Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

Авторы благодарят д-р Хиль Mor за предоставление Sw.71 клеток. Это исследование было поддержано Маккерн Альберт ученый награда с.в.

1. Подготовка клетки
<ol><li>Поддержания клеток в колбах T-75 в средствах массовой информации стандартного роста при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности. Примечание: Клетки, используемые в этих экспериментов были увековечен Swan.71 (Sw.71) и HTR-8/SVneo9,10линий клеток...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+implantation+and+placentation:+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications.">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li><li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia.">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li><li>Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion.">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li><li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#x3b1;-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8/SVneo+Trophoblast+Cells.">TNF&#x3b1;-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li><li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion.">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li><li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+(MMP)-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy.">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li><li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line,+Swan+71.">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li><li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan.">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71.">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).</li><li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

Эта процедура основывается на использовании миграции и вторжения анализов включить скорость пролиферации клеток как потенциальный вклад измеренных различия в движение клеток трофобласта. Вместе, эти в пробирке тестов используются простые и эффективные методы, которые могут использ?...

Плацентарный развития представляет собой решающий шаг в создании беременности, влияющие на здоровье матери и плода. Однако механистический основы, в которой происходит этот процесс полностью не поняты. Клетки миграция является важным биологическим процессом, который способствует создание и функции через плаценту во время беременности. После имплантации бластоцисты трофоэктодерму дифференцирует ворсинчатых трофобласты, которые покрывают поверхность хорионического ворсинки и участвуют в газ и обмен питательных веществ, и extravillous трофобласты (EVTs), которые мигрируют из от Вилли и вторгнуться материнской decidua и сосудистую1. Миграция EVTs имеет важное значение для реконструкции материнской спиральных артерий и создания uteroplacental циркуляции для поддержки роста плода2. Неадекватные трофобласта вторжения во время беременности приводит к плацентарных аномалии развития и может способствовать осложнений беременности, таких как преэклампсия, гестационного гипертензии, ограничение внутриутробного роста и преждевременных родов3, 4. Таким образом понимание факторов, которые влияют на трофобласта моторики имеет важное значение для определения путей, необходимых для нормального плацентации.
Трофобласта миграции контролируется сложной сети сигнальных молекул, включая факторы роста, цитокины, гормоны и ангиогенных факторов5. Из-за ограничений исследования плаценты в естественных условиях в пробирке анализов используя увековечен человека трофобласта клеток линии имели решающее значение для выявления факторов, способствующих подвижности трофобласта. Царапин и вторжения анализы широко использовались для количественной оценки роли отдельных молекул на трофобласта клеток миграции6,,78. Однако хотя и является полезным в тандеме, чтобы исследовать, как изменения в миграции может быть вызвано изменениями в ячейке инвазивность, эти два анализов не учитывают дополнительные механизмы, которые могут способствовать изменены показатели миграции клеток. Например сокращение скорости пролиферации клеток может привести к меньшее количество ячеек для миграции.
Здесь мы описываем количественные методы в пробирке для оценки миграции трофобласта, используя нуля, пролиферация клеток и клеток вторжения анализов. В скретч assay создан единый рану в монослое клеток, и миграции клеток, чтобы заполнить разрыв измеряется автоматизированных, покадровой изображений размер раны и плотность клеток в рану. Распространения assay клетки основывается на расчете соотношение клеток в каждый момент времени по сравнению с известным начальное количество клеток. В assay вторжения клетки клетки посеян на вершине камеру Вставка культуры внеклеточная матрица покрытием клеток (например, Transwell), и подсчитывается количество ячеек, которые вторгаются через внеклеточного матрикса в ответ на химио приманки.
Царапинам assay — простой и эффективный инструмент, который может использоваться для определения различных условий окружающей среды влияют на миграцию клеток. Распространение и вторжения анализов впоследствии может использоваться для определения вклада инвазивность общего изменения в ячейке миграции и пролиферации клеток. В совокупности эти анализы обеспечивают надежные измерения биологических процессов, которые могут способствовать подвижности клеток. Две линии клеток трофобласта увековечен первого триместра были использованы в описанных анализов, Swan.71 (Sw.71) и HTR-8/SVneo9,10. Однако эти анализы также могут быть оптимизированы для использования в других типах клеток для выявления ключевых модуляторы миграции клеток и вторжения.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

Движение клеток является критическое свойство трофобласты во время развития плаценты и ранней беременности. Беременности расстройств, таких как ограничение преэклампсии и внутриутробного роста, которые связаны с неадекватной трофобласта вторжения материнской сосудистую свидетельствует значение надлежащего трофобласта миграции и вторжения. К сожалению, наше понимание механизмов по которой плацента развивается от миграции трофобласты ограничен. В пробирке анализ миграции клеток через скретч assay является полезным инструментом в выявлении факторов, которые регулируют трофобласта мигрирующих потенциала. Однако этот assay только не определяет клеточные изменения, которые могут привести к миграции измененных клеток. Этот протокол описывает три различных в пробирке анализов, которые используются коллективно оценить движение клеток трофобласта: скретч assay, пробирного вторжения и распространения assay. Протоколы, описанные здесь, также могут быть изменены для использования в других клеточных линий для количественного определения клеточного движения в ответ на раздражители. Эти методы позволяют следователям для выявления отдельных факторов, которые способствуют движению клеток и обеспечить тщательное изучение возможных механизмов, лежащих в основе явного изменения в ячейке миграции.

Увековечен человека первого триместра трофобласта клеточных линий Sw.71 и HTR-8/SVneo были использованы в этих экспериментов для определения роли глюкокортикоидов в миграции клеток трофобласта12. Глюкокортикоидов были использованы в этих экспериментах, как он?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Здесь мы представляем весьма доступный протокол для оценки клеточного движения в клетках человека трофобласта, используя три в пробирке анализов: скретч assay, transwell вторжения пробирного и распространения assay клетки.

В Vitro анализов для оценки миграции, вторжения и распространения увековечен человека первого триместра трофобласта клеточных линий

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Эти методы могут быть использованы для определения факторов, влияющих на вторжение в трофобласт, которые могут дать представление о основных неблагоприятных акушерских исходов. Преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает визуальный и количественный анализ нескольких факторов, которые могут повлиять на вторжение в трофобласт, включая распространение и миграцию. Чтобы начать анализ царапин, семя соответствующее количество клеток в 24-хорошо пластины для достижения 100% слияния в 48 часов.На следующий день, изменить средства массовой информации на фенол красный свободных средств массовой информации дополняется тепло инактивированных древесного угля dextran раздели FBS. В день царапины, добавить желаемое лечение в средствах массовой информации в каждом хорошо для предварительной обработки клеток в течение 30 минут. Чтобы создать однородные раны, поместите стерильные 10 микролитровых пипеток на булавки инструмента из раны.Опустите кончики в первый ряд скважин и переместить пластину по дорожке раны Maker до пипетки советы достичь другой стороне колодца. Затем перемести тарелку обратно в исходное положение, чтобы обеспечить постоянную рану по диаметру колодеца. Опустите кончики в следующий ряд скважин и повторяйте до тех пор, пока все скважины не поцарапаются.Подтвердите, что царапина покрывает ширину колодец, наблюдая пластину под микроскопом. Далее, тщательно аспирировать средства массовой информации и аккуратно мыть клетки с 1x PBS в два раза. После окончательного мытья, добавить дополненный фенол красный бесплатно раздели или низким FBS средств массовой информации с желаемого лечения.Затем поместите пластину с поцарапанными скважинами в автоматизированный образец timelapse, размещенный в инкубаторе, который содержит температуру 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ при 95%влажности атмосферы. Изображение клеток на регулярной основе по мере необходимости, чтобы клетки для завершения заживления ран. Чтобы начать анализ вторжения, семя соответствующее количество клеток в шесть хорошо пластин в инкубаторе, который поддерживает температуру 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа при 95%влажности атмосферы.Разрешить клеткам достичь 90% слияния в 48 часов. На следующий день, изменить средства массовой информации на фенол красный свободных средств массовой информации дополняется тепло инактивированных древесного угля dextran раздели FBS. Поместите флакон 10 миллиграммов на миллилитр внеклеточной матрицы в холодильник на льду и дайте оттепели на ночь.На следующий день после этого, используйте охлажденные советы пипетки, чтобы разбавить 10 миллиграммов на миллилитр внеклеточной матрицы с фенол красный свободный сыворотки свободных средств массовой информации до окончательной концентрации пять миллиграммов на миллилитр. Затем добавьте 100 миллилитров разбавленной внеклеточной матрицы в охлажденные вставки, которые были помещены в охлажденную пластину 24-хорошо. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию, чтобы матрица затвердеет.Для подготовки клеток к вторжению анализ, мыть клетки с одним миллилитр 1x PBS. Затем аспирировать PBS и добавить 500 микролитров 1x Трипсин EDTA к каждой хорошо. Поместите шестиявую пластину в инкубатор, который поддерживает температуру 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ при 95%влажности атмосферы, пока все клетки не отсоединились от нижней части пластины.После того, как клетки отделились, добавить 500 микролитров фенола красный свободный сыворотки свободных средств массовой информации для каждого хорошо трипсинизированных клеток. Затем перенесите 1000 микролитров отдельных клеток в трубку микроцентрифуга и вращайся вниз в течение пяти минут при 400 г при четырех градусах Цельсия. Далее, аспирировать средства массовой информации и повторно использовать клетки в фенол красный свободных средств массовой информации сыворотки.Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток и отрегулируйте объем клеточной подвески для окончательной концентрации 0,5 миллиона клеток на миллилитр. Добавьте 600 микролитров полного средства роста к каждому колодец 24-хорошо пластины и поместите предварительно покрытием вставить в него. Затем добавьте 200 микролитров ячеек поверх каждой предварительно покрытой клеточной вставки в общей сложности 0,1 миллиона клеток.Поместите 24-хорошо пластины в инкубатор, который поддерживает 37 градусов по Цельсию температуры и 5%углекислого газа на 95%humidity атмосферу в течение 24 часов. После ночной инкубации всасывание остальных средств массовой информации из верхней и нижней камер, не нарушая внеклеточной матрицы. Затем аккуратно удалите внеклеточную матрицу и невлаганные клетки из верхней части вставок с помощью ватного тампона.Вымойте каждую вставку три раза, добавив 1x PBS как в верхней, так и в нижней палатах хорошо. Аспират PBS после каждой стирки. Чтобы зафиксировать клетки, прикрепленные к вставам, поместите вставки в 100%ледяной холодный метанол при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.Вымойте вставки три раза с 1x PBS и удалить PBS после окончательного мытья. Пятно клеток, прикрепленных к вставки с 0,2%crystal фиолетовый в 20%ethanol в течение 10 минут. Промыть деионизированной водой три раза и аспирировать деионизированную воду после окончательной стирки.Воздушные сухие вставки при комнатной температуре в течение одного часа. Наконец, используя типсы и лезвие бритвы, тщательно вырезать нижнюю мембрану вставки и смонтировать его на стеклянной горке с нижней стороны вверх. Используя световой микроскоп с целью 20X, получить по крайней мере четыре уникальных изображения вторглись клетки на образец.Для начала анализа пролиферации используйте автоматизированный счетчик ячеек для подсчета трипсинизированных ячеек из колбы. Семенные клетки в шести-хорошо пластин при плотности 0,2 миллиона клеток на колодец в стандартных средств массовой информации роста. Затем поместите клетки в инкубатор, который поддерживает температуру 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ при 95%влажности атмосферы в течение четырех часов или до тех пор, пока клетки придерживались.Далее, изменить средства массовой информации на фенол красный свободных средств массовой информации дополняется тепло инактивированных древесного угля dextran раздели FBS и желаемого лечения. Поместите шестиявую пластину в инкубатор, который поддерживает температуру 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ при 95%влажности атмосферы. Затем замените средства массовой информации свежими средствами массовой информации, дополненными желаемым лечением каждые 48 часов.После 24, 48, или 72 часов лечения, мыть клетки с одним миллилитров 1x PBS и добавить 500 микролитров трипсина EDTA к каждой хорошо. Поместите шестиявую пластину в инкубатор до тех пор, пока клетки не отсоединялись от пластины. После того, как клетки отделились от пластины, добавить 500 микролитров дополнительного фенола красный свободных средств массовой информации для деактивации трипсина.Наконец, добавьте пять микролитров трипсинизированных клеток в пять микролитров Trypan Blue в отдельную трубку и смешайте с помощью пипетки. Используйте автоматизированный счетчик ячеек для подсчета ячеек из каждого хорошо в дублировать. Увековеченный человек первого триместра трофибласт Лебедь.71 клетки были обработаны для нуля, восемь, и 18 часов с транспортным средством 1x PBS или 100 микромоляра синтетического глюкокортикоида дексаметазона в анализе царапин. Измерение размера раны и плотности раны в Лебедином. 71 и HTR-8/SVneo клетки, обработанные транспортным средством или 100 наномолярных декс показал, что декс лечения снижение скорости закрытия раны о том, что глюкокортикоиды могут препятствовать миграции клеток.После анализа вторжения, глюкокортикоида лечение снижение инвазивности клеток, как показано на 15%сокращение числа вторглись Лебедь. 71 и HTR-8/SVneo клетки обрабатываются 100 наномолярных декс в течение 24 часов по сравнению с клетками, обработанными транспортным средством. После анализа пролиферации клеток, глюкокортикоида лечение снижение пролиферации клеток, как указано меньше лебедя.71 и HTR-8/SVneo клетки обрабатываются 100 наномолярных декс по сравнению с клетками, обработанными транспортным средством. Методы оценки смерти клеток могут быть использованы в сочетании с этой процедурой, чтобы определить, является ли апоптоз или некроз способствовать изменению функций трофибласта. Мы однозначно приняли использование стандартных методов, обычно используемых в биологии рака для изучения функции трофибласта.Нет никаких опасностей, связанных с этими методами. Единственная мера предосторожности зрители должны принять с помощью стерильной техники для культуры тканей.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Производство и использование Лентивирус, чтобы выборочно преобразовывать Первичная олигодендроцитов клеток-предшественников для<em&gt; In Vitro</em&gt; миелинизации Анализы

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Оценка материнской сосудистого ремоделирования во время беременности в матке мышей

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Создание Геном человека-редакцией плюрипотентных стволовых клеток: От Ориентация в изоляцию

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Инициирование дифференциация в увековечена МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ ушные клетки-предшественники

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Развитие<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки сократительной функции мезенхимальных клеток, перенесшей Эпителиальные-мезенхимальных переходной

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Человек Первичная трофобласта клеточной культуры модель для изучения защитных эффектов мелатонина Против Гипоксия / реоксигенация-индуцированное Срыв

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Анализ 5-кратного точечного блоттинга Количественный анализ уровня метилирования ДНК дифференцировки хондроцитов<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Живая визуализация мышей

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Роговицы тканевая инженерия: В пробирке модель стромальные нерва взаимодействий человека роговицы

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...