がしたり、所望の処置で低FBS培地を加えます。次に、温度37°C、湿度95%の雰囲気で5%の二酸化炭素を含むインキュベーターに収容された自動タイムラプスイメージャーに、傷ついた井戸を持つプレートを置きます。細胞が創傷治癒を完了できるように、必要に応じて一定の間隔で細胞を画像化します。侵入アッセイを開始するには、摂氏温度37°C、湿度95%の雰囲気で5%の二酸化炭素を維持するインキュベーターで、適切な数の細胞を6ウェルプレートに播種します。細胞が48時間で90%の合流に達することを許可する。翌日、熱不活性炭デキストラン剥がされたFBSを補ったフェノールレッドフリーメディアにメディアを変更する。氷の上の冷蔵庫にミリリットル細胞外マトリックスあたり10ミリグラムのバイアルを置き、一晩解凍してみましょう。翌日には、冷やしたピペットチップを使用して、フェノールレッドフリー血清フリー培地で細胞外マトリックス1ミリリットル当たり10ミリグラムを1ミリリットル当たり5ミリグラムの最終濃度まで希釈する。その後、希釈した細胞外マトリックスの100ミリリットルを、冷蔵24ウェルプレートに入れたチルドインサートに加えます。プレートを37°Cでインキュベートし、マトリックスを硬化させます。細胞を浸潤アッセイ用に準備するには、1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。その後、PBSを吸引し、各ウェルに1xトリプシンEDTAの500マイクロリットルを追加します。すべての細胞がプレートの底から剥離するまで、摂氏37度の温度と湿度95%の雰囲気で5%の二酸化炭素を維持するインキュベーターに6ウェルプレートを置きます。細胞が剥離したら、500マイクロリットルのフェノールレッドフリー血清培地をトリプシン化した細胞の各ウェルに添加する。その後、1,000マイクロ遠心分離チューブに1,000マイクロリットルの切り離された細胞を移し、摂氏4度で400倍gで5分間スピンダウンします。次に、培地を吸引し、フェノールレッドフリー血清フリー培地中の細胞を再懸濁する。自動化されたセルカウンターを使用して細胞を数え、1ミリリットル当たり0.5百万細胞の最終的な濃度のために細胞懸濁液の体積を調整する。24ウェルプレートの各ウェルに完全な成長培地の600マイクロリットルを追加し、それに事前にコーティングされたインサートを置きます。その後、各プレコーティングされたセルインサートの上に200マイクロリットルの細胞を追加し、合計0.10万個の細胞を挿入します。摂氏温度37度、湿度95%の雰囲気で24時間、24ウェルプレートをインキュベーターに入れます。一晩のインキュベーションの後、細胞外マトリックスを乱すことなく、上部および下部のチャンバーから残りの培地を吸引する。次に、綿棒でインサートの上部から細胞外マトリックスと非侵入細胞を慎重に除去します。ウェルの上下のチャンバーに1x PBSを加えて各インサートを3回洗います。各洗浄後にPBSを吸引する。挿入物に取り付けられた細胞を固定するには、挿入物を摂氏4度の冷たいメタノール100%に30分間置きます。1x PBSで3回挿入し、最終洗浄後にPBSを取り除きます。20%エタノール中に0.2%の結晶バイオレットを10分間用いった挿入物に付着した細胞を染色する。脱イオン水で3回リンスし、最後の洗浄後に脱イオン水を吸引します。空気乾燥挿入物を室温で1時間挿入します。最後に鉗子とカミソリの刃を使用して、慎重に挿入物の底膜を切断し、底側を上に向けたガラススライドに取り付けます。20Xの目的を有する軽顕微鏡を用いて、サンプル当たり浸入細胞の少なくとも4つのユニークな画像を得る。増殖アッセイを開始するには、フラスコからトリプシン化された細胞を数えるために、自動化された細胞カウンターを使用する。標準的な成長培地で1ウェルあたり0.2百万個の細胞の密度で6ウェルプレートに細胞を播種します。その後、摂氏温度37度、湿度5%の雰囲気で5%の二酸化炭素を維持するインキュベーターに細胞を4時間、または細胞が付着するまで置きます。次に、熱不活性炭デキストラン剥がされたFBSおよび所望の処理を加えたフェノールレッドフリー培地に培地を変更する。摂氏温度37度、湿度95%の雰囲気で5%の二酸化炭素を維持するインキュベーターに6ウェルプレートを入れます。その後、48時間ごとに所望の治療で補充された新鮮な培地でメディアを交換してください。24、48、または72時間の処理の後、1x PBSの1ミリリットルで細胞を洗浄し、各ウェルに500マイクロリットルのトリプシンEDTAを加える。細胞がプレートから剥離するまで、インキュベーターに6ウェルプレートを入れる。細胞がプレートから剥離したら、補充されたフェノールレッドフリー培地の500マイクロリットルを加えてトリプシンを無効にします。最後に、トリプシン化された細胞の5マイクロリットルを別のチューブのトリパンブルーの5マイクロリットルに加え、ピペットで混合します。自動セル カウンターを使用して、重複する各ウェルからセルをカウントします。不滅の人間の最初の三半期の栄養芽球白鳥。71個の細胞を、スクラッチアッセイ中の合成グルココルチコイドデキサメタゾンの1xPBSまたは100マイクロモルの車両1x PBSまたは100マイクロモルで18時間処理した。白鳥の創傷の大きさおよび創傷の密度の測定。71およびHTR-8/SVneo細胞は、車両または100ナノモルデックスで処理され、デックス治療が創傷閉鎖率を低下させ、グルココルチコイドが細胞遊動を阻害する可能性があることを示した。侵襲アッセイに続いて、グルココルチコイド治療は、浸潤した白鳥の数を15%減少させることによって示されるように細胞侵襲性を低下させた。71およびHTR-8/SVneo細胞は、車両で処理された細胞と比較して24時間100ナノモルデックスで処理した。細胞増殖アッセイに続いて、グルココルチコイド治療は、より少ない白鳥によって示されるように細胞増殖を減少させた。71およびHTR-8/SVneo細胞は、車両で処理された細胞と比較して100ナノモルデックスで処理した。細胞死を評価する方法は、アポトーシスまたは壊死が変化した栄養芽細胞機能に寄与するかどうかを判断するために、この手順と組み合わせて使用することができる。私たちは、栄養芽細胞機能の研究のために癌生物学で日常的に使用される標準的な技術の使用を独自に採用してきました。これらの方法に関連する危険はありません。視聴者が取るべき唯一の予防措置は、組織培養のための滅菌技術を使用することです.

Research

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