Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Gil Mor for å gi Sw.71 cellene. Denne forskningen ble støttet av en Albert McKern Scholar Award for S.W.

1. celle forberedelse
<ol><li>Vedlikeholde celler i T-75 flasker i standard vekst medier på 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet. Merk: Cellene som brukes i disse eksperimentene ble den udødeliggjort første trimester trophoblast cellen linjer Swan.71 (Sw.71) og halv-st-8/SVneo9,10. Sw.71 cellene ble opprettholdt i DMEM/F-12 med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS), 1.0 mM natrium pyruvate, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM ikke-essensi...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+implantation+and+placentation:+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications.">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li><li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia.">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li><li>Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion.">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li><li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#x3b1;-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8/SVneo+Trophoblast+Cells.">TNF&#x3b1;-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li><li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion.">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li><li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+(MMP)-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy.">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li><li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line,+Swan+71.">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li><li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan.">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71.">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).</li><li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

Denne prosedyren bygger på bruk av migrasjon og invasjonen analyser med frekvensen av celle spredning som potensielle bidragsyter til målt forskjeller i trophoblast celle bevegelse. Brukes sammen, er disse in vitro analyser enkle og effektive metoder som kan brukes til å identifisere mobilnettet veier som regulerer trophoblast overføring. Som beskrevet ovenfor, kan trophoblast cellene behandles med hormoner, cytokiner, vekstfaktorer eller andre molekyler å avgjøre deres innvirkning på trophoblast bevegelse. Eventu...

Placental utvikling er et viktig skritt i etableringen av graviditet, påvirker både mors og fosterets helse. Imidlertid er mekanistisk grunnlaget som dette skjer ikke fullt ut forstått. Celle migrasjon er en viktig biologisk prosess som bidrar til etablering og funksjoner av morkaken under graviditeten. Etter blastocysten implantasjon skiller trophectoderm villous trophoblasts, som dekker overflaten av chorion villi, og er involvert i gass og næringsstoffer exchange, og extravillous trophoblasts (EVTs), som migrerer ut fra villi og invadere mors decidua og blodkar1. Migrering av EVTs er viktig for ombygging mors spiral arterier og etablere uteroplacental sirkulasjon for å støtte fetal vekst2. Utilstrekkelig trophoblast invasjon under graviditet resulterer i unormal placental utvikling og kan bidra til graviditet komplikasjoner som preeclampsia, svangerskapsdiabetes hypertensjon, intrauterin vekst begrensning og tidlig fødsel3, 4. Derfor er forstå faktorene som påvirker trophoblast motilitet avgjørende å bestemme veier kreves for vanlig placentation.
Trophoblast overføring styres av et kompleks nettverk av signalnettverk molekyler, inkludert vekstfaktorer, cytokiner, hormoner og angiogenic faktorer5. På grunn av begrensningene av studere morkaken i vivo, in vitro analyser utnytte udødeliggjort menneskelige trophoblast celle linjene er avgjørende for å identifisere faktorer som bidrar til trophoblast motilitet. Bunnen og invasjonen analyser har vært brukt mye til kvantitativt vurdere rollen molekyler på trophoblast celle migrasjon6,7,8. Men mens nyttig i tandem å undersøke hvordan endringer i migrasjon kan forårsakes av endringer i celle invasiveness, høyde disse to analyser ikke for ytterligere mekanismer som kan bidra til endrede priser av celle migrasjon. For eksempel kan reduksjoner til frekvensen av celle spredning resultere i færre celler tilgjengelige for overføring.
Her beskriver vi kvantitative i vitro metoder for å vurdere trophoblast overføring ved hjelp av bunnen, celle spredning og celle invasjonen analyser. Et ensartet sår er opprettet i en celle monolayer i scratch analysen, og migrering av celler å fylle gapet er målt ved automatisert, time-lapse avbildning av såret og tetthet av celler i såret. Celle spredning analysen er basert på beregning av forholdet mellom cellene på hvert punkt i forhold til en kjent start antall celler. I celle invasjonen analysen, celler er seeded oppå en ekstracellulær matrix-belagt celle kultur sett inn kammer (f.eks Transwell) og antall celler som invaderer gjennom den ekstracellulære matrisen svar chemo-attractant telles.
Scratch analysen er et enkelt og effektivt verktøy som kan brukes til å bestemme hvordan ulike miljømessige forhold påvirker celle migrasjon. Spredning og invasjonen analyser kan senere brukes til å finne ut bidrag av celle spredning og invasiveness for generelle endringer i celle migrasjon. Samlet gir disse analyser robust målinger av biologiske prosesser som kan bidra til celle motilitet. To udødeliggjort første trimester trophoblast linjer ble brukt i beskrevet analyser, Swan.71 (Sw.71) og halv-st-8/SVneo9,10. Men kan disse analyser også være optimalisert for bruk i andre celletyper å identifisere viktige modulatorer av celle migrasjon og invasjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

Cellen bevegelse er en kritisk egenskap for trophoblasts under placental utvikling og tidlig i svangerskapet. Betydningen av riktig trophoblast overføring og invasjonen er demonstrert av graviditet lidelser som svangerskapsforgiftning og intrauterine vekst begrensning, som er forbundet med utilstrekkelig trophoblast invasjon av mors blodkar. Dessverre vår forståelse av mekanismer som morkaken utvikler seg fra overføring av trophoblasts er begrenset. In vitro analyser av celle migrasjon via scratch analysen er et nyttig verktøy i å identifisere faktorer som regulerer trophoblast trekkfugler kapasitet. Denne analysen alene definerer imidlertid ikke mobilnettet endringene kan føre til endrede celle migrasjon. Denne protokollen beskriver tre forskjellige in vitro analyser som brukes kollektivt å evaluere trophoblast celle bevegelse: scratch analysen, analysen invasjon og spredning analysen. Protokollene beskrevet her kan også endres for bruk i andre linjer å kvantifisere celle bevegelse i respons på stimuli. Disse metodene kan etterforskerne å identifisere individuelle faktorer som bidra til celle bevegelsen og gir en grundig undersøkelse av potensielle mekanismene bak tydelig endringer i celle migrasjon.

Cellelinjer udødeliggjort menneskelige første trimester trophoblast Sw.71 og halv-st-8/SVneo ble brukt i disse eksperimentene for å bestemme rollen glukokortikoider i trophoblast celle migrasjon12. Glukokortikoider ble brukt i disse eksperimentene som de har nylig vist å endre trophoblast funksjoner, selv om alternative behandlinger kan være brukt12. Begge linjer ble behandlet med kjøretøy (1 x PBS) eller 100 nM av syntetisk glukokort...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Her presenterer vi en svært tilgjengelig protokoll for å vurdere celle bevegelsen i menneskelig trophoblast celler ved hjelp av tre in vitro analyser: scratch analysen, transwell invasjon analysen og celle spredning analysen.

I Vitro analyser evaluere overføringen, invasjon og spredning av udødeliggjort menneskelige første trimester Trophoblast linjer

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Disse metodene kan benyttes til å bestemme faktorer som påvirker trofoblastinvasjonen som kan gi innsikt i store uønskede obstetriske resultater. Fordelen med denne teknikken er at den gir en visuell og kvantitativ analyse av flere faktorer som kan påvirke trofoblastinvasjonen, inkludert spredning og migrasjon. For å begynne ripeanalysen, frø riktig antall celler i en 24-brønnsplate for å oppnå 100% samløpet i 48 timer.Neste dag, endre media til fenol røde frie medier supplert med varme inaktivert kull dextran strippet FBS. På opp scratchdagen legger du til ønsket behandling til media i hver brønn for å forbehandle cellene i 30 minutter. For å lage ensartede sår, plasser sterile 10 mikroliter pipettespisser på pinnene på sårmakerverktøyet.Senk spissene ned i den første raden med brønner og flytt platen langs sporet til sårmakeren til pipettespissene når den andre siden av brønnen. Flytt deretter platen tilbake til startposisjonen for å sikre konstant sår over diameteren på brønnen. Senk spissene ned i neste brønnrad og gjenta til alle brønnene er riper.Bekreft at ripen dekker bredden på brønnen ved å observere platen under et mikroskop. Deretter aspirerer du forsiktig mediet og vasker forsiktig cellene med 1x PBS to ganger. Etter en siste vask, legg til supplert fenol rød fri strippet eller lav FBS media med en ønsket behandling.Deretter plasserer du platen med de ripede brønnene i en automatisert timelapse imager plassert i en inkubator som inneholder 37 grader Celsius temperatur og 5% karbondioksid ved 95% fuktighet atmosfære. Bilde cellene med jevne mellomrom etter behov for å tillate celler å fullføre sårheling. For å starte invasjonsanalysen, frø riktig antall celler i seks-brønns plater i en inkubator som opprettholder 37 grader Celsius temperatur og 5% karbondioksid ved 95% fuktighet atmosfære.Tillat celler å nå 90% samløpet i 48 timer. Neste dag, endre media til fenol røde frie medier supplert med varme inaktivert kull dextran strippet FBS. Legg et hetteglass med 10 milligram per milliliter ekstracellulær matrise i kjøleskap på is og la det tine over natten.Dagen etter, bruk kjølte pipettespisser for å fortynne 10 milligram per milliliter av den ekstracellulære matrisen med fenolrødt serumfritt medium til en endelig konsentrasjon på fem milligram per milliliter. Tilsett deretter 100 milliliter av den fortynnede ekstracellulære matrisen til kjølte innsatser som er plassert i den avkjølte 24-brønnsplaten. Inkuber platen ved 37 grader Celsius slik at matrisen kan herdes.For å forberede celler for invasjonsanalysen, vask celler med en milliliter 1x PBS. Deretter aspirerer PBS og legger til 500 mikroliter med 1x Trypsin EDTA til hver brønn. Plasser seksbrønnsplaten i inkubatoren som opprettholder 37 grader Celsius temperatur og 5% karbondioksid ved 95% fuktighet atmosfære til alle celler har løsnet fra bunnen av platen.Når cellene har løsnet, legg til 500 mikroliter av fenolrødt serumfritt medium til hver brønn av de trypsiniserte cellene. Deretter overfører du 1000 mikroliter av frittliggende celler til et mikrocentrifugerør og spinner ned i fem minutter ved 400 ganger g ved fire grader Celsius. Deretter aspirerer media og resuspend cellene i fenol rød fri serum gratis media.Telle celler ved hjelp av en automatisert celle teller og justere volumet av cellen suspensjon for en endelig konsentrasjon på 0,5 millioner celler per milliliter. Tilsett 600 mikroliter av hele vekstmediet til hver brønn av den 24-brønns platen og plasser den forhåndsbelagte innsatsen i den. Legg deretter til 200 mikroliter celler på toppen av hver forhåndsbelagte celleinnsats for totalt 0,1 millioner celler.Plasser 24-brønnsplaten i inkubatoren som opprettholder 37 grader Celsius temperatur og 5% karbondioksid ved 95% fuktighet atmosfære i 24 timer. Etter inkubasjon over natten, suge de resterende mediene fra de øvre og nedre kamrene uten å forstyrre den ekstracellulære matrisen. Fjern deretter forsiktig den ekstracellulære matrisen og ikke-invaderte celler fra den øvre delen av innsatsene med en bomullspinne.Vask hver innsats tre ganger ved å legge til 1x PBS til både øvre og nedre kamre i brønnen. Aspirer PBS etter hver vask. For å fikse celler festet til innsatsene, plasser innsatsene i 100% iskald metanol ved fire grader Celsius i 30 minutter.Vask innsatsen tre ganger med 1x PBS og fjern PBS etter den endelige vasken. Beis cellene festet til innsatsene med 0,2% krystallfiolett i 20% etanol i 10 minutter. Skyll med deionisert vann tre ganger og aspirer deionisert vann etter den endelige vasken.Lufttørre innsatser ved romtemperatur i en time. Til slutt ved hjelp av tang og et barberblad, kutt forsiktig den nederste membranen på innsatsen og monter den på et glasssklie med bunnen vendt opp. Ved hjelp av et lett mikroskop med et 20X-mål, få minst fire unike bilder av de invaderte cellene per prøve.For å starte spredningsanalysen, bruk en automatisert celleteller til å telle de trypsiniserte cellene fra kolben. Frøceller i seksbrønnsplater med en tetthet på 0,2 millioner celler per brønn i standard vekstmedier. Plasser deretter celler i inkubatoren som opprettholder 37 grader Celsius temperatur og 5% karbondioksid ved 95% fuktighetsmosfære i fire timer eller til cellene har holdt seg.Deretter endrer du media til fenol røde frie medier supplert med varme inaktivert kull dextran strippet FBS og ønsket behandling. Plasser seksbrønnsplaten i inkubatoren som opprettholder 37 grader Celsius temperatur og 5% karbondioksid ved 95% fuktighet atmosfære. Deretter erstattes mediene med de friske mediene supplert med ønsket behandling hver 48.Etter 24, 48 eller 72 timers behandling, vask celler med en milliliter 1x PBS og tilsett 500 mikroliter Trypsin EDTA til hver brønn. Plasser en seksbrønnsplate i inkubatoren til cellene har løsnet fra platen. Når cellene har løsnet fra platen, tilsett 500 mikroliter av det supplerte fenolrøde frie mediet for å deaktivere Trypsin.Til slutt legger du til fem mikroliter av de trypsiniserte cellene til fem mikroliter trypan blå i et eget rør og bland ved pipettering. Bruk en automatisert celleteller til å telle celler fra hver brønn i duplikat. Udødeliggjort menneskelig første trimester trophoblast Swan.71 celler ble behandlet i null, åtte og 18 timer med kjøretøy 1x PBS eller 100 mikromos av syntetisk glukokortikoid deksametason i scratch analysen. Måling av sårstørrelsen og sårtettheten i Svanen. 71- og HTR-8/SVneo-celler behandlet med kjøretøy eller 100 nanomolardex viste at deksbehandling reduserte frekvensen av sårlukking som indikerer at glukokortikoider kunne hemme cellemigrasjon.Etter invasjonsanalysen reduserte glukokortikoidbehandling celleinvasivitet som vist ved en 15% reduksjon i antall invaderte Swan. 71- og HTR-8/SVneo-celler behandlet med 100 nanomolardex i 24 timer sammenlignet med celler behandlet med kjøretøy. Etter cellespredningsanalysen reduserte glukokortikoidbehandling cellespredning som indikert av færre svaner.71 og HTR-8/SVneo celler behandlet med 100 nanomolar dex sammenlignet med celler behandlet med kjøretøy. Metoder for å evaluere celledød kan brukes sammen med denne prosedyren for å avgjøre om apoptose eller nekrose bidrar til endrede trofoblastfunksjoner. Vi har unikt vedtatt bruk av standard teknikker som rutinemessig brukes i kreftbiologi for studiet av trophoblastfunksjon.Det er ingen farer forbundet med disse metodene. Den eneste forholdsregelen seerne bør ta er å bruke steril teknikk for vevskultur.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Produksjon og bruk av Lentivirus til Selektivt transduce Primær oligodendrocyte forløper celler for<em&gt; In Vitro</em&gt; myelination Analyser

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Vurdering av Maternal vaskulær remodelle under graviditeten i Mouse Livmor

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Etablering av Genome-redigerte Menneskelig Pluripotent Stem Cell Lines: Fra Targeting å Isolering

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiere Differensiering i udødeligmultipotente Otic stamceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Utvikling av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay å evaluere kontraktile funksjon av mesenchymalceller som gjennomgikk Epitelial-Mesenchymale Overgangs

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Menneskelig Primær trophoblast? Trophoblast Cell Culture modell for å studere den beskyttende effekten av melatonin mot Hypoksi / Reoksygeneringen-indusert Forstyrrelse

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC prikkblot-analyse Kvantifisering av DNA-metyleringsnivået av kondrocyt-diffusjon<em&gt; I Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Hornhinnen Tissue Engineering: En In Vitro modell av Stromal-nerve samspillet av menneskelig hornhinnen

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle aggregering analyser evaluere bindingen Drosophila hakket med Trans-ligander og dens hemming av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...