Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Gil Mor för att tillhandahålla de Sw.71 cellerna. Denna forskning stöddes av en Albert McKern Scholar Award till S.V.

1. cell förberedelse
<ol><li>Upprätthålla celler i T-75 kolvar i standard tillväxt medier vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet. Obs: Cellerna som används i dessa experiment var den förevigade första trimestern trofoblaster cell fodrar Swan.71 (Sw.71) och HTR-8/SVneo9,10. Sw.71 cellerna bibehölls DMEM/F-12 kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS), 1,0 mM natrium Pyruvat, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+implantation+and+placentation:+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications.">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li><li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia.">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li><li>Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion.">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li><li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#x3b1;-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8/SVneo+Trophoblast+Cells.">TNF&#x3b1;-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li><li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion.">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li><li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+(MMP)-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy.">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li><li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line,+Swan+71.">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li><li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan.">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71.">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).</li><li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

Detta förfarande bygger på användning av migration och invasion analyser att omfatta graden av cellproliferation som potentiella bidragsgivare att uppmätta skillnader i trofoblaster cellers rörelser. Används tillsammans, är dessa in vitro-testmetoder enkla och effektiva metoder som kan användas för att identifiera de cellulära vägar som reglerar trofoblaster migration. Som beskrivits ovan, kan trofoblaster celler behandlas med hormoner, cytokiner, tillväxtfaktorer eller andra molekyler att bestämma deras inv...

Placenta utveckling är ett avgörande steg i etableringen av graviditet, påverkar både moderns och fostrets hälsa. Den mekanistiska grunden genom vilket detta sker är dock inte helt klarlagt. Cellmigration är en viktig biologisk process som bidrar till upprättande och funktioner av moderkakan under graviditet. Efter blastocysten implantation, trophectoderm gör åtskillnad mellan in i villösa trofoblaster, som täcka ytan av de chorionic tarmludd och är involverade i gas och näringsämnen exchange, och extravillous trofoblaster (vilket), som vandrar ut från villina och invadera maternell decidua och kärlsystemet1. Migrering av vilket är viktigt för remodeling maternell spiral artärer och upprätta uteroplacentalt omsättning för att stödja fostrets tillväxt2. Otillräcklig trofoblaster invasionen under graviditeten resulterar i onormal placenta utveckling och kan bidra till graviditetskomplikationer som havandeskapsförgiftning, graviditetsdiabetes hypertoni, intrauterin tillväxt begränsning och prematur förlossning3, 4. Det är därför nödvändigt att fastställa de vägar som krävs för normal placentation förstå de faktorer som påverkar trofoblaster motilitet.
Trofoblaster migration styrs av ett komplext nätverk av signalmolekyler, inklusive angiogena faktorer5, hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner. På grund av begränsningarna av att studera moderkakan i vivo, förevigade in vitro-analyser utnyttja mänskliga trofoblaster cell linjer har varit avgörande att identifiera faktorer som bidrar till trofoblaster motilitet. Skrapa och invasion analyser har använts i stor utsträckning att kvantitativt bedöma rollen av enskilda molekyler på trofoblaster cell migration6,7,8. Men medan användbar tillsammans för att undersöka hur förändringar i migration kan orsakas av förändringar i cell invasivitet, dessa två analyser inte hänsyn till ytterligare mekanismer som kan bidra till förändrad priser av cellmigration. Minskningar av andelen cellproliferation kan exempelvis resultera i färre celler tillgängliga för migrering.
Här beskriver vi kvantitativa in vitro-metoder för att bedöma trofoblaster migrering med scratch, cellproliferation och cell invasion analyser. Ett enhetligt sår skapas i en cell enskiktslager i scratch-analysen, och migration av celler för att fylla gapet mäts genom automatiserad, time-lapse avbildning av såret storlek och täthet av celler i såret. Cell spridning analysen baseras på beräkning av förhållandet mellan celler vid varje tidpunkt jämfört med en känd start mängd celler. Celler är seedade ovanpå en extracellulär matrix-belagd cell kultur infoga kammare (e.g. Transwell) i cell invasion analysen, och antalet celler som invaderar genom den extracellular matrisen svar på kemo-lockmedel räknas.
Scratch analysen är ett enkelt och effektivt verktyg som kan användas för att avgöra hur olika miljöförhållanden påverka cellmigration. Spridning och invasion analyserna kan därefter användas för att bestämma cellproliferation och invasivitet till övergripande förändringar i cellmigration bidrag. Tillsammans, ger dessa analyser robust mätningar av biologiska processer som kan bidra till cell motilitet. Två förevigade första trimestern trofoblaster cellinjer användes i beskrivs analyser, Swan.71 (Sw.71) och HTR-8/SVneo9,10. Dessa analyser kan dock också vara optimerad för användning i andra celltyper att identifiera viktiga modulatorer av cellmigration och invasion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

Cellers rörelser är en viktig egenskap för trofoblaster under placenta utveckling och tidig graviditet. Betydelsen av korrekt trofoblaster migration och invasion framgår av graviditet störningar såsom preeklampsi och intrauterin tillväxt begränsning, som är förknippade med otillräcklig trofoblaster invasion av den maternella kärlsystemet. Tyvärr, vår förståelse av mekanismerna som moderkakan utvecklas från att migrera trofoblaster är begränsad. In vitro-analys av cellmigration via scratch analysen är ett användbart verktyg för att identifiera faktorer som reglerar trofoblaster flyttande kapacitet. Denna analys ensam definierar dock inte de cellförändringar som kan leda till förändrad cellmigration. Det här protokollet beskriver tre olika in vitro-analyser som används gemensamt utvärdera trofoblaster cell rörelse: scratch analysen, invasion analysen och spridningen analysen. De protokoll som beskrivs här kan också ändras för användning i andra cellinjer att kvantifiera cellers rörelser som svar på stimuli. Dessa metoder kan utredarna att identifiera individuella faktorer som bidrar till den cell rörligheten och ger en grundlig undersökning av potentiella mekanismerna bakom synbara förändringar i cellmigration.

De förevigade mänskliga första trimestern trofoblaster cellinjer Sw.71 och HTR-8/SVneo användes i dessa experiment för att bestämma rollen av glukokortikoider i trofoblaster cell migration12. Glukokortikoider användes i dessa experiment som de har nyligen visat att förändra trofoblaster funktion, även om alternativa behandlingar kan vara begagnade12. Både cellinjer behandlades med fordon (1 x PBS) eller 100 nM den syntetisk glukok...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Här presenterar vi ett mycket lättillgänglig protokoll för att utvärdera cell rörelsen i mänskliga trofoblaster celler med tre in vitro-analyser: scratch analysen, transwell invasion analysen och den cell proliferation assay.

Vitro analyser att utvärdera migreringen, Invasion och spridning av förevigade mänskliga första trimestern trofoblaster cellinjer

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Dessa metoder kan utnyttjas för att fastställa faktorer som påverkar trophoblast invasion som kan ge insikt i stora negativa obstetrisk resultat. Fördelen med denna teknik är att det ger en visuell och kvantitativ analys av flera faktorer som kan påverka trophoblast invasion inklusive spridning och migration. För att börja skrapa analysen, utsäde lämpligt antal celler i en 24-brunns platta för att uppnå 100%sammanflödet i 48 timmar.Nästa dag, ändra media till fenol röda fria medier kompletteras med värme inaktiverad kol dextran strippad FBS. På dagen för repa, tillsätt önskad behandling till media i varje brunn för att förförbehandling cellerna i 30 minuter. För att skapa enhetliga sår, placera sterila 10 mikroliterpipettspetsar på sårets maker-verktygs stift.Sänk ner spetsarna i den första raden av brunnar och flytta plattan längs såret makers spår tills pipettens spetsar når andra sidan av brunnen. Flytta sedan plattan tillbaka till utgångsläget för att säkerställa konstant sår över diametern på brunnen. Sänk spetsarna i nästa rad med brunnar och upprepa tills alla brunnar är repad.Bekräfta att repningen täcker brunnens bredd genom att observera plattan i mikroskop. Därefter försiktigt aspirera media och försiktigt tvätta cellerna med 1x PBS två gånger. Efter en sista tvätt, lägga till kompletterade fenol röd fri avskalade eller låga FBS media med en önskad behandling.Därefter placera plattan med repiga brunnar i en automatiserad timelapse imager inrymt i en inkubator som innehåller 37 grader Celsius temperatur och 5% koldioxid vid 95% luftfuktighet atmosfär. Avbilda cellerna med jämna mellanrum efter behov för att cellerna ska kunna slutföra sårläkning. För att börja invasionen analysen, utsäde lämpligt antal celler i sex-brunn plattor i en inkubator som upprätthåller 37 grader Celsius temperatur och 5%koldioxid vid 95%luftfuktighet atmosfär.Låt cellerna nå 90%sammanflödet på 48 timmar. Nästa dag, ändra media till fenol röda fria medier kompletteras med värme inaktiverad kol dextran strippad FBS. Placera en injektionsflaska med 10 milligram per milliliter extracellulär matris i ett kylskåp på is och låt är tina över natten.Dagen efter, använd kyld pipetter tips för att späda 10 milligram per milliliter av extracellulära matris med fenol röda fria serum fria medier till en slutlig koncentration av fem milligram per milliliter. Tillsätt sedan 100 milliliter av den utspädda extracellulära matrisen till kylda skär som har placerats i den kylda 24-brunnsplattan. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius för att låta matrisen härda.För att prep celler för invasionen analysen, tvätta celler med en milliliter av 1x PBS. Därefter aspirera PBS och tillsätt 500 mikroliter av 1x Trypsin EDTA till varje brunn. Placera sex-brunnsplattan i inkubatorn som håller 37 grader Celsius temperatur och 5%koldioxid vid 95%luftfuktighet atmosfär tills alla celler har lossnat från botten av plattan.När celler har lossnat, tillsätt 500 mikroliter av fenol röda fria serum fria medier till varje brunn av trypsinnade celler. Överför sedan 1, 000 mikroliter av fristående celler till ett mikrocentrifugrör och snurra ner i fem minuter vid 400 gånger g vid fyra grader Celsius. Därefter aspirera media och resuspend cellerna i fenol röd fri serum fria medier.Räkna celler med hjälp av en automatiserad cellräknare och justera volymen av cellfjädringen för en slutkoncentration på 0,5 miljoner celler per milliliter. Tillsätt 600 mikroliter av det kompletta tillväxtmediet till varje brunn av 24-brunnsplattan och placera det förbelagda skäret i den. Lägg sedan till 200 mikroliter celler ovanpå varje förlackerad cellinsats för totalt 0,1 miljoner celler.Placera 24-brunnsplattan i inkubatorn som håller 37 grader Celsius temperatur och 5%koldioxid vid 95%luftfuktighet atmosfär i 24 timmar. Efter inkubation över natten, sug de återstående medierna från övre och nedre kamrarna utan att störa den extracellulära matrisen. Ta sedan försiktigt bort den extracellulära matrisen och icke-invaderade celler från den övre delen av skären med en bomullspinne.Tvätta varje insats tre gånger genom att tillsätta 1x PBS till både den övre och nedre kamrarna i brunnen. Aspirera PBS efter varje tvätt. För att fixera celler som är fästa vid skären placerar du skären i 100%iskall metanol vid fyra grader Celsius i 30 minuter.Tvätta insatser tre gånger med 1x PBS och ta bort PBS efter den slutliga tvätten. Stain cellerna fäst på skär med 0,2%crystal violett i 20%etanol i 10 minuter. Skölj med avjoniserat vatten tre gånger och aspirera avjoniserat vatten efter den slutliga tvätten.Lufttorka skär i rumstemperatur i en timme. Slutligen använder tatttråd och ett rakblad, försiktigt skära bottenmembranet av insatsen och montera den på ett glas glida med den nedre sidan uppåt. Med hjälp av ett ljusmikroskop med ett 20X-mål, få minst fyra unika bilder av de invaderade cellerna per prov.För att påbörja spridningsanalysen använder du en automatiserad cellräknare för att räkna de trypsiniserade cellerna från kolven. Fröceller i sex-brunnsplattor med en densitet på 0,2 miljoner celler per brunn i standardtillväxtmedia. Placera sedan celler i inkubatorn som håller 37 grader Celsius temperatur och 5% koldioxid vid 95% luftfuktighet atmosfär i fyra timmar eller tills cellerna har anslutit sig.Nästa, ändra media till fenol röda fria medier kompletteras med värme inaktiverad kol dextran strippad FBS och önskad behandling. Placera sex-brunnsplattan i inkubatorn som håller 37 grader Celsius temperatur och 5%koldioxid vid 95%luftfuktighet atmosfär. Byt sedan ut media med de färska medier som kompletteras med önskad behandling var 48:e timme.Efter 24, 48 eller 72 timmars behandling tvätta celler med en milliliter av 1x PBS och tillsätt 500 mikroliter Trypsin EDTA till varje brunn. Placera en sex-brunnsplatta i inkubatorn tills cellerna har lossnat från plattan. När celler har lossnat från plattan, tillsätt 500 mikroliter av den kompletterade fenol röda fria medier för att deaktivera Trypsin.Slutligen lägga till fem mikroliter av trypsiniserade celler till fem mikroliter av Trypan Blue i ett separat rör och blanda genom pipettering. Använd en automatiserad cellräknare för att räkna celler från varje brunn i dubblett. Förevigade mänskliga första trimestern trofoblast Svanen.71 celler behandlades för noll, åtta och 18 timmar med fordonet 1x PBS eller 100 mikromolar av den syntetiska glukokortikoid dexametason i skraftanalysen. Mätning av sårstorleken och sårtätheten i Svan. 71 och HTR-8/SVneo-celler som behandlades med fordon eller 100 nanomolar dex visade att dexbehandlingen minskade sårförslutningshastigheten som indikerar att glukokortikoider kunde hämma cellmigrationen.Efter invasionen assay, glukokortikoida behandling minskade cellinvasivitet som visas av en 15%minskning av antalet invaderade Swan. 71 och HTR-8/SVneo-celler som behandlats med 100 nanomolar dex i 24 timmar jämfört med celler som behandlats med fordonet. Efter cellen spridning analysen minskade glukokortikoida behandling cellproliferation som anges av färre Swan.71 och HTR-8/SVneo-celler som behandlats med 100 nanomolar dex jämfört med celler som behandlats med fordonet. Metoder för att utvärdera celldöd skulle kunna användas tillsammans med detta förfarande för att avgöra om apoptos eller nekros bidrar till förändrade trofoblastfunktioner. Vi har unikt antagit användningen av standardtekniker som rutinmässigt används i cancerbiologi för studier av trofoblastfunktion.Det finns inga faror som är förknippade med dessa metoder. Den enda försiktighet tittarna bör vidta är att använda steril teknik för vävnad kultur.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Produktion och användning av Lentivirus att selektivt omvandla Primär Oligodendrocyte prekursorceller för<em&gt; In Vitro</em&gt; myeline Analyser

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Bedömning av Maternal kärlremodellering under graviditeten i musen livmoder

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Inrättande av Genome-redigerade Human pluripotenta stamceller linjer: Från Inriktning till isolering

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiera Differentiering i Immortaliserade multi Otic stamceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Utveckling av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Analys för att utvärdera kontraktila funktion av mesenkymala celler som genomgick Epithelial-Mesenkymala Övergångs

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Human Primary trofoblasten Cell Culture modell för att studera de skyddande effekterna av Melatonin mot hypoxi / ny syresättning-inducerad Störningar

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC primärblottanalys som kvantifierar DNA-metyleringsnivån av kondrocyt-skillnad<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Hornhinnans Tissue Engineering: En In Vitro modell av Stromal-nerv interaktioner av mänskliga hornhinnan

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...