Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
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Os autores agradecer Dr. Gil Mor para fornecer as células Sw.71. Esta pesquisa foi apoiada por um Albert McKern Scholar Award para S.W.

1. preparação da pilha
<ol><li>Manter as células em frascos de T-75 em meios de crescimento padrão em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade. Nota: As células utilizadas nesses experimentos foram o imortalizado linhas de células do trofoblasto primeiro trimestre Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. As células de Sw.71 foram mantidas em DMEM/F-12, suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), piruvato de ...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

Este procedimento baseia-se na utilização de migração e invasão ensaios para incluir a taxa de proliferação celular, como um contribuinte potencial medidos diferenças no movimento de células do trofoblasto. Usados em conjunto, estes ensaios in vitro são métodos simples e eficazes que podem ser usados para identificar os caminhos celulares que regulam a migração do trofoblasto. Conforme descrito acima, as células do trofoblasto podem ser tratadas com hormonas, citocinas, fatores de crescimento ou outras mol?...

Desenvolvimento da placenta é um passo crucial no estabelecimento da gravidez, impactando a saúde materna e fetal. No entanto, a base mecanicista, pelo qual este processo ocorre não é totalmente compreendida. Migração celular é um importante processo biológico que contribui para a criação e funções da placenta durante a gravidez. Após a implantação do blastocisto, a trofectoderma diferencia em trophoblasts das vilosidades, que cobrem a superfície das vilosidades coriônica e estão envolvidos em gás e troca de nutrientes, e extravillous trophoblasts (eventos), que migram para fora das vilosidades e invadem a decídua e a vasculatura materna1. Migração dos eventos é essencial para a remodelação artérias espiral materna e o estabelecimento de circulação uteroplacentária para apoiar o crescimento fetal2. Invasão do trofoblasto inadequada durante a gravidez, resulta em um desenvolvimento anormal da placenta e pode contribuir para complicações da gravidez como pré-eclâmpsia, hipertensão gestacional, restrição de crescimento intra-uterino e parto prematuro3, 4. Portanto, compreender os fatores que afetam a motilidade do trofoblasto é essencial para determinar os caminhos necessários para placentação normal.
Migração do trofoblasto é controlada por uma complexa rede de sinalização moléculas, incluindo fatores de crescimento, citocinas, hormônios e fatores de angiogênico5. Devido às limitações do estudo in vivo da placenta, ensaios in vitro utilizando imortalizadas células do trofoblasto humano linhas foram cruciais para a identificação dos factores que contribuem para a mobilidade do trofoblasto. Zero e invasão de ensaios têm sido amplamente utilizados para avaliar quantitativamente o papel das moléculas individuais no trofoblasto celular migração6,7,8. No entanto, embora útil em tandem para investigar como mudanças na migração podem ser causadas por alterações na capacidade de invasão celular, estes dois ensaios não representam mecanismos adicionais que podem contribuir para as taxas alteradas de migração celular. Por exemplo, reduções para a taxa de proliferação celular podem resultar em menos células disponíveis para migrar.
Aqui, descrevemos quantitativos métodos in vitro para avaliar a migração do trofoblasto usando zero, proliferação celular e ensaios de invasão celular. No ensaio de zero, uma ferida uniforme é criada em uma monocamada de células, e a migração de células para preencher a lacuna é medida pela imagem automatizada, lapso de tempo do tamanho da ferida e densidade de células dentro da ferida. O ensaio de proliferação celular é baseado no cálculo do rácio de células em cada ponto de tempo em comparação com uma quantidade conhecida de partida de células. No ensaio de invasão celular, células são semeadas no topo de uma câmara de inserção de cultura celular revestido de matriz extracelular (por exemplo, Transwell), e o número de células que invadem através da matriz extracelular em resposta a quimioterapia-attractant é contado.
O risco é uma ferramenta simples e eficaz que pode ser usada para determinar como diferentes condições ambientais afetam a migração celular. Os ensaios de proliferação e invasão posteriormente podem ser usados para determinar a contribuição da proliferação celular e invasividade para mudanças globais na migração celular. Coletivamente, estes ensaios fornecem medidas robustas de processos biológicos que podem contribuir para a motilidade celular. Duas linhas de célula imortalizado primeiro trimestre trofoblasto foram utilizadas nos ensaios descritos, Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. No entanto, estes ensaios também podem ser otimizados para uso em outros tipos de células para identificar a chaves moduladores de migração celular e invasão.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

Movimento de célula é uma propriedade crítica de trophoblasts durante o desenvolvimento da placenta e gravidez precoce. O significado do trofoblasto adequada migração e invasão é demonstrado por distúrbios da gravidez, tais como restrição de crescimento intra-uterino e de pré-eclâmpsia, que são associados com a invasão do trofoblasto inadequada da vasculatura materna. Infelizmente, nossa compreensão dos mecanismos por que a placenta se desenvolve a partir de migração de trophoblasts é limitado. Análise in vitro da migração celular através de ensaio de risco é uma ferramenta útil na identificação de fatores que regulam a capacidade migratória trofoblasto. No entanto, este ensaio sozinho não define as alterações celulares que podem resultar em migração de célula alterada. Este protocolo descreve três diferentes ensaios in vitro são usados coletivamente para avaliar o movimento de células do trofoblasto: o risco do ensaio, o ensaio de invasão e o ensaio de proliferação. Os protocolos descritos aqui também podem ser modificados para uso em outras linhas de célula para quantificar o movimento de célula em resposta a estímulos. Estes métodos permitem que os investigadores identificar fatores individuais que contribuem para o movimento da célula e fornecem uma análise exaustiva dos potenciais mecanismos subjacentes alterações aparentes na migração celular.

As linhas de célula humana imortalizado primeiro trimestre trofoblasto Sw.71 e HTR-8/SVneo foram utilizadas nesses experimentos para determinar o papel de glicocorticoides no trofoblasto celular migração12. Os glicocorticoides foram utilizados nesses experimentos como eles recentemente foram mostrados para alterar funções de trofoblasto, embora tratamentos alternativos podem ser usados12. Ambas as linhas de célula foram tratadas com ve...

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In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Aqui, apresentamos um protocolo altamente acessível para avaliar o movimento de célula em células do trofoblasto humana usando três ensaios in vitro: ensaio de zero, o ensaio de invasão transwell e o ensaio de proliferação celular.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Esses métodos podem ser utilizados para determinar fatores que influenciam a invasão do trophoblasto que pode fornecer insights sobre os principais desfechos obstétricos adversos. A vantagem dessa técnica é que ela fornece uma análise visual e quantitativa de vários fatores que podem influenciar a invasão do trophoblasto, incluindo a proliferação e a migração. Para iniciar o ensaio de arranhões, semear o número apropriado de células em uma placa de 24 poços para alcançar 100% de confluência em 48 horas.No dia seguinte, mude a mídia para fenol red free media complementada com calor inativado carvão dextran despojado FBS. No dia do arranhão, adicione o tratamento desejado à mídia em cada poço para pré-trar as células por 30 minutos. Para criar feridas uniformes, coloque as pontas de pipeta de 10 microliter estéreis nos pinos da ferramenta fabricante de feridas.Abaixe as pontas para a primeira linha de poços e mova a placa ao longo da pista do fabricante da ferida até que as pontas da pipeta cheguem ao outro lado do poço. Em seguida, mova a placa de volta para a posição inicial para garantir a ferida constante através do diâmetro do poço. Abaixe as pontas para a próxima linha de poços e repita até que todos os poços estejam riscados.Confirme se o arranhão cobre a largura do poço observando a placa sob um microscópio. Em seguida, aspire cuidadosamente a mídia e lave suavemente as células com 1x PBS duas vezes. Após uma lavagem final, adicione fenol vermelho complementado livre de strip ou baixa mídia FBS com um tratamento desejado.Em seguida, coloque a placa com os poços riscados em um imager timelapse automatizado alojado em uma incubadora que contém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade. Imagem das células em intervalos regulares, conforme necessário, para permitir que as células completem a cicatrização da ferida. Para iniciar o ensaio de invasão, semeou o número apropriado de células em placas de seis poços em uma incubadora que mantém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade.Permitir que as células atinjam 90% de confluência em 48 horas. No dia seguinte, mude a mídia para fenol red free media complementada com calor inativado carvão dextran despojado FBS. Coloque um frasco de 10 miligramas por matriz extracelular mililitro em uma geladeira no gelo e deixe descongelar durante a noite.No dia seguinte, use pontas de pipeta geladas para diluir 10 miligramas por mililitro da matriz extracelular com a mídia livre de soro vermelho fenol para uma concentração final de cinco miligramas por mililitro. Em seguida, adicione 100 mililitros da matriz extracelular diluída às pastilhas resfriadas que foram colocadas na placa de 24 poços refrigerados. Incubar a placa a 37 graus Celsius para permitir que a matriz endureça.Para preparar células para o ensaio de invasão, lave as células com um mililitro de 1x PBS. Em seguida, aspire o PBS e adicione 500 microliters de 1x Trypsin EDTA a cada poço. Coloque a placa de seis poços na incubadora que mantém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade até que todas as células tenham se separado da parte inferior da placa.Uma vez que as células tenham se destacado, adicione 500 microliters da mídia livre de soro vermelho fenol a cada poço das células experimentadas. Em seguida, transfira 1.000 microliters de células separadas para um tubo de microcentrífuga e gire por cinco minutos a 400 vezes g a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire a mídia e resuspend as células na mídia livre de soro vermelho fenol.Conte as células usando um contador celular automatizado e ajuste o volume da suspensão celular para uma concentração final de 0,5 milhões de células por mililitro. Adicione 600 microliters da mídia de crescimento completo a cada poço da placa de 24 poços e coloque a inserção pré-revestida nele. Em seguida, adicione 200 microliters de células em cima de cada inserção celular pré-revestida para um total de 0,1 milhões de células.Coloque a placa de 24 poços na incubadora que mantém temperatura de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade por 24 horas. Após a incubação durante a noite, sucção a mídia restante das câmaras superior e inferior sem perturbar a matriz extracelular. Em seguida, remova cuidadosamente a matriz extracelular e as células não invadidas da porção superior das pastilhas com um cotonete.Lave cada inserção três vezes adicionando 1x PBS às câmaras superior e inferior do poço. Aspirar PBS após cada lavagem. Para fixar as células presas às pastilhas, coloque as pastilhas em metanol frio 100% gelado a quatro graus Celsius por 30 minutos.A lavagem insere três vezes com 1x PBS e remova o PBS após a lavagem final. Colorir as células presas às pastilhas com violeta 0,2% cristalina em 20% de etanol por 10 minutos. Enxágüe com água deionizada três vezes e aspirar água deionizada após a lavagem final.O ar seco se insere à temperatura ambiente por uma hora. Finalmente usando fórceps e uma lâmina de barbear, corte cuidadosamente a membrana inferior da inserção e monte-a em uma lâmina de vidro com o lado inferior voltado para cima. Usando um microscópio leve com um objetivo de 20X, obtenha pelo menos quatro imagens únicas das células invadidas por amostra.Para iniciar o ensaio de proliferação, use um contador automatizado de células para contar as células experimentadas do frasco. Células de sementes em placas de seis poços a uma densidade de 0,2 milhões de células por poço em mídia de crescimento padrão. Em seguida, coloque as células na incubadora que mantém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono em atmosfera de 95% de umidade por quatro horas ou até que as células tenham aderido.Em seguida, mude a mídia para fenol red free free complementada com o dextran de carvão inativado de calor e tratamento desejado. Coloque a placa de seis poços na incubadora que mantém temperatura de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade. Em seguida, substitua a mídia pela mídia fresca complementada com o tratamento desejado a cada 48 horas.Após 24, 48 ou 72 horas de tratamento, lave as células com um mililitro de 1x PBS e adicione 500 microliters de Trypsin EDTA a cada poço. Coloque uma placa de seis poços na incubadora até que as células se despem da placa. Uma vez que as células tenham se separado da placa, adicione 500 microliters da mídia livre de fenol complementado para desativar a Trippsina.Finalmente adicione cinco microliters das células experimentadas a cinco microliters de Trypan Blue em um tubo separado e misture por pipetação. Use um contador automatizado de células para contar células de cada poço em duplicata. Imortalizado humano no primeiro trimestre trophoblast Cisne.Foram tratadas 71 células durante zero, oito e 18 horas com veículo 1x PBS ou 100 micromolar da dexametasona glicocorticoide sintética no ensaio de arranhões. Medição do tamanho da ferida e da densidade da ferida em Cisne. 71 e células HTR-8/SVneo tratadas com veículo ou 100 dex nanomolar mostraram que o tratamento dex reduziu a taxa de fechamento da ferida indicando que glicocorticoides poderiam inibir a migração celular.Após o ensaio de invasão, o tratamento glicocorticoide reduziu a invasividade celular, como mostra uma redução de 15% no número de cisnes invadidos. 71 e células HTR-8/SVneo tratadas com 100 dex nanomolar por 24 horas em comparação com células tratadas com veículo. Após o ensaio de proliferação celular, o tratamento glicocorticoide reduziu a proliferação celular, como indicado por menos Cisne.71 e células HTR-8/SVneo tratadas com 100 dex nanomolar em comparação com células tratadas com veículo. Métodos para avaliar a morte celular poderiam ser usados em conjunto com este procedimento para determinar se apoptose ou necrose contribuem para funções de trophoblasto alteradas. Adotamos exclusivamente o uso de técnicas padrão rotineiramente utilizadas na biologia do câncer para o estudo da função trophoblast.Não há riscos associados a esses métodos. A única precaução que os espectadores devem tomar é usar técnica estéril para cultura tecidual.

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Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...