Name: cheek injection model for simultaneous measurement of pain and itch-related behaviors
Uploaded: 2019-09-27T12:30:00
Duration: 4 min 59 s
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Agradecemos a los doctores Steven G. Shimada y Robert H. LaMotte (Escuela de Medicina de la Universidad de Yale, Connecticut) de cuyos métodos (referencia 4) se adaptó esta técnica. También damos las gracias al Sr. Kentaro Miyahara por crear las ilustraciones del ratón. Este estudio fue apoyado por una Beca en Ayuda para la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología en Japón (Nos. 15H02501 y 15H05928 a M.T., y No. 16K21691 a H.K.) y Uehara Memorial Foundation (a H.K.). Apreciamos la introducción del método de inyección de mejillas por el profesor LaMotte en la Universidad de Yale.

Todos los procedimientos relacionados con el cuidado y uso de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Ciencias Naturales (16A074), y llevados a cabo de acuerdo con las directrices del Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas.
NOTA: El protocolo original fue reportado por Steven G. Shimada y Robert H. LaMotte4, y el presente informe describe estos métodos con varias modificaciones, incluyendo la adición de una pantalla para evitar que los animales se vean, la ausencia de un espejo, el número de ratones por registro, la tensión del ratón, el tamaño de la jaula y el tiempo de grabación.
1. Modelo de inyección de mejilla
<ol><li>
Preparación del experimento
	<ol>
<li>Jaula<ol>
<li>Establezca cuatro jaulas debajo de una cámara como se muestra en la Figura 1. Establezca una pantalla para evitar que los ratones se vean. Ponga en cada ratón en cada jaula y coloque una tapa acrílica para evitar la fuga de ratones. Tenga en cuenta que las grabaciones deben realizarse en un entorno en el que se controlen la temperatura, la humedad y el sonido. NOTA: Los comportamientos también se pueden registrar sin tapa si la jaula es lo suficientemente alta.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aguja y jeringa<ol>
<li>Utilice una aguja de 29 G o 30 G unida a una jeringa de 0,5 ml para la inyección de sustancias de ensayo. Si la solución de sustancia de ensayo es altamente viscosa, se requieren agujas más grandes. Sin embargo, tenga en cuenta que las agujas grandes plantean efectos secundarios físicos adicionales. NOTA: Se puede utilizar una aguja conectada a una jeringa con un tubo de polietileno.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cámara de vídeo<ol>
<li>Utilice una cámara de vídeo con velocidades de fotogramas suficientemente grandes (30-60 fotogramas/s) con una resolución relativamente alta para la medición de los arañazos y los comportamientos de limpieza.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Software para análisis de vídeo<ol>
<li>Utilice un software de edición de vídeo para la reproducción y el análisis de vídeo. Tenga en cuenta que se necesita un modo de avance rápido y un modo de reproducción fotograma a fotograma para un análisis preciso.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58943/58943fig1.jpg"> Figura 1: Configuración de la cámara de vídeo y lajaula. Se utilizan cuatro jaulas acrílicas con tapas de acrílico, para prevenir la fuga de los ratones, y una pantalla para prevenir la picazón contagiosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/58943fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2"><li>
Inyección y grabación
	<ol>
<li>Un día antes del experimento, afihese el pelaje en la mejilla del ratón con cortapelos (Película 1). Antes de afeitarse, no retenga a los ratones. NOTA: Los ratones CD-1 o C57BL/6 se utilizaron principalmente en este modelo4,5. En este artículo, se utilizaron ratones machos C57BL/6N de 6-12 semanas de edad. Tenga en cuenta que la sensibilidad a los productos químicos podría ser diferente entre las diversas cepas de ratón3,6,7.</li>
		<li>Un día después del afeitado, mueva el ratón a la jaula de grabación durante 1 h para aclimatarlo a las condiciones de grabación. Si se utiliza una aplicación tópica, aplíquela durante este período de aclimatación. NOTA: En este informe, 10 l de sal de clorhidrato de difenhidramina del 2% (p/v) en sal sal insal se aplicó tópicamente 30 minutos antes del registro.</li>
		<li>Establezca una cámara de vídeo encima de la jaula e inicie la grabación de vídeo antes de la inyección de la sustancia de prueba. Inyectar una solución de 10 l de la sustancia de ensayo intradérmicamente en la mejilla afete en condiciones de despertar (Película 2). Después de la inyección, vuelva a colocar el ratón en la jaula de grabación. NOTA: En este informe, se utilizaron 50 g/10 étamina, 40 g/10 l de capsaicina o vehículo (7% de preadolescente salino 80 en salina) como sustancias de ensayo.</li>
		<li>Cierre la tapa de la jaula y continúe la grabación de vídeo durante 30 minutos. NOTA: El tiempo total de grabación dependerá de las condiciones experimentales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis conductual
	<ol>
<li>Cuente los problemas de rasguño y los comportamientos de borrado, respectivamente. Los ratones levantan una pierna trasera hacia la mejilla y rascan varias veces durante uno o unos segundos, luego bajan la pierna. Esta serie de acciones se cuenta como una pelea de rasguños. No se debe contar el rayado de otras áreas. Los ratones utilizan una sola pierna para limpiar y ambas patas delanteras para el aseo. Estas acciones deben distinguirse. Solo los comportamientos de limpieza se cuentan como comportamientos relacionados con el dolor. NOTA: Cada acción se muestra en la Figura 2, Película 3, Película 4y Película 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58943/58943fig2.jpg"> Figura 2: Actividad típica del mouse durante lagrabación. Los paneles A-C son ilustraciones que representan el comportamiento de limpieza con la pata delantera derecha (A), el comportamiento de rascado con la pata trasera derecha (B) y el comportamiento de acicalamiento con ambas patas delanteras (C). Los ratones levantan una pierna trasera hacia la mejilla y rascan varias veces durante uno o unos segundos, luego bajan esa pierna. Esta serie de acciones se cuenta como una pelea de rasguños. No se debe contar el rayado de otras áreas. Los ratones utilizan una sola pierna para limpiar y ambas patas delanteras para el aseo. Estas acciones deben distinguirse. Solo los comportamientos de limpieza se cuentan como comportamientos relacionados con el dolor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/58943fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Modelo de inyección de cuello
<ol><li>
Inyección y grabación
	<ol>
<li>Un día antes del experimento, afeitar el pelaje en la nuca del ratón con cortapelos después de aproximadamente 5% inhalación de isoflurano durante 2-3 min.</li>
		<li>Un día después del afeitado, mueva el ratón a la jaula de grabación durante 1 h para aclimatarlo a las condiciones de grabación.</li>
		<li>Establezca una cámara de vídeo por encima de la jaula(Figura 1) e inicie la grabación de vídeo antes de la inyección de la sustancia de ensayo. Inyectar una solución de 10 l de la sustancia de ensayo intradérmicamente en el cuello afeitado en condiciones de despertar. Después de la inyección, vuelva a colocar el ratón en la jaula de grabación. NOTA: En este artículo, se utilizaron 50 g/10 de histamina, 10 g/10 o 40 g/10 l de capsaicina, o vehículo (7% entre 80 en salina) como sustancias de ensayo.</li>
		<li>Cierre la tapa de la jaula y continúe la grabación de vídeo durante 30 minutos. NOTA: El tiempo total de grabación dependerá de las condiciones experimentales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis conductual
	<ol>
<li>Cuente los comportamientos de la pelea de rasguños. Los ratones levantan una pata trasera hacia el cuello y rascan varias veces durante uno o unos segundos, luego bajan esa pierna. Esta serie de acciones se cuenta como una pelea de rasguños. No se debe contar el rayado de otras áreas. NOTA: La acción del rayado es similar a la del modelo de inyección de mejillas, excepto que la ubicación del rasguño se desplaza hacia el cuello.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ikoma, A., Steinhoff, M., Stander, S., Yosipovitch, G., Schmelz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurobiology+of+itch.">The neurobiology of itch.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (7), 535-547 (2006).</li><li>Kuraishi, Y., Nagasawa, T., Hayashi, K., Satoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+behavior+induced+by+pruritogenic+but+not+algesiogenic+agents+in+mice.">Scratching behavior induced by pruritogenic but not algesiogenic agents in mice.</a> European Journal of Pharmacology. 275 (3), 229-233 (1995).</li><li>Kuraishi, Y., Yamaguchi, T., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Itch-scratch+responses+induced+by+opioids+through+central+mu+opioid+receptors+in+mice.">Itch-scratch responses induced by opioids through central mu opioid receptors in mice.</a> Journal of Biomedical Science. 7 (3), 248-252 (2000).</li><li>Shimada, S. G., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+differentiation+between+itch+and+pain+in+mouse.">Behavioral differentiation between itch and pain in mouse.</a> Pain. 139 (3), 681-687 (2008).</li><li>Kittaka, H., Uchida, K., Fukuta, N., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid-induced+itch+is+mediated+by+signalling+of+LPA5+receptor,+phospholipase+D+and+TRPA1/TRPV1.">Lysophosphatidic acid-induced itch is mediated by signalling of LPA5 receptor, phospholipase D and TRPA1/TRPV1.</a> The Journal of Physiology. 595 (8), 2681-2698 (2017).</li><li>Maekawa, T., Nojima, H., Kuraishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Itch-associated+responses+of+afferent+nerve+innervating+the+murine+skin:+different+effects+of+histamine+and+serotonin+in+ICR+and+ddY+mice.">Itch-associated responses of afferent nerve innervating the murine skin: different effects of histamine and serotonin in ICR and ddY mice.</a> The Japanese Journal of Pharmacology. 84 (4), 462-466 (2000).</li><li>Inagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+behavior+in+various+strains+of+mice.">Scratching behavior in various strains of mice.</a> Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology. 14 (2), 87-96 (2001).</li><li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+surfactant-induced+pruritus:+involvement+of+histamine+released+from+epidermal+keratinocytes.">Topical surfactant-induced pruritus: involvement of histamine released from epidermal keratinocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 344 (2), 459-466 (2012).</li><li>Vos, B. P., Hans, G., Adriaensen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+assessment+of+facial+pain+in+rats:+face+grooming+patterns+after+painful+and+non-painful+sensory+disturbances+in+the+territory+of+the+rat's+infraorbital+nerve.">Behavioral assessment of facial pain in rats: face grooming patterns after painful and non-painful sensory disturbances in the territory of the rat's infraorbital nerve.</a> Pain. 76 (1-2), 173-178 (1998).</li><li>Yeo, J. F., Ong, W. Y., Ling, S. F., Farooqui, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+injection+of+phospholipases+A2+inhibitors+modulates+allodynia+after+facial+carrageenan+injection+in+mice.">Intracerebroventricular injection of phospholipases A2 inhibitors modulates allodynia after facial carrageenan injection in mice.</a> Pain. 112 (1-2), 148-155 (2004).</li><li>Yeo, J. F., Ling, S. F., Tang, N., Ong, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinociceptive+effect+of+CNS+peroxynitrite+scavenger+in+a+mouse+model+of+orofacial+pain.">Antinociceptive effect of CNS peroxynitrite scavenger in a mouse model of orofacial pain.</a> Experimental Brain Research. 184 (3), 435-438 (2008).</li><li>Hashimoto, T., Ohata, H., Momose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Itch-scratch+responses+induced+by+lysophosphatidic+acid+in+mice.">Itch-scratch responses induced by lysophosphatidic acid in mice.</a> Pharmacology. 72 (1), 51-56 (2004).</li><li>Kremer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+is+a+potential+mediator+of+cholestatic+pruritus.">Lysophosphatidic acid is a potential mediator of cholestatic pruritus.</a> Gastroenterology. 139 (3), 1008-1018 (2010).</li><li>Alemi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TGR5+receptor+mediates+bile+acid-induced+itch+and+analgesia.">The TGR5 receptor mediates bile acid-induced itch and analgesia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (4), 1513-1530 (2013).</li><li>Nieto-Posadas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+directly+activates+TRPV1+through+a+C-terminal+binding+site.">Lysophosphatidic acid directly activates TRPV1 through a C-terminal binding site.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 78-85 (2011).</li><li>Akiyama, T., Carstens, M. I., Carstens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+itch-+and+pain-related+behavioral+responses+and+&#181;-opoid+modulation+in+mice.">Differential itch- and pain-related behavioral responses and &#181;-opoid modulation in mice.</a> Acta Dermato-Venereologica. 90 (6), 575-581 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, se introduce un modelo de inyección de mejillas y se muestra útil para el análisis del dolor y los comportamientos relacionados con la picazón.
Un informe anterior mostró que las sustancias algésicas inducen comportamientos de arañazos en una inyección de cuello de ratón modelo4. Por el contrario, la capsaicina redujo los comportamientos de arañazos en otros experimentos de inyección de cuello (Figura 3). Por lo tanto, el efecto del dolor en el comportamiento de rascarse sigue sin estar claro. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método para investigar simultáneamente el dolor y la picazón a través de pruebas de comportamiento. Mediante el uso de un modelo de inyección de mejillas, se puede evaluar el efecto de una sustancia tanto en el dolor como en la picazón.
Anteriormente se ha informado de que el LPA intracelular activa directamente TRPV1 y TRPA1 como mecanismo de picazón inducida por LPA5. En consecuencia, la picazón inducida por LPA podría ser independiente de la histamina. Un estudio anterior también demostró que un modelo de inyección de mejillas se puede utilizar para la evaluación de la picazón independiente de la histamina16. Por lo tanto, este modelo se puede utilizar tanto para la picazón dependiente de la histamina como para la picazón independiente.
Uno de los pasos críticos de este experimento es la inyección. Debido a que se trata de una prueba de comportamiento agudo, la anestesia no se puede utilizar en el paso de inyección, ya que podría afectar estos comportamientos. Por lo tanto, el ratón necesita ser sujetado de forma segura para realizar una inyección precisa. Cuando la retención del animal no es segura, especialmente cuando se inyectan algogens fuertes, los ratones pueden luchar, lo que conduce a un volumen de inyección y profundidad inexactos, seguido de dificultad para interpretar los resultados. Cuando manipule un ratón, tire de la piel de la nuca entre el pulgar y el dedo índice para inhibir el movimiento del ratón.
Otro paso crítico es el análisis del comportamiento. Debido a que rascarse es muy rápido, el video necesita ser visto cuidadosamente. Además, la limpieza puede ser difícil de distinguir de la limpieza. Por lo tanto, se recomienda el uso de productos químicos de control positivo como la capsaicina durante el primer experimento. Las condiciones de grabación y reproducción también pueden afectar al recuento de ambos comportamientos. Si es difícil observar claramente los comportamientos, los espejos se pueden utilizar alrededor de las jaulas para mejorar los ángulos de visión4.
Cabe señalar que el modelo de inyección de mejillas puede mostrar una precisión cuantitativa reducida para los productos químicos probados que en el modelo de inyección de cuello. Como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4, la misma cantidad de histamina indujo más comportamientos de arañazos en el modelo de cuello que en el modelo de mejilla, y mostró una variación más pequeña en el modelo de inyección del cuello. Una vez que se ha demostrado que una sustancia probada es un pruritogen con efectos algesicos bajos con el modelo de inyección de mejillas, se recomienda el modelo de inyección de cuello para análisis cuantitativos adicionales. Incluso con estas limitaciones, el modelo de inyección de mejillas es útil para la evaluación precisa de sustancias de ensayo, especialmente en el campo de la investigación de picazón.

Itch se caracterizó originalmente como una sensación que induce comportamientos de arañazos para eliminar materiales dañinos de la superficie de la piel. Sin embargo, la picazón ha sido el foco de las terapias para sensaciones desagradables causadas por muchas enfermedades como la dermatitis atópica, lesiones neurogénicas y colestasis1. En estos casos, la picazón es una sensación desagradable grave similar al dolor. Por lo tanto, la picazón representa un objetivo de investigación importante. El comportamiento de rascado es el principal indicador de picazón en experimentos con animales, y los comportamientos de arañazos se pueden inducir en ratones inyectando pruritógenos en la piel en su cuello2,3. Sin embargo, un estudio anterior demostró que la capsaicina, un algogeno, también induce comportamientos de rascarse en un modelo de inyección de cuello4,lo que hace difícil discriminar la picazón del dolor en este modelo.  Por el contrario, se ha encontrado que la capsaicina reduce los comportamientos de rascado en un modelo de inyección de cuello, lo que indica que el efecto del dolor en los comportamientos de rascar es complicado y depende de las condiciones experimentales.  Por lo tanto, las mediciones simultáneas del dolor y los comportamientos relacionados con la picazón permitirían el análisis preciso de los podagenos y los algogens. Steven G. Shimada y Robert H. LaMotte lograron mediciones simultáneas de dolor y comportamientos relacionados con la picazón cambiando el lugar de inyección del cuello a la mejilla4. En el modelo de inyección de mejillas, la capsaicina indujo la limpieza, pero no rascar comportamientos, mientras que la histamina, un pruritogen, sólo indujo comportamientos de rascado. Por lo tanto, este modelo permite la evaluación independiente de la picazón y el dolor, haciendo de la inyección de mejillas un modelo útil para la investigación de la picazón. Al tratar de determinar si una sustancia de ensayo es un pruritogen y/o un algogen, este modelo proporciona más información que el modelo de inyección de cuello. Este artículo describe un método práctico para realizar la inyección de mejillas y contar los efectos de rascarse o limpiar, y muestra la utilidad de este método para evaluar los comportamientos de rascado inducidos por el ácido lisofosfatídico (LPA).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">capsaicin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M2028</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td style="width:71px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">044-19772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">histamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iMovie</td>
			<td style="width:71px;">Apple</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">lysophosphatidic acid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">325465-93-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">myjector</td>
			<td style="width:71px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">ss-05M2913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tween-80</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">video camera</td>
			<td style="width:71px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;">VX985M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cheek injection model for simultaneous measurement of pain and itch-related behaviors

Itch fue definida como "una desagradable sensación cutánea que provoca un deseo de rascarse" por Rothman en 1941. En los modelos de ratón, los eventos de arañazos se suelen contar para evaluar la picazón inducida por los pruritogens. Sin embargo, informes anteriores han demostrado que las sustancias algésicas también inducen comportamientos de rascado en un modelo de inyección de cuello de ratón, que es la prueba más común utilizada para los comportamientos de rascado. Este hallazgo hace que sea difícil estudiar la picazón en ratones.  Por el contrario, capsaicina, un algogen común, reduce los comportamientos de arañazos en algunos experimentos de inyección de cuello. Por lo tanto, el efecto del dolor en los comportamientos de rascarse sigue sin estar claro. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método para investigar simultáneamente la picazón y la sensación de dolor mediante pruebas de comportamiento. Aquí, se introduce un modelo de inyección de mejillas que se puede utilizar para medir simultáneamente los comportamientos relacionados con el dolor y la picazón. En este modelo, los pruritógenos inducen comportamientos de rascarse, mientras que las sustancias algésicas inducen comportamientos de limpieza. El uso de este modelo, el ácido lisofosfatídico (LPA), un mediador de picazón que se encuentra en pacientes colestásicos con picazón, se ha demostrado que induce exclusivamente la picazón, pero no el dolor. Sin embargo, en modelos de ratón, LPA se ha divulgado para ser un pruritogen y un algogen. La investigación sobre los efectos de LPA en un modelo de inyección de mejillas de ratón mostró que LPA sólo indujo arañazos, pero no comportamientos de limpieza. Esto indica que LPA actúa como un pruritogen de manera similar en ratones y seres humanos, y demuestra la utilidad de un modelo de inyección de mejillas para la investigación de picazón.

En el modelo de inyección de cuello, la histamina indujo comportamientos de arañazos fuertes (Figura 3). El vehículo (7% entre 80 en salina) también indujo comportamientos de rascado. Un informe anterior mostró que el detergente inducido por la producción de histamina a partir de queratinocitos8. La tween 80 podría inducir picazón por mecanismos similares, mientras que la capsaicina redujo los comportamientos de rascado inducidos por el vehículo, en contra de un informe anterior4. Es posible que las diferencias de deformación unitaria del ratón podrían tener en cuenta estos resultados diferentes. Estos hallazgos indican que el efecto del dolor en los comportamientos de rascarse es complicado. Por lo tanto, la medición simultánea del dolor y los comportamientos relacionados con la picazón puede permitir el análisis preciso de los podagenos y los algogens. En el modelo de inyección de mejillas, la capsaicina no indujo comportamientos de rascado y sólo indujo comportamientos de limpieza, que se cree que están relacionados con el dolor9,10,11 ( Figura4). Inyección de capsaicina también aumentó los comportamientos de aseo (datos no mostrados). Después de la inyección en la mejilla, la histamina indujo principalmente comportamientos de rascado con comportamientos de limpieza débiles. La aplicación de un reactivo antihistamínicos, difenhidramina, inhibió el rascado. Este resultado sugiere que los comportamientos de rascado inducidos por la histamina son causados por la acción de la histamina en los receptores de histamina. Aquí, como ejemplo, se muestran los efectos de LPA en el modelo de inyección de mejillas (Figura 5). La LPA es un mediador de picazón que se encuentra en pacientes colestásicos con picazón. Sin embargo, en los modelos de ratón, LPA fue reportado como un pruritogen y un algogen12,13,14,15. Por lo tanto, los efectos de LPA se investigaron en un modelo de inyección de mejillas y los resultados mostraron que LPA indujo arañazos, pero no comportamientos de limpieza. Esto indica que LPA es un pruritogen, pero no un algogeno, en ratones similares a sus efectos en los seres humanos.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58943/58943fig3.jpg"> Figura 3: Efectos de lahistamina y la capsaicina en el modelo de inyección del cuello. (A) Comportamientos de arañazos inducidos por la inyección del vehículo (7% entre 80 en salina, cuadrado abierto), histamina (50 g/10 l por sitio, círculos rellenos) o capsaicina ( 10 g/10 l por sitio, triángulo abierto; 40 g/10 l por sitio, triángulo relleno) en el cuello se evaluaron cada 5 minutos para un total de 30 min. (B ) Análisis cuantitativo de los comportamientos de rayado durante el período de 30 minutos en el panel A. Corrección. Los datos se muestran como la media de SEM (n a 6-8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/58943fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58943/58943fig4.jpg"> Figura 4: Efectos de un pruritogen y un algogeno en el modelo de inyección de mejillas. Comportamientos de limpieza (A) y arañazos (B) inducidos por inyección de vehículo (7% entre 80 en salina, cuadrado abierto), histamina (50 g/10 l por sitio, círculos rellenos) o capsaicina (40 g/10 l por sitio, triángulo relleno) en la mejilla derecha de los ratones fueron evaluado cada 5 minutos para un total de 30 min. El grupo mostrado como círculos abiertos fue tratado con 10 sL de sal de clorhidrato de difenhidramina al 2% (p/v) (DHHCL) percutáneamente 30 minutos antes de la inyección de histamina (50 g/10 l por sitio). DHHCl se disolvió en solución salina. Análisis cuantitativo de los comportamientos de limpieza (C) y scratching (D) durante el período de 30 minutos en los paneles A y B; 8 animales por grupo. •P < 0,05,P < 0,01 de ANOVA seguido de corrección de Bonferroni. Los datos se muestran como la media de SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/58943fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58943/58943fig5.jpg"> Figura 5: LPA induce rascarse, pero no limpiar los comportamientos en el modelo de inyección de mejillas. Rascado (A) y limpieza (B) comportamientos inducidos por inyección de vehículo (sinalina, cuadrados abiertos) o LPA (100 nmol/10 L por sitio, círculos rellenos) en la mejilla derecha de ratones se evaluaron cada 5 minutos para un total de 30 min. Análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del análisis cuantitativo del mg. comportamientosde rascado ( C ) y limpieza (D) durante el período de 30 minutos en los paneles A y B; n 17 para el vehículo y no 20 para el LPA. •P < 0,05, P< 0,01 por la prueba t de Welch. Los datos se muestran como la media de SEM. Esta cifra ha sido modificada de Kittaka et al.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/58943fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58943/58943movie1.jpg"> Película 1: Película que demuestra cómo afeitarse una mejilla del ratón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/Yamanoi_re-Rev._Movie_1.mp4" target="_blank"> (Haga clic con</a> el botón derecho para descargar.)
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/58943/58943movie2.jpg"> Película 2: Película que demuestra la inyección en una mejilla del ratón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/Yamanoi_re-Rev._Movie_2.mp4" target="_blank"> (Haga clic con</a> el botón derecho para descargar.)
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/58943/58943movie3.jpg"> Película 3: Película que demuestra el comportamiento típico de limpieza. Esta película se muestra a una velocidad del 25%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/Yamanoi_re-Rev._Movie_3.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con</a> el botón derecho para descargar.)
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/58943/58943movie4.jpg"> Película 4: Película de comportamiento típico de arañazos. Por <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/Yamanoi_re-Rev._Movie_4.mp4" target="_blank">favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con</a> el botón derecho para descargar.)
<img alt="Movie 5" src="/files/ftp_upload/58943/58943movie5.jpg"> Película 5: Película de comportamiento de aseo típico. Esta película se muestra a una velocidad del 25%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58943/Yamanoi_re-Rev._Movie_5.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con</a> el botón derecho para descargar.)

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Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Normalmente, el modelo de inyección del cuello del ratón se utiliza para evaluar los comportamientos de arañazos inducidos por pruritogen. Sin embargo, el modelo proporciona información sólo sobre la picazón, no el dolor. Aquí, un modelo de inyección de mejillas se introduce en ratones que se puede utilizar para medir simultáneamente el dolor y los comportamientos relacionados con la picazón.

Modelo de inyección de mejillas para la medición simultánea del dolor y los comportamientos relacionados con la picazón

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Nuestros datos indican que los algogens reducen los comportamientos de rayado, pero el efecto de la capsaicina en los comportamientos de rayado sigue sin estar claro. Por lo tanto, una medición simultánea de cada cantidad de dolor es importante. El método tradicional proporciona información solo para la picazón o las sensaciones de dolor, pero el modelo de inyección de mejillas proporciona información para la picazón y el dolor, por separado y simultáneamente.La inyección de la mejilla puede ser difícil al principio, ya que se necesita práctica para discriminar los comportamientos de rascado, limpieza y aseo. La demostración en vídeo de la inyección y el análisis del comportamiento puede ser útil para dominar las técnicas. Para un experimento de inyección de mejillas, el día antes de la evaluación, afeite el pelaje en la mejilla de cada ratón con cortapelos y monte una cámara de video con una velocidad de fotogramas de 30 a 60 fotogramas por segundo en un trípode, en un ambiente de temperatura, humedad y sonido controlado.Coloque cuatro jaulas debajo de la cámara en la orientación indicada y coloque las pantallas entre cada jaula para evitar que los ratones se vean entre sí. Un día después del afeitado, coloque un ratón en cada jaula de grabación durante una hora para aclimatar a los animales a las condiciones de grabación. Si se va a utilizar un tratamiento tópico, aplíquelo en este momento.Mientras los animales se aclimatan, cargue la sustancia de prueba de interés en una jeringa de 0,5 mililitros equipada con una aguja de calibre 29 o 30 por ratón. Al final del período de aclimatación, inicie la grabación de vídeo antes de la inyección. A continuación, inyecte una solución de 10 microlitros de la sustancia de ensayo intradérmicamente en la mejilla afeitada del animal despierto.A continuación, devuelva los ratones inyectados a sus respectivas jaulas y continúe la grabación de vídeo durante 30 minutos. Al final del experimento, cargue el vídeo en un programa de software de edición de vídeo adecuado. Cuenta cada vez que un ratón levanta una pata trasera hacia la mejilla y se rasca varias veces durante uno o unos segundos antes de colocar la pierna hacia abajo como una pelea de rasguño.Los ratones usan una sola pata delantera para limpiar, y ambas patas delanteras para el aseo, pero solo los comportamientos de limpieza se cuentan como comportamientos relacionados con el dolor. Para un experimento de inyección de cuello, un día antes del experimento, afeita el pelaje en la nuca de cada ratón con cortapelos. Un día después del afeitado, aclimate a los ratones en las jaulas de grabación durante una hora antes de inyectar 10 microlitros de la sustancia de ensayo de interés intradérgicamente en el cuello afeitado, en condiciones de despertar.Devuelva a los animales inyectados a sus jaulas de grabación y grabe los comportamientos del ratón durante 30 minutos. A continuación, cuente los combates de rascado en el cuello y cualquier comportamiento de limpieza de la cara como acaba de demostrar. En el modelo de inyección de cuello, la histamina induce fuertes comportamientos de rascado, mientras que el vehículo induce arañazos leves.En el modelo de inyección de mejillas, la capsaicina no induce comportamientos de rascado, pero induce comportamientos de limpieza, que se cree que están relacionados con el dolor. Después de la inyección en la mejilla, la histamina induce principalmente comportamientos de rascado con comportamientos de limpieza débiles. La aplicación de un reactivo antihistamínico inhibe el rascado, lo que sugiere que los comportamientos de rascado inducidos por histamina son causados por la reacción de histamina en los receptores de histamina.En este experimento, la aplicación de un mediador de picazón indujo arañazos, pero no comportamientos de limpieza, lo que indica que el mediador probado actúa como un pruritogen, pero no un algogen en ratones, similar a sus efectos en humanos. Este método permite distinguir la picazón y las sensaciones de dolor con un solo procedimiento. Se puede hacer un análisis de comportamiento detallado centrándose en la picazón o la sensación del dolor.Los comportamientos de picazón y dolor otorgan diferentes respuestas. Además, estas técnicas no son difíciles. El procedimiento de inyección y observación de la mejilla puede permitir que varios de nuestros compañeros de entrenamiento dominen.Apreciamos la introducción del modelo de inyección de mejillas por el profesor LaMotte en la Universidad de Yale.

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