Name: purification and analytics of a monoclonal antibody from chinese hamster ovary cells using an automated microbioreactor system
Uploaded: 2019-05-01T13:30:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا سكوت لوت على الدعم التحليلي الذي قدمه. ويقدم برنامج المسار الحرج CDER (CA #1-13) التمويل والدعم الداخليين الجزئيين لهذا العمل. ويدعم هذا المشروع جزئيا تعيين في برنامج المشاركة في التدريب الداخلي / البحوث في مكتب منتجات التكنولوجيا الحيوية، وإدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة، التي يديرها معهد أوك ريدج للعلوم والتعليم من خلال اتفاق بين الوكالات بين وزارة الطاقة الأميركية وادارة الاغذية والعقاقير.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).</li><li>New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm">https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm</a> (2015)</li><li>Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+Emergence+of+Therapeutic+Monoclonal+Antibodies.">Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies.</a> Circulation. 127, 2222-2230 (2013).</li><li>Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+clone+selection+using+high-throughput+bioreactors.">Advances in clone selection using high-throughput bioreactors.</a> Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).</li><li>Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+structural+modifications+of+immunoglobulin+G+and+their+effect+on+biological+activity.">Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity.</a> Analytical &amp; Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).</li><li>Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roadmap+for+implementation+of+quality+by+design+(QbD)+for+biotechnology+products.">Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products.</a> Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Council+for+Harminisation+of+Techinical+Requirements+for+Pharmaceuticals+for+Human+Use.">International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use.</a> ICH. , (1999).</li><li>Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+tools+for+characterizing+biopharmaceuticals+and+the+implications+for+biosimilars.">Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).</li><li>Velugula-Yellela, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+high-throughput+automated+microbioreactor+system+for+production+of+model+IgG1+in+CHO+cells.">Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+liquid+chromatography-mass+spectrometry+methods+for+the+comprehensive+characterization+of+therapeutic+glycoproteins,+from+released+glycans+to+intact+protein+level.">Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).</li><li>Yang, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+correlation+between+charge+and+glycosylation+of+IgG1+variants+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).</li><li>Agarabi, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+Process+Parameter+Screening+Utilizing+a+Plackett-Burman+Design+for+a+Model+Monoclonal+Antibody.">Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).</li><li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Exclusion+Chromatography+with+On-Line+Light-Scattering,+Absorbance,+and+Refractive+Index+Detectors+for+Studying+Proteins+and+Their+Interactions.">Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions.</a> Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).</li><li>Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+ranibizumab+(Lucentis)+or+bevacizumab+(Avastin)+with+dexamethasone+and+triamcinolone+acetonide:+An+in+vitro+stability+assessment.">Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).</li><li>Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+high-molecular-weight+nonnative+aggregates+and+aggregation+kinetics+by+size+exclusion+chromatography+with+inline+multi-angle+laser+light+scattering.">Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).</li><li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li><li>Han, H., Livingston, E., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+profiling+of+charge+heterogeneity+in+antibodies+by+microchip+electrophoresis.">High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).</li><li>Wheeler, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip+zone+electrophoresis+for+high-throughput+analysis+of+monoclonal+antibody+charge+variants.">Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).</li><li>Carrillo-Cocom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+consumption+in+naive+and+recombinant+CHO+cell+cultures:+producers+of+a+monoclonal+antibody.">Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).</li><li>Chen, P., Harcum, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+amino+acid+additions+on+ammonium+stressed+CHO+cells.">Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells.</a> Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).</li><li>Xing, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+amino+acid+composition+of+CHO+cell+culture+media+for+a+fusion+protein+production.">Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production.</a> Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+and+glucose+metabolism+in+fed-batch+CHO+cell+culture+affects+antibody+production+and+glycosylation.">Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).</li><li>Read, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentanomics+informed+amino+acid+supplementation+of+an+antibody+producing+mammalian+cell+culture.">Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture.</a> Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).</li><li>Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+A+chromatography+increases+monoclonal+antibody+aggregation+rate+during+subsequent+low+pH+virus+inactivation+hold.">Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold.</a> Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).</li><li>Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+analysis+of+therapeutic+glycoproteins.">Glycan analysis of therapeutic glycoproteins.</a> MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).</li><li>Wahl, O., Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+analysis+for+pharmacopoeial+purposes.">Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes.</a> Talanta. 154, 150-163 (2016).</li><li>Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive+method+for+quantitative+analysis+of+underivatized+amino+acids+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+(LC-MS/MS).">A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).</a> Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).</li></ol>

ويعكس هذا المنشور آراء المؤلف ولا ينبغي تفسيره على أنه يمثل آراء أو سياسات هيئة التنمية الحرجية.

يحتوي الصندوق على حطام وجسيمات كبيرة يمكن أن تسد وتدمر الأجهزة المكلفة، وبالتالي هناك حاجة إلى توضيح الثقافة قبل مزيد من المعالجة النهائية. الطرد المركزي هو عموما النهج الأول لفصل الخلايا وغيرها من الجسيمات غير القابلة للذوبان من البروتينات تليها الترشيح. ثم يخضع هذا HCCF المصفاة للبروتين السريع اللوني السائل (FPLC) لتنقية. تنقية HCCF من المفاعلات المجهرية الآلية للحصول على المنتج هو خطوة هامة في معالجة المصب. هنا، يتم استخدام نظام FPLC على سطح المقعد مع بروتين عمود A للحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة من HCCF. يمكن أن توفر تحليلات العمليات التمهيدية رؤية مفيدة لسلوك الخلايا وتوجه تصميم العمليات الحيوية، مما يساعد على الحصول على منتج جودة متسقة وموثوق بها. كما تسمح لنا Analytics بربط سمات الجودة الحرجة (CQAs) بالعمليات التمهيدية والنهائية. وترد هنا أربعة مقالات شائعة الاستخدام في توصيف الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وهذه التقنيات قوية وموثوق بها وقابلة للنشر بسهولة لتحليل العمليات والمنتجات من مجموعة متنوعة من مصادر المنبع التي لا تُطهى إلا جزئياً وقد لا تزال تحتوي على مستويات متبقية من الحمض النووي وHCP.
عند تنظيف العينات للتحليلات، يجب تحقيق توازن مهم بين إنشاء عينة نظيفة بما فيه الكفاية للتحليل مع الحفاظ على التباين الموجود في المفاعل الحيوي. والملوثات الأكثر شيوعاً التي تؤثر على المنتج هي الحمض النووي وHCP، والتي يمكن فحصها بقياس نسبة الامتصاص عند 260/280 نانومتر ومن خلال SDS-PAGE أو μCE-SDS. الاختبارات المعروضة هنا ليست حساسة لمستويات منخفضة من محتوى الحمض النووي. نقاء المنتج هو > 95٪ نقية، كما يحددها μCE-SDS.
تحليل متغير تهمة مع نظام الكهربائي microcapillary يوفر طريقة عالية الإنتاجية لتحديد المتغيرات تهمة، مع رقائق والكواشف التي هي سهلة نسبيا لتنفيذ. طبيعة هذه التقنية وكيمياء الكاشف وضع العلامات على حد سواء حساسة للسواغ وغيرها من الأمينات الأولية، وبالتالي تتطلب خطوة إزالة الأملاح لمعظم مصفوفات العينة. من الخبرة، وانخفاض مستويات الحمض النووي المشترك في الهجرة مع الصبغة الحرة من رد فعل وضع العلامات ولا تؤثر على نوعية النتائج. في حين أن تقلب القياس الكمي الأساسي والرئيسي والحمضي هو عادة <1%، فإن المستويات الأعلى من الحمض النووي والملوثات الأخرى يمكن أن تزيد من تقلب الفحص. من المهم للغاية أن تكون متسقة مع وضع العلامات البروتين وضمان الاستخدام الفوري لDMF بعد إزالة من الزجاجة ويجري مختلطة مع الصبغة. ينصح ليسين و / أو معايير الهيستيدين كضوابط وضع العلامات. مع مرور الوقت، واعتمادا على نوعية العينة، رقائق يمكن أن كريهة أو تفقد الطلاء على قنوات microfluidics، مما يؤدي إلى مزيد من الضوضاء، ووجود قمم شبح، والمزيد من عينة إلى عينة الاختلاف. ولتحديد هذا الحدوث، تم تحليل الفراغات ومعيار ملاءمة النظام (أي NISTmAb) في نفس الوقت مع العينات على فترات منتظمة. عندما تنشأ مشاكل رقاقة، يمكن غسلها رقائق مع حل التخزين أو استبدالها.
الأساليب المستخدمة لتحليل الجليكان من البروتينات السكرية العلاجية تنطوي في المقام الأول على الكروماتوغرافيا السائلة (LC) و / أو قياس الطيف الكتلي (MS)، مع تحليل الكليكة الدقيقة تكتسب شعبية كخيار ثالث25. تستخدم الطريقة الموضحة في هذه الورقة كل من LC وMS، والتي لها فوائد وعيوب. الأساليب الطيفية الكتلية لها ميزة التحقق الشامل من الغليكانات التي تم تحليلها، وهو أمر غير ممكن باستخدام الأساليب المستندة إلى LC باستخدام إخراج الكشف الفلورسنت أو الكتين microarrays. يستخدم هذا الأسلوب LC والكشف عن الفلورة لتعيين هويات الغليكان باستخدام مقارنة وقت الاحتفاظ إلى معيار سلم dextran. ويتيح رصد الفلورة زيادة الحساسية والتحديد الكمي بسبب سهولة اكتشافه، حيث قد لا تتمكن التصلب المتعدد وحدها من تحديد كمية الأنواع ذات الوفرة المنخفضة بسبب ضعف كفاءة التأين في القلة. يتم استخدام المعلومات الجماعية من MS لتأكيد هويات الغليكان، ولكن برنامج المعالجة لا يستخدم المعلومات الجماعية كمعايير التعيين الأساسية. وبالتالي، دون الكروماتوغرافيا القابلة للاستنساخ والقمم القابلة للحل بسهولة، يمكن أن تعاني هذه الطريقة فيما يتعلق بمهام الغليكان. لحسن الحظ، يمكن أن تساعد المعلومات الجماعية في تخصيصات الغليكان حتى في الحالات التي يكون فيها التصوير اللوني دون المستوى، مثل التحولات في وقت الاحتفاظ التي تعوق تعيينات الغليكان القابلة للاستنساخ. إذا تم استخدام هذه الطريقة دون مرض التصلب العصبي المتعدد، يجب أن يكون اللوني على أعلى مستوى حيث لا يمكن استخدام المعلومات الجماعية لتصحيح الانجراف وقت الإقامة.
طريقة تحليل الأحماض الأمينية الموصوفة هنا يستخدم LC-MS لكمية سريعة من الأحماض الأمينية المنكفية في وسائل الإعلام ثقافة الخلية الخام. تتطلب طرق تحليل الأحماض الأمينية البديلة عوامل اشتقاق الأحماض الأمينية لتمكين الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية26. طريقة LC-MS تقدم مزايا هامة على طريقة LC-UV: فهو يسمح لتحديد على أساس كل من وقت الاحتفاظ وكتلة أيون بدلا من طريقة LC-UV، والتي تقتصر على عدم وجود توصيف الكتلة. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة LC-MS توفر مزايا الوقت والتكرار، لأن طريقة LC-UV تتطلب تفاعل اشتقاق يستغرق وقتا طويلا، مما قد يضفي على عينة من التغير27. ومع ذلك، فإن حقن وسائل الإعلام ثقافة الخلية الخام في طريقة LC-MS يمكن أن يسبب آثار ضارة على إشارة MS بسبب المقشدة أيون قاذورات. يتم حقن سلم المعايرة بشكل متكرر كفحص ملاءمة للنظام، ويتم عشوائية ترتيب العينة لمنع التحيز في البيانات.
وقد سبق وصف عملية زراعة الخلايا لإنتاج الأجسام المضادة باستخدام المفاعلات المجهرية9. في هذه الدراسة، يتم تعريف البروتوكولات التفصيلية لطرق توصيف الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تزيد من البيانات التي تم الحصول عليها من أحجام العينة المحدودة بشكل جيد. كميات محدودة من السائل زراعة الخلايا التي تم حصادها يمكن أن تقيد في بعض الأحيان معلومات المنتج المكتسبة واختيار الإجراءات التحليلية الصحيحة للحصول على بيانات جودة المنتج أمر ضروري. التحليلات مهمة لربط معلمات العملية التمهيدية مع التغيرات في جودة المنتج. هنا، يتم توفير مبدأ توجيهي للمستخدمين لتوصيف mAbs عند العمل مع المفاعلات الدقيقة.

يتم استخدام علاجات البروتين لعلاج مجموعة متنوعة متزايدة من الحالات الطبية بما في ذلك مضاعفات زراعة الأنسجة، واضطرابات المناعة الذاتية، والسرطانات1. منذ عام 2004، وثقت إدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة (USFDA) نسبة متزايدة من طلبات الترخيص البيولوجي (BLAs) من جميع الموافقات التي ينظمها مركز تقييم الأدوية والبحوث (CDER)، مع BLAs تمثل أكثر من 25٪ في عامي 2014 و 20152.
وبالنظر إلى هذا السوق الآخذة في التوسع، تواجه الشركات المصنعة للمستحضرات الصيدلانية الحيوية تحديا مع تقديم المزيد من المنتجات بسرعة مع نوعية متسقة. وقد ركزت الجهود الرامية إلى زيادة إنتاج المنتجات على هندسة الخلايا CHO وفحص خط الإنتاج، على الرغم من أن أهم التحسينات تعزى إلى التقدم المحرز في تحسين استراتيجية وسائل الإعلام / تغذية والضوابط البيئية ثقافة الخلايا1، 3 , 4 , 5 خلال عملية التصنيع.
وبما أن الـ mAbs يتم إنتاجها في نظام بيولوجي، يمكن أن يكون هناك تباين البروتين المتأصل. يمكن تغيير تكوين الأجسام المضادة بعد الترجمة، مثل غليكوزيل أو تتأثر بالتدهور أو ردود الفعل الأنزيمية. هذه الاختلافات الهيكلية قد تثير ردود فعل مناعية خطيرة أو تغييرربط الأجسام المضادة، والتي بدورها يمكن أن تقلل أو القضاء على وظيفة العلاجية المقصود5 . وهكذا، يتم رصد ومراقبة سمات الجودة الحرجة (CQAs) من الأجسام المضادة أحادية النسيلة - الملف الشخصي N-غليكان، وتوزيع متغير المسؤول، والنسبة المئوية للجسم المضاد في شكل أحادي - بانتظام والسيطرة عليها كجزء من نهج الجودة حسب التصميم (QbD) خلال عمليات التصنيع1،6. في بيئة الإنتاج المنظمة، يجب أن تفي البروتينات العلاجية بمعايير القبول ليتم ترخيصها كمنتج دواء تجاري معتمد7. الطرق المعروضة هنا عادة ما تكون جزءا من عملية توصيف الجودة لجسم مضاد7،8، وسوف يكون أي عالم البروتين على دراية باستخدامها.
وفي العملالسابق 9، تم وصف تطبيق وتشغيل المفاعلات المجهرية لفحص الإنتاجية العالية لظروف زراعة الخلايا في المعالجة الأحيائية في المنبع. المنتج النقي الذي تم الحصول عليه من ظروف وسائل الإعلام المختلفة يخضع لتحليل N-glycan باستخدام LC-MS. يمكن الكشف عن أنماط Glycosylation من البروتينات العلاجية وتتميز باستخدام تقنيات LC-MS10،11،و وقد تم ربط وجود مختلف أنواع الجلايسان إلى المعلمات العملية الحيوية مثل استراتيجية تغذية، ودرجة الحموضة، ودرجة الحرارة12. كما يتم تقييم تأثير ظروف الوسائط المختلفة على جودة المنتج، التي تشير إليها النسبة المئوية لـ IgG الناتجة في شكل أحادي، مع تحديد الحجم اللوني - تشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)13و14 , 15-يمثل ملف تعريف متغير الشحن عدداً من التعديلات16 التي يمكن أن تؤثر على وظيفة المنتج. الكهربائي للمنطقة المجهرية (mCZE) هو تقنية توفر وقت تحليل أسرع بكثير مقارنة بالتصوير اللوني التقليدي لتبادل الموجبة (CEX) وأساليب التركيز النظائري الشعرية (cIEF) المستخدمة في تحليل متغير الشحنة17 ،18. تم تحليل الوسائط مفاعل حيوي قضى لتتبع استهلاك الأحماض الأمينية أثناء إنتاج البروتين كما يتعلق بالتغيرات في سمات تحديد الأجسام المضادة19،20،21،22 , 23.
تسمح لنا تحليلات البروتين بتحديد معلمات العملية الحرجة (CPPs) استنادًا إلى العلاقات بين مدخلات العملية والتغيرات في الـ CQAs. وأثناء تطوير العمليات الأحيائية، فإن تحديد وقياس برامج الإنتاج الأنظف يبينان بشكل أساسي مراقبة العمليات ويضمنان عدم تغيير المنتج، وهو أمر أساسي في بيئات التصنيع التي تخضع لضوابط صارمة. في هذه الورقة، يتم عرض تقنيات تحليلية لقياس بعض الخصائص البيوكيميائية للبروتين الأكثر صلة بمنتجات CQAs (N-جليكان الشخصي، والمتغيرات المسؤولة، وتجانس الحجم).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:373px;">CHO DG44 Cell Line</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">A1100001</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Akta Avant 25</td>
			<td>General Electric Life Sciences</td>
			<td>28930842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>115115830</td>
			<td>Purification Stationary Phase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:373px;">Omnifit 10cm Column</td>
			<td style="width:191px;">Diba Fluid Intelligence</td>
			<td>006EZ-06-10-AA</td>
			<td style="width:177px;">Housing for Stationary Phase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18-1113-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#181;Dawn Multi Angle Light Scattering Detector</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td>WUDAWN-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.22 &#181;m Millex GV Filter Unit PVDF Membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12 mL Syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881512878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity DAD&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Sampler</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 uL Glass Inserts with Polymer Feet&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-Well Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>127737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BPA996-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACQUITY I-Class UPLC BSM</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>18601504612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186015000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACQUITY UPLC FLR Detector</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176015029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC810096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Amino Acid Standard, 1 nmol/&#181;L&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5061-3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amino Acid Supplement</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5062-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blue Screw Caps with Septa</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD OptiCHO AGT Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1122205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Charge Variant Chip</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>760435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Charge Variant Reagent Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS760670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Chromatography Water (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethylformamide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176003712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Buffer Tubes</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>697075- NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Detection Window Cleaning Cloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21912-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII HT Touch</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS138160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Ladder Tubes</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>C-3258-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Lint-Free Swab</td>
			<td>ITW Texwipe</td>
			<td>TX758B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Intact mAb Mass Check Standard</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm</td>
			<td>Imtakt</td>
			<td>WAA25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>840274100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td>WTREX-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Perchloric acid</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1034-960-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screw Top Clear Vial 2mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>383112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L</td>
			<td>Tosoh Biosciences</td>
			<td>003449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UNIFI Scientific Information System</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667005138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuum Manifold Shims</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuum Pump</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xevo G2 Q-ToF</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186005597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89883</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and analytics of a monoclonal antibody from chinese hamster ovary cells using an automated microbioreactor system

الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) هي واحدة من المنتجات البيولوجية الأكثر شعبية وتتميز بشكل جيد المصنعة اليوم. الأكثر شيوعا المنتجة باستخدام خلايا المبيض الهامستر الصينية (CHO) ، يجب تحسين الثقافة وظروف العملية لتحقيق أقصى قدر من titers الأجسام المضادة وتحقيق ملامح الجودة المستهدفة. عادة، يستخدم هذا التحسين المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية (15 مل) لفحص ظروف عملية متعددة بالتوازي. وتشمل معايير التحسين الأداء الثقافي وسمات الجودة الحرجة (CQAs) لمنتج الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb)، والتي قد تؤثر على فعاليته وسلامته. وتشمل مقاييس الأداء الثقافي نمو الخلايا واستهلاك المغذيات، في حين تشمل الـ CQAs ملامح N-glycosylation والتجميع الخاصة بـ mAb، ومتغيرات الشحن، والوزن الجزيئي. يصف هذا البروتوكول المفصل كيفية تنقية وتحليل عينات HCCF التي ينتجها نظام مفاعل ميكروبروبيو آلي للحصول على مقاييس ونواتج أداء قيّمة. أولا، بروتين آلي يتم استخدام طريقة بروتين سريع للكروماتوغرافيا السائلة (FPLC) لتنقية mAb من عينات زراعة الخلايا التي تم حصادها. وبمجرد تركيزها، يتم تحليل ملامح الغليكان عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام منصة محددة (راجع جدولالمواد). يتم تحديد الأوزان الجزيئية الأجسام المضادة وملامح التجميع باستخدام حجم استبعاد الكروماتوغرافيا متعددة زاوية تشتت الضوء (SEC-MALS)، في حين يتم تحليل المتغيرات تهمة باستخدام الكهروريس المنطقة الشعرية رقاقة (mCZE). بالإضافة إلى مقاييس الأداء الثقافي التي تم التقاطها أثناء عملية المفاعل الحيوي (أي قدرة الثقافة على البقاء، وحساب الخلايا، والأيض الشائع بما في ذلك الجلوتامين، والجلوكوز، واللاكتات، والأمونيا)، يتم تحليل الوسائط المستهلكة لتحديد المواد الغذائية المقيدة تحسين استراتيجيات التغذية وتصميم العملية الشاملة. ولذلك، يتم أيضا وصف بروتوكول مفصل للقياس الكمي المطلق للأحماض الأمينية عن طريق قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) من الوسائط المستهلكة. تستفيد الأساليب المستخدمة في هذا البروتوكول من الأنظمة الأساسية عالية الإنتاجية المتوافقة مع أعداد كبيرة من العينات ذات الحجم الصغير.

يتم تنقية السائل زراعة الخلايا التي تم حصادها من المفاعل الحيوي الآلي على نطاق صغير باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة سريعة البروتين (FPLC)، كما رأينا في الشكل 1 وسمات الجودة الحرجة للبروتينات النقية (CQAs) تتميز بمختلف الأساليب التحليلية المصب. وهذا فائدة رئيسية من نظام المفاعلات المجهرية الآلي؛ ويمكن تقييم الاختلافات في CQAs بسرعة عبر مجموعة واسعة من الظروف. وينبغي أن تظهر بيانات N-glycan من MAbs المنتجة من CHO التي تتم معالجتها عن طريق قياس الطيف الكتلي مثل مخططات الكروماتوغرام الموضحة في الشكل 2. يصور هذا الرقم مقارنة بين اثنين من الكروماتوغرام تبين أن ذروة mannose 5 (M5) من عينة واحدة أقل بكثير. إذا لوحظ خط أساس صاخبة فقط بدلاً من القمم، قد يعني هذا أن إعداد اللوني خاطئ أو أن الإجراء غير ناجح. باستخدام عناصر التحكم، يمكن تبسيط استكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا، تقييم قمم FLR من سلم dextran; تشير هذه القمم إلى أن النظام اللوني يعمل بشكل صحيح. بعد ذلك، قارن القمم التي تم الحصول عليها تجريبيًا مع تلك التي تم الحصول عليها من معيار mAb سليمة معالجة. إذا كانت القمم من المعيار مرئية، ولكن لم يتم التعرف على قمم عينة، ثم لم تتم معالجة عينات mAb بشكل صحيح. قد يكون هذا بسبب وجود SDS أو النوى في المخزن المؤقت تتداخل مع وضع العلامات N-غليكان وتنقية.
يمكن استخدام SEC-MALS لتقييم اثنين من CQAs أكثر: ملف التجميع والوزن الجزيئي للجسم المضاد. ويشبه الرسم البياني للكرومات والرسم البياني التمثيلي لـ SEC-MALS الرسم البياني الذي هو مبين في الشكل 3. تم تحديد توزيع الكتلة الجزيئية والوزن الجزيئي المطلق باستخدام البرنامج المطلوب مع معامل انقراض قدره 1.37 مل * (مغ * سم)-1 وdn/dc من 0.185 مل / غرام. كما يتم تنفيذ ذروة استدعاء وتعيين الأساس في البرنامج يدوياً، قد تختلف النتائج قليلاً من مستخدم إلى آخر. الوزن الجزيئي المطلق للIgG1 الأحادي من الشكل 3 هو 1.504 × 105 دا ± 0.38٪ (أزرق) ومجمع ترتيب أعلى هو 7.799 × 105 دا ± 3.0٪ (الأحمر). تعدد التشتت من المجاميع هو أكبر بكثير من ذلك من مونومر، كما هو مبينفي التوزيع الشامل الأضراس الحمراء من الذروة 1 (الشكل 3). والكمية الصغيرة من العينة وأهمية التجميع كـ CQA تجعل هذه التقنية أداة تحليلية تكميلية قيّمة للغاية لنظام المفاعلات المجهرية الآلي.
نتيجة mCZE هو الكهربائي، كما هو الحال في الشكل 4، والذي يظهر الملف الشخصي البديل تهمة لجسم مضاد أحادي النسيلة. الملف الشخصي هو توقيع فريد للبروتين يجري التحقيق وحساسة للغاية لدرجة الحموضة التشغيل. كما يظهر على الذروة الحرة صبغ إلى يسار الملف الشخصي البديل تهمة. عند إنشاء رقم الهيدروجيني التشغيل، هناك بعض السلطة التقديرية للمشغل لتحقيق التوازن بين القرار والإشارة؛ وبالإضافة إلى ذلك، يجب على المشغل ضمان فصل جيد من الذروة الحرة صبغ الذي يهاجر في ~ 30 s. ويمكن إزالة الملح من العينة بعد وضع العلامات لإزالة هذه الذروة، على الرغم من أن هذا يؤدي إلى خسارة كبيرة في الإشارة. بمجرد إنشاء رقم الهيدروجيني التشغيل، يمكن مقارنة ملفات تعريف العينة. في حين متسقة عموما، يمكن أن تؤدي التغييرات في كفاءة وضع العلامات أو الاختلافات في سواغ إلى اختلافات طفيفة في ترحيل عينة وملف تعريف متغير تهمة مما يجعل من الصعب مقارنة الترجيوم الكهربائي مباشرة. وبدلاً من ذلك، تستند طريقة المقارنة عادة ً إلى النسب المئوية للأنواع الأساسية والرئيسية والحمضية. في هذه الحالة، يمكن تحديد الاختلافات النسبية الصغيرة مثل 1-2٪ باستخدام mCZE.
يمكن رصد استهلاك الأحماض الأمينية لتحديد ما إذا كان الاستنفاد يسبب تغييرات في CQAs. يمكن استخدام قراءة اتّصال الكروماتوغرام من مطياف الكتلة لتقييم النجاح في إنشاء منحنى معايرة للكم المطلق للأحماض الأمينية في عينات الوسائط المفاعل الحيوي الخام. ويبين الشكل 5 رسمين بيانيين لونيين أيونيإجماليين (TIC) ومخطط كروماتوغرام أيوني استخراجي (XIC) كنتائج تمثيلية خلال هذه العملية. في الشكل 5A، يصور TIC المعروض إشارة الخلفية من النظام المؤقت حيث تم حقن فراغ الماء فقط. الشكل 5 B يصور TIC ممثل من معيار الأحماض الأمينية حيث، بالمقارنة مع المياه فارغة، يمكن ملاحظة قمم صغيرة تتوافق مع الأنواع الأحماض الأمينية الفردية (مثل يسين في 7.96 دقيقة). لدمج الذروة وتسهيل التحديد الكمي لمنطقة الذروة (وبالتالي التركيز)، يتم استخدام XIC حيث يتم عرض إشارة فقط من "نافذة كتلة كروماتوغرام" محددة. اعتمادا على حساسية الصك ونوعية الفصل اللوني، فإن نافذة الكتلة المثلى يجب أن يحددها المستخدم. في هذا المثال (الشكل 5C) ، وXIC من يسين (م / ض = 147.1144) مع نافذة كتلة من 10 جزء في المليون يظهر حيث يظهر يسين في معيار الأحماض الأمينية elutes قبالة العمود في 8.03 دقيقة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig1.jpg"> الشكل 1 . الكروماتوغرام التمثيلي لمخطط التنقية باستخدام تقنية الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع (FPLC). يتم تسمية مراحل طريقة التنقية المقابلة لوحدة التخزين (مل) على طول المحور س. يتم رصد امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر (mAU y-محور، خط صلب) طوال دورة تنقية. يتم إزاحة الشوائب غير ملزمة على وجه التحديد عن طريق زيادة الموصلية (mS /cm y-axis, dashed line) أثناء غسل الملح العالي. يظهر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig2.jpg"> الشكل 2 تم الحصول على مخطط كروماتوغرام الفلورة التمثيلي من الغليكانات ذات العلامات التي يتم التحقق منها على نطاق واسع. المحور س هو وقت الاحتفاظ (بالدقائق) بينما محور ص هو كثافة الإشارة. الذروة في 14.94 دقيقة يمثل مانوسي 5 (M5) غليكان، حيث يمكن ملاحظة فرق كبير بين قوة إشارة M5 بين العينات التي هي متراكبة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig3.jpg"> الشكل 3 توزيع الوزن الجزيئي للجسم المضاد أحادي النسيلة IgG1. مخطط كروماتوغرام لجسم مضاد أحادي النسيلة IgG1 سليم يفصله الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم في 1x PBS (pH7.4). ويتم رصد الامتصاص عند 280 نانومتر (أسود؛ المحور الأيسر) واستخدمت أجهزة الكشف عن مؤشرات التشتت والضوء لحساب الوزن الجزيئي المطلق لكل قمة (الأحمر والأزرق؛ المحور الأيمن). يشار إلى الأنواع عالية الوزن الجزيئي مع ذروة المسمى "HMW". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig4.jpg"> الشكل 4 . شحن الملف الشخصي البديل من الأجسام المضادة أحادية النسيلة IgG1. يتم إنشاء هذا الرسم الكهربائي على منصة mCZE. يهاجر قمة الصبغة الحرة في حوالي 30 ق ويتم فصلها بشكل جيد عن IgG1. وللتقدير الكمي، تم تقسيم القمم إلى أنواع أساسية ورئيسية وحمضية باستخدام برمجيات تحليل بيانات الأجهزة. يحدد الخط الأحمر مناطق الذروة المتكاملة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig5.jpg"> الشكل 5 النتائج التمثيلية للكروماتوغرامات الأيونية لتحليل الأحماض الأمينية المستندة إلى الطيف الكتلي لوسائل الإعلام المفاعل الحيوي الخام. المحور س هو الوقت (بالدقائق) في حين أنالمحور ص هو شدة الإشارة (A) الماء الفارغ بمثابة التحكم السلبي ويكشف عن إشارة الخلفية التي لوحظت على مدى التدرج اللوني السائل (B) والأحماض الأمينية 225 pmol /μL يستخدم المعيار هنا كتحكم إيجابي، كما تمثل القمم الفردية التي لوحظت في هذا الكروماطوغرام الأيونالكلي الأحماض الأمينية المختلفة للمزيج القياسي الذي يتم حله لونيا (C) ممثل مستخرج من الكروماتوغرام الأيون يستخرج لm /z 147.1144، وهو يسين. ال 7.96 دقيقة قمة في [ب] يماثل إلى ال 8.03 قمة في [ك] من يسين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System at JoVE.com

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

وقد وُصف بروتوكول مفصل لتنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة من سائل زراعة الخلايا المحصد (HCCF) من المفاعلات المجهرية الآلية وتحليلها لاحقاً. كما يتم عرض استخدام التحليلات لتحديد سمات الجودة الحرجة (CQAs) وتعظيم حجم العينة المحدود لاستخراج المعلومات الحيوية.

تنقية وتحليل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من خلايا المبيض الهامستر الصينية باستخدام نظام مفاعل ميكروبيوم الآلي

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

يتناول هذا البروتوكول تحليل العينات المحدودة التي تم الحصول عليها من الميكروبيوراكتورس لاستخراج المعلومات الحيوية حول سمات الجودة الحرجة للمنتجات. ميزة أخرى لهذه التقنيات هي أنها تستخدم الحد الأدنى من أوقات التحليل لتحديد السمات الرئيسية التي تملي معايير الجودة للمنتج المصنع. الإجراء البرهاني سيكون ديفيد باورز، تاليا فايسون وفيليب أنغارت، زملاء أبحاث من مختبري.تبدأ من خلال فتح البرامج المرفقة إلى نظام تنقية ووضع 15 ملليلتر أنابيب مخروطية لجمع eluate الأجسام المضادة النقية و 50 ملليلتر أنابيب المخروطية لجمع تدفق من خلال خلال غسل الملح عالية في جامع الكسر. بعد ذلك، أضف 0.22 ميكرومتر المسام المصفاة السائل ثقافة الخلية المقطوعة إلى حقنة فارغة 12 ملليلتر مع فوهة توج. بعد إزالة الغطاء، أدخل فوهة الحقنة في منفذ الحقن اليدوي لنظام التنقية.تحريف حقنة لتشد من ذلك في مكان والاكتئاب المكبس حتى تم حقن كامل حجم العينة ومرئية في حلقة عينة حجم كبير 10 milliliter المرفقة. حدد الطريقة المحفوظة وانقر فوق تشغيل عند المطالبة من قبل برنامج الجهاز. عندما تم التملص من جميع الأجسام المضادة ، تحييد على الفور البروتين النقي مع قاعدة واحدة من العث إلى 5.5 من 5.5.لتركيز الأجسام المضادة النقية عن طريق الطرد المركزي، ضع مرشحات 100 كيلودالتون في أنابيب جمع الترشيحات. غسل المرشحات مع 500 ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة، ثم الطرد المركزي. كرر غسل المرشح مرتين.بعد الغسيل الثاني، تخلص من الترشيحات ونقل المرشحات المشطفة إلى أنابيب طرد مركزي جديدة. بعد ذلك، إضافة 500 ميكرولترات من عينة لكل مرشح للطرد المركزي. في نهاية الدوران، عكس الفلتر في أنبوب جمع جديد للحصول على العينة المركزة مع الطرد المركزي النهائي.بالنسبة لوضع العلامات على N-glycan وعزلها، قم بتخفيف 7.5 ميكرولترات من كل عينة جسم مضاد مركزة. مع 15.3 ميكرولترات من قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا السائل أو المياه LCMS الصف في أنابيب ملليلتر واحد من عدة، وdenature الأجسام المضادة مع ستة ميكرولترات من محلول 5٪ من الانزيم الصديقة لقياس الطيف السطحي ودية في 90 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. في نهاية التكاث، تسمح للعينات أن تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق قبل إضافة 1.2 ميكرولترات من الببتيد N-جليكوسيدز F لاحتضان لمدة خمس دقائق في 50 درجة مئوية.بعد تبريد العينات لمدة ثلاث دقائق لدرجة حرارة الغرفة ، وضع علامة على العينات مع 12 ميكرولترات من مبيد الفلورسنت الموسومة المذابة في ثنائي الشكل اللامائية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وتمييع الخليط N-الجليكان المسمى مع 358 ميكرولترات من الأسيتونيتريل ووضع لوحة كروماتوغرافيا التفاعل المائي في فراغ متعدد مع الحشوات وصينية النفايات. حالة الآبار مع 200 ميكرولترات من الماء مع فراغ تعديلها إلى 10 إلى 15 كيلوباسكال للتأكد من أن السائل سوف يستغرق 15 إلى 30 ثانية لتمرير من خلال الراتنج التفاعل الماءي اللوني.اكويبيل الآبار مع 200 ميكرولترات من 85٪ الأسيتونيتريل لمدة 15 إلى 30 ثانية قبل تحميل 400 ميكرولترات من كل خليط الجليكان المسمى إلى كل بئر، وتطبيق الفراغ بعد إضافة كل السائل الجديد. عندما تم إضافة جميع العينات، وغسل الراتنج مرتين مع 600 ميكرولترات من 1٪ حمض فليك و 90٪ الأسيتونتريل في غسل واستبدال علبة النفايات مع 600 ميكرولتر أنابيب جمع. ثم استعصى على N-glycans المسمى مع ثلاثة مجلدات 30 ميكرولتر من عازلة elution الطيفي وتمييع تمييع تجمع مع 310 ميكرولترات من ثنائي الفينيل شكلميد في acetonitrile عينات eluent.لتحليل عينات elution N-glycan المسمى على نظام كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء إلى جانب كاشف الفلوروست ووقت رباعية من مطياف كتلة الطيران، استخدم 50 ميليمولار الأمونيوم formate و 100٪ LCMS الصف الأسيتونيتريلي للمراحل المتنقلة. تعيين معدل التدفق الأولي إلى 0.4 ملليلتر في الدقيقة الواحدة، مع تدرج LC توفير زيادة الأمونيوم formate خلال مرحلة elution. تعيين جهاز الكشف عن الفلوريس لقياس استثارة من 265 نانومتر وانبعاثات من 425 نانومتر مع معدل أخذ العينات من اثنين من هرتز.تعيين وقت الطيران رباعية إلى وضع حساسية الأيونات MS1 إيجابية مع نطاق كتلة من 100 إلى 2،000 دالتون، وقت المسح الضوئي من 0.25 ثانية، واقتناء البيانات المستمرة. ثم قم بتحميل العينات في مجموعة العينات التلقائية إلى 10 درجة مئوية وقم بتشغيل الأسلوب المحمل. لsalt عينة استعدادا لتحليل البديل تهمة، المفاجئة قبالة سدادة أسفل عمود desalting 0.5 ملليلتر، وتخفيف سدادة أعلى، ووضع العمود desalting في أنبوب الطرد المركزي 1.7 ملليلتر.نقل العمود الجديد إلى أنبوب جديد microcentrifuge وإضافة 80 ميكرولترات من 3.5 ملليغرام في حل الأجسام المضادة ملليلتر إلى أعلى العمود. محاذاة العمود إلى الاتجاه الأصلي والطرد المركزي العمود. ثم تجاهل العمود desalting وخلط دقيق العينة المركزة.تمييع العينة إلى تركيز مليغرام لكل ملليلتر في 25 ميكرولترتر من الماء فائق البور في بئر واحدة من لوحة 96-well وإضافة خمسة ميكرولترات من العازلة وضع العلامات وخمسة ميكرولترات من كاشف العلامات إلى البئر. بعد حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء، اخلط 60 ميكرولترات من الماء الكاشف مع العينة واغطي الطبق بختم لوحة للطرد المركزي. لإعداد رقاقة متغير الشحن، وإزالة حل التخزين وغسل الآبار واحد وثلاثة وأربعة وسبعة وثمانية و10 بالماء.استبدال المياه مع درجة 7.2 درجة إستكمالات 7.2 تشغيل العازلة وإضافة 750 ميكرولترات من تشغيل العازلة إلى أنبوب العازلة. اضغط على لوحة التفريغ على واجهة المستخدم الصك وإزالة الختم من لوحة 96-well. أدخل اللوحة وأنبوب المخزن المؤقت في البقع المشار إليها على درج عينة GX2 واضغط على لوحة التحميل.ضع الرقاقة في غرفة الرقاقة، أغلق الغطاء إلى غرفة الشريحة، حدد مقايسة HT لشحن البروتين عند المطالبة، وانقر فوق تشغيل. تنقية عينة زراعة الخلايا المقطوعة من مفاعل حيوي مصغر آلي بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة البروتينية السريعة يسمح بتوصيف سمات الجودة الحرجة للبروتينات المنقية من خلال مختلف الأساليب التحليلية المصب، كما هو موضح. N-الجليكان البيانات من الصينية الهامستر المبيض المنتجة الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي يتم معالجتها بواسطة الطيف الشامل ينبغي أن تظهر مماثلة لهذه الكروماتوجرامات تمثيلية.يمكن استخدام تشتت الضوء متعدد الزاوية في استبعاد الحجم لتقييم ملف التجميع والوزن الجزيئي للجسم المضاد. وكمية العينة الصغيرة وأهمية التجميع من سمات النوعية الحاسمة التي تجعل من هذه التقنية أداة تحليلية تكميلية قيّمة للغاية لنظام الميكروبيوراكتور الآلي. نتيجة لكهربية منطقة الشعيرات الدموية الصغيرة هو تخطيط كهربائي ويمكن استخدامها لإظهار ملف تعريف متغير تهمة للأجسام المضادة أحادية النسيلة، وهو توقيع فريد للبروتين يجري التحقيق التي هي حساسة للغاية لدرجة الHH التشغيل.ويمكن أيضا أن يتم رصد استهلاك الأحماض الأمينية لتحديد ما إذا كان استنفاد يسبب تغييرات في سمات نوعية حرجة من الأجسام المضادة. من المهم ضمان تنقية سليمة وفعالة للمنتج المصنع ، حيث لا يمكن تنفيذ الخطوات التحليلية إلا ببروتين منقّى بشكل صحيح. ويمكن أيضا أن يخضع المنتج لرسم خرائط الببتيد واختبار الاستقرار.ولكن بمجرد استخدام البروتين لطريقة توصيف واحدة ، فإنه لا يمكن عادة أن تستخدم لآخر. تسمح هذه التقنيات بتحليل المنتجات المنتجة من منصات فحص المعالجة البيولوجية ذات الإنتاجية العالية والأحجام الصغيرة لفهم تأثير بارامترات المعالجة البيولوجية على جودة المنتج. بعض هذه التقنيات استخدام حمض البيركلوريك المركزة، حمض فورميك، ن-dimethylformamide، وكلها خطرة وينبغي التعامل معها بعناية أثناء ارتداء معدات الحماية المناسبة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

مخصص الصينية النامية الهامستر بروتين الخلية المبيض في استضافة فحوصات باستخدام التكنولوجيا الصوتية Microparticle الغشائية

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

زراعة خلايا الثدييات عن طريق استخدام المفرد نظام هوائي تفاعلات الاحيائية

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

الآلية الروبوتية الاستغناء عن تقنية لتوجيه السطحية وBioprinting من الخلايا

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

تصميم وتنفيذ لإلقاء الضوء الآلي، التثقيف، ونظام أخذ العينات للتطبيقات الميكروبية علم البصريات الوراثي

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

بروتوكول عام للاستفادة المثلى إنتاج البروتين مغايرة باستخدام تقنية ميكروبيوريكتور الآلي

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

مسح الشرائح الآلي وتجزئة في الأنسجة المسمى فلوريسسينتلي باستخدام نظام تحليل ويديفيلد عالية-المحتوى

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

نظام ميكروبيوريكتور لإنتاج IgG1 النموذجي في الخلايا شو الآلي استخدام الفائق

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

يعيش "خلية التحليل من إجهاد القص" على الزائفة الزّنجاريّة باستخدام نظام موائع جزيئية العالي الإنتاجية الآلي

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

طريقة آلية لإجراء فحص النواة الدقيقة في المختبر باستخدام قياس تدفق تدفق التصوير متعدد الأطياف

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

عملية التحسين باستخدام الإنتاجية العالية الإنتاجية المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية في زراعة الخلايا المبيض الهامستر الصينية

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...