Name: in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

Yazarlar Dr. Gil Mor Sw.71 hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu araştırma bir Albert McKern bilim adamı Ödülü S.W. tarafından desteklenmiştir

1. hücre hazırlık
<ol><li>T-75 şişeler 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem oranı, standart büyüme medyada hücreleri korumak. Not: Bu deneylerde kullanılan hücre ölümsüzleştirdi vardı birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları Swan.71 (Sw.71) ve HTR-8/SVneo9,10. Sw.71 hücre DMEM/F-%12 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS), 1.0 mM sodyum pyruvate, 10 mM HEPES, 0.10 mM MEM esansiyel olmayan amino asitler, 1...

<ol>
	<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester:+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia.">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li><li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+implantation+and+placentation:+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications.">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li><li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia.">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li><li>Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion.">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li><li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Kn&#246;fler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#x3b1;-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8/SVneo+Trophoblast+Cells.">TNF&#x3b1;-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li><li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion.">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li><li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+(MMP)-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy.">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li><li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line,+Swan+71.">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li><li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan.">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71.">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).</li><li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen:+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture.">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2004).</li></ol>

Bu yordamı geçiş ve işgal kullanımı deneyleri hücre çoğalması Trofoblast hücre hareketi ölçülen farklılıkları için potansiyel bir katkı olarak değeri oluşturur. Birlikte bu tüp bebek deneyleri Trofoblast geçişi düzenleyen hücresel yolları tanımlamak için kullanılan basit ve etkili yöntem kullanılır. Yukarıda açıklandığı gibi Trofoblast hücreleri hormonlar, sitokinler, büyüme faktörleri veya Trofoblast hareket üzerindeki etkilerini belirlemek için diğer molekülleri ile tedavi...

Plasental geliştirme gebelik, maternal ve fetal sağlığı etkileyen kurulması çok önemli bir adımdır. Ancak, bu işlem tarafından oluştuğu mekanik olarak tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre göç kurulması ve plasenta fonksiyonları için hamilelik sırasında yaptığı katkının önemli bir biyolojik süreçtir. Blastosist implantasyonu, Korionik villus yüzeyine kapak ve gaz ve besin değişimi dahil olan, villous trophoblasts, ve dışarı villus göç extravillous trophoblasts (EVTs), trophectoderm ayırır ve anne decidua ve damarlara1istila. EVTs geçirilmesi anne spiral arterler remodeling ve fetal büyüme2desteklemek için uteroplacental dolaşım kurulması için esastır. Yetersiz Trofoblast işgali sırasında gebelik gebelik komplikasyonları preeklampsi, Gestasyonel hipertansiyon, intra uterin büyüme kısıtlama ve erken doğum3gibi katkıda ve anormal plasental geliştirme sonuçları, 4. Bu nedenle, Trofoblast hareketliliği etkileyen faktörleri anlamak için normal placentation gerekli yollar belirlemek için önemlidir.
Trofoblast geçiş sinyal molekülleri, büyüme faktörleri, sitokinler, hormonlar ve anjiogenik faktörler5de dahil olmak üzere karmaşık bir ağı tarafından kontrol edilir. Plasenta içinde vivo eğitim sınırlamaları nedeniyle, tüp bebek deneyleri kullanan insan Trofoblast hücre hatları Trofoblast hareketliliği için katkıda faktörleri belirlemek için çok önemli olmuştur ölümsüzleştirdi. Sıfırdan ve işgal deneyleri kapsamlı kantitatif Trofoblast hücre göç6,7,8bireysel moleküllerin rolünü değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, tandem nasıl geçiş değişiklikleri değişiklikleri tarafından hücre invasiveness neden olabilir araştırmak için yararlı iken bu iki deneyleri değişmiş hücre geçiş oranları için katkıda bulunabilir ek mekanizmaları için hesap değil. Örneğin, hücre çoğalması oranının indirimleri daha az hücrelerde geçirmek kullanılabilir neden olabilir.
Burada, çizik, hücre çoğalması ve hücre işgali deneyleri kullanarak Trofoblast geçişi değerlendirmek için kantitatif tüp bebek yöntemleri açıklanmaktadır. Sıfırdan tahlil tek tip bir yara bir hücre monolayer oluşturulur ve geçiş hücre boşluğu doldurmak için otomatik, hızlandırılmış görüntüleme yara boyutu ve yoğunluğu yara içindeki hücreleri tarafından ölçülür. Hücre çoğalması tahlil hücreler hücreleri bilinen başlangıç miktarı karşılaştırıldığında her zaman noktasında oranını hesaplamak üzerinde temel alır. Cep işgali tahlil hücreleri bir hücre dışı matriks kaplı hücre kültür Ekle Odası (örneğin Transwell) tohumlari ve yanıt olarak kemoterapi-cezbedici hücre dışı matriks ile istila hücre sayısı dikkate alınır.
Kazı-kazan tahlil ne kadar farklı çevre koşulları belirlemek için kullanılan basit ve etkili bir araç etkileyen hücre geçiş olduğunu. Nükleer silahların yayılmasına karşı ve işgal deneyleri daha sonra hücre çoğalması ve invasiveness hücre göç genel değişikliklere katkısını belirlemek için kullanılır. Toplu olarak, bu deneyleri hücre hareketliliği için katkıda bulunabilir biyolojik süreçlerin sağlam ölçümler sağlamak. İki ölümsüzleştirdi birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre satır açıklanan deneyleri, Swan.71 (Sw.71) ve HTR-8/SVneo9,10kullanılmıştır. Ancak, bu deneyleri de hücre göç ve işgal anahtar modülatörler tanımlamak için diğer hücre tipleri kullanmak için optimize.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3422</td>
			<td>Contain polycarbonate filters with an 8 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal dextran-stripped FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&#945;-fluoro-16&#945;-methyl-11&#946;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &#8805;98% TLC)</td>
			<td>Steraloids</td>
			<td>P0500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4365</td>
			<td>If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte software</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>2010A Rev2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM system</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Scratch assay images were captured and analyzed using the preset &#8220;Scratch Wound&#8221; parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356231</td>
			<td>Growth factor reduced, phenol-red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>48311-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 &#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>151-40-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red free DMEM/Ham&#39;s F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic wound maker tool</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to evaluate the migration, invasion, and proliferation of immortalized human first-trimester trophoblast cell lines

Hücre hareketi bir kritik trophoblasts plasental geliştirme ve erken gebelik sırasında özelliğidir. Uygun Trofoblast göç ve işgal önemini anne damarlara yetersiz Trofoblast işgali ile ilişkili olan gebelik bozuklukları öncesi eklampsi ve intrauterin büyüme kısıtlama gibi gösterilmiştir. Ne yazık ki, anlayışımızı mekanizmaları hangi plasenta tarafından geliştirir geçiş--dan trophoblasts sınırlıdır. Hücre göç sıfırdan tahlil ile in vitro analiz Trofoblast göçmen kapasitesini düzenleyen etkenler belirlenmesinde yararlı bir araçtır. Ancak, bu tahlil yalnız değişmiş hücre göç neden olabilir hücresel değişikliklerin tanımlamaz. Bu iletişim kuralı topluca Trofoblast hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan üç farklı tüp bebek deneyleri açıklar: sıfırdan tahlil, istila tahlil ve nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil. Burada açıklanan protokoller de bizi canlı tutan hücre hareketinde ölçmek için diğer hücre hatlarında kullanılmak değiştirilebilir. Bu yöntemler müfettişler bireysel faktörler hücre hareketine katkıda bulunmak ve potansiyel mekanizmaları hücre göç belirgin değişiklikler temel alınan bir muayene sağlar tanımlamak olanak sağlar.

Ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları Sw.71 ve HTR-8/SVneo bu deneylerde glukokortikoid Trofoblast hücre geçiş12rolünü belirlemek için kullanılmıştır. Ne alternatif tedaviler kullanılan12olabilir onlar son zamanlarda Trofoblast işlevler, alter gösterilmiştir gibi sebepler bu deneylerde kullanılıyordu. Her iki hücre hatları araç (1 x PBS) veya 100 ile tedavi edilen tüm deneyler iç...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines at JoVE.com

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Burada, üç tüp bebek deneyleri kullanarak insan Trofoblast hücreleri hücre hareketinde değerlendirmek için son derece erişilebilir bir iletişim kuralı mevcut: sıfırdan tahlil, transwell istila tahlil ve Hücre proliferasyonu tahlil.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Bu yöntemler, büyük advers obstetrik sonuçlara ışık tutabilecek trofoplast invazyonunu etkileyen faktörleri belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin avantajı, proliferasyon ve göç de dahil olmak üzere trofoplast invazyonu etkileyebilecek çeşitli faktörlerin görsel ve nicel analizini sağlamasıdır. Çizik teşbine başlamak için, 48 saat içinde %100 biraraya gelmek için uygun sayıda hücreyi 24 kuyulu bir plakaya yerleştirin.Ertesi gün, fenol kırmızı serbest medya ısı inaktive kömür dextran ile desteklenen medya değiştirmek FBS sıyrılmış. Çizik gününde, 30 dakika boyunca hücreleri pretreat her kuyuda ortama istenilen tedavi ekleyin. Düzgün yaralar oluşturmak için, yara makinesi aracının pimlerine steril 10 mikrolitrelik pipet uçları yerleştirin.Uçları kuyuların ilk sırasına indirin ve pipet uçları kuyunun diğer tarafına ulaşana kadar plakayı yara makinesinin izini hareket ettirin. Daha sonra kuyunun çapı boyunca sürekli bir yara sağlamak için plakayı başlangıç pozisyonuna geri taşıyın. İpuçlarını bir sonraki kuyu sırasına indirin ve tüm kuyular çizilene kadar tekrarlayın.Bir mikroskop altında plaka gözlemleyerek çizik kuyunun genişliğini kapsadığını onaylayın. Daha sonra, ortama dikkatlice aspire edin ve hücreleri iki kez 1x PBS ile nazikçe yıkayın. Son bir yıkama sonrasında, istenilen bir tedavi ile takviye fenol kırmızı ücretsiz sıyrılmış veya düşük FBS medya ekleyin.Daha sonra, 37 derece santigrat sıcaklık ve% 95 nem atmosferinde% 5 karbondioksit içeren bir kuluçka içinde bulunan otomatik bir timelapse görüntüleyici içinde çizik kuyular ile plaka yerleştirin. Hücrelerin yara iyileşmesini tamamlamasını sağlamak için hücreleri gerektiği gibi düzenli aralıklarla görüntüleyin. İstila sınamaya başlamak için, uygun sayıda hücreyi 37 santigrat derece sıcaklık ve %95 nem atmosferinde %5 karbondioksit koruyan bir kuluçka makinesinde altı kuyulu plakaya yerleştirin.Hücrelerin 48 saat içinde %90'a ulaşmasına izin verin. Ertesi gün, fenol kırmızı serbest medya ısı inaktive kömür dextran ile desteklenen medya değiştirmek FBS sıyrılmış. Bir buz üzerinde bir buzdolabı na mililitre ekstrasellüler matris başına 10 miligram bir şişe yerleştirin ve bir gecede çözülmeye izin.Ertesi gün, mililitre başına 10 miligram mililitre başına fenol kırmızıserbest serum serbest medya ile mililitre başına beş miligram son konsantrasyonu için soğutulmuş pipet ipuçları kullanın. Daha sonra soğutulmuş 24 kuyulu plaka yerleştirilmiş soğutulmuş ekler için seyreltilmiş ekstrasellüler matris 100 mililitre ekleyin. Matrisin sertleşebilmesi için plakayı 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.İnvazyon tadına göre hücreleri hazırlamak için hücreleri bir mililitre 1x PBS ile yıkayın. Sonra PBS aspire ve her kuyuya 1x Trypsin EDTA 500 mikrolitre ekleyin. Tüm hücreler tabağın altından ayrılana kadar 37 santigrat derece sıcaklık ve %5 karbondioksit %95 nem atmosferine sahip olan altı kuyulu plakayı kuvöze yerleştirin.Hücreler ayrıldıktan sonra, tripzinli hücrelerin her kuyuya 500 mikrolitre fenol kırmızısı serbest serumsuz ortam ekleyin. Sonra 1,000 mikrolitre müstakil hücreyi mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 400 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika aşağı doğru döndürün. Daha sonra, medya aspire ve fenol kırmızı serbest serum serbest ortamda hücreleri yeniden askıya.Hücreleri otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın ve mililitre başına 0,5 milyon hücrelik son konsantrasyon için hücre süspansiyonunun hacmini ayarlayın. 24 kuyulu plakanın her kuyuya tam büyüme ortamının 600 mikrolitresini ekleyin ve önceden kaplanmış kesici kesici yi içine yerleştirin. Daha sonra, toplam 0,1 milyon hücre için önceden kaplanmış her hücre ucunun üzerine 200 mikrolitre hücre ekleyin.24-iyi plaka 24 saat boyunca% 95 nem atmosferinde 37 derece santigrat sıcaklık ve% 5 karbondioksit korur kuvöz yerleştirin. Gece kuluçkasını takiben, kalan ortamı hücre dışı matrisi bozmadan üst ve alt odalardan emdirin. Daha sonra hücre dışı matrisi ve işgal edilmeyen hücreleri bir pamuklu bezle kesici uçların üst kısmından dikkatlice çıkarın.Kuyunun hem üst hem de alt odalarına 1x PBS ekleyerek her kesici ucu üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra PBS aspire edin. Kesici uçlara bağlı hücreleri onarmak için kesici uçları 30 dakika boyunca 4 derece lik buz gibi metanolün içine yerleştirin.Kesici uçları 1x PBS ile üç kez yıkayın ve son yıkamadan sonra PBS'yi çıkarın. 10 dakika boyunca% 20 etanol% 0.2 kristal menekşe ile eklere bağlı hücreleri leke. Son yıkamadan sonra deiyonize su ile üç kez durulayın ve deiyonize su aspire edin.Oda sıcaklığında bir saat boyunca hava kuru ekler. Son olarak, forceps ve jilet kullanarak, dikkatle kesici uç alt membran kesilmiş ve alt tarafı yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine monte. 20X hedefi olan bir ışık mikroskobu kullanarak, numune başına işgal edilen hücrelerin en az dört benzersiz görüntüsünü elde edin.Proliferasyon ttahminine başlamak için, şişedeki trypsed hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Tohum hücreleri standart büyüme ortamlarında her biri 0,2 milyon hücre yoğunluğunda altı kuyulu plakalara dönüşür. Daha sonra hücreleri, 37 santigrat derece sıcaklık ve %5 karbondioksit imuhafaza eden hücreleri dört saat boyunca veya hücreler yapışana kadar %95 nem atmosferinde yerleştirin.Daha sonra, ısı inaktive kömür dextran fbs ve istenen tedavi sıyrılmış ile desteklenen fenol kırmızı serbest medya için medya değiştirin. %95 nem atmosferinde 37 santigrat derece sıcaklık ve %5 karbondioksit tutan altı kuyulu plakayı kuvöze yerleştirin. Daha sonra her 48 saatte bir istenilen tedavi ile desteklenen taze medya ile medya değiştirin.24, 48 veya 72 saatlik tedaviden sonra hücreleri bir mililitre 1x PBS ile yıkayın ve her kuyuya 500 mikrolitre Trypsin EDTA ekleyin. Hücreler plakadan ayrılana kadar altı kuyuluk bir plakayı kuvöze yerleştirin. Hücreler plakadan ayrıldıktan sonra, Trypsin'i devre dışı bırakmak için eklenmiş fenol kırmızısı serbest ortam500 mikrolitre ekleyin.Son olarak, trypsed hücrelerin beş mikrolitre trypan Mavi ayrı bir tüp içinde beş mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Yinelenen her kuyudaki hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Ölümsüzleştirilmiş insan ilk trimester trophoblast Kuğu.Sıfır, sekiz ve 18 saat boyunca sıfır, sekiz ve 18 saat boyunca, sıfır da sayılma da sentetik glukokortikoid deksametazon 100 mikromolar ile tedavi edildi. Kuğu'daki yara büyüklüğünün ve yara yoğunluğunun ölçümü. 71 ve HTR-8/SVneo hücreleri araç veya 100 nanomolar deks ile tedavi glukokortikoidlerin hücre göçlerini inhibe edebileceğini gösteren yara kapatma oranını azalttığını göstermiştir.İstila yıprandısonra, glukokortikoid tedavisi, işgal edilen Kuğu sayısında %15'lik bir azalma ile gösterildiği gibi hücre invazivliğini azalttı. 71 ve HTR-8/SVneo hücreleri araç ile tedavi edilen hücrelere göre 24 saat boyunca 100 nanomolar deks ile tedavi edilir. Hücre proliferasyon sabunu sonrasında, glukokortikoid tedavisi daha az Kuğu tarafından belirtildiği gibi hücre çoğalmasını azalttı.71 ve HTR-8/SVneo hücreleri araç ile tedavi edilen hücrelere göre 100 nanomolar deks ile tedavi edilir. Hücre ölümünü değerlendirme yöntemleri, apoptoz veya nekrozun değiştirilmiş trofoblast fonksiyonlarına katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için bu prosedürle birlikte kullanılabilir. Biz benzersiz trophoblast fonksiyonunun çalışması için rutin kanser biyolojisinde kullanılan standart tekniklerin kullanımını benimsemiştir.Bu yöntemlerle ilişkili herhangi bir tehlike yoktur. İzleyicilerin alması gereken tek önlem doku kültürü için steril teknik kullanmaktır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için<em&gt; İn Vitro</em&gt; Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

5-mC Nokta-Blot Testi Kondrosit Farklılaşmasımın DNA Metilasyon Seviyesinin Nicelendirilmesi<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Kornea doku Mühendisliği: İnsan kornea sinir Stromal etkileşimlerin bir Vitro modeli

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...