13.9K Views
•
10:50 min
•
May 1st, 2019
DOI :
May 1st, 2019
•0:04
Title
0:39
Antibody Purification
1:49
Purified Antibody Concentration
2:33
N-Glycan Labeling and Isolation
5:00
Labeled N-Glycan Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) Analysis
6:17
Charge Variant Sample Preparation
7:38
Charge Variant Chip Preparation
8:31
Results: Representative Purified Monoclonal Antibody Automated Microbioreactor System Analyses
9:58
Conclusion
Transcript
Denne protokol omhandler analysen af begrænsede prøver fra mikrobioreaktorer for at udtrække vigtige oplysninger om produkternes kritiske kvalitetsegenskaber. En anden fordel ved disse teknikker er, at de bruger minimale analysetider til at bestemme de vigtigste attributter, der dikterer kvalitetsparametrene for det fremstillede produkt. Demonstrere procedure vil være David Powers, Talia Faison og Phillip Angart, forskning stipendiater fra mit laboratorium.
Begynd med at åbne den software, der er fastgjort til rensningssystemet, og anbringe 15 milliliter koniske rør til at indsamle det rensede antistofeluat og 50 milliliter koniske rør til at indsamle flow-through under den høje salt vask i fraktionen opsamler. Dernæst tilsættes 0,22 mikrometer pore filtreret høstet cellekultur væske til en tom 12-milliliter sprøjte med en udjævnet dyse. Når hætten er fjernet, sættes sprøjtedysen i rensesystemets manuelle injektionsport.
Drej sprøjten for at stramme den på plads og trykke stemplet ned, indtil hele prøvens volumen er blevet injiceret og synligt i den vedlagte 10 milliliter prøveløkke med store mængder. Vælg den gemte metode, og klik på Kør, når du bliver bedt om det af instrumentsoftwaren. Når alt antistoffet er undskåret, neutraliseres det rensede protein med en molære tris base til en pH-pH på ca. 5,5.
For at koncentrere det rensede antistof ved centrifugering anbringes 100 kilodaltonfiltre i filtratopsamlingsrør. Filtrene vaskes med 500 mikroliter dobbeltdestilleret vand og derefter centrifuge. Gentag filtervask to gange.
Efter den anden vask kasseres filtratet, og de skyllede filtre overføres til nye centrifugerør. Dernæst tilsættes 500 mikroliter af prøven til hvert filter til centrifugering. Ved slutningen af centrifet vendes filteret i et nyt opsamlingsrør for at opnå den koncentrerede prøve med en endelig centrifugering.
For N-glycanmærkning og isolering fortyndes 7,5 mikroliter af hver koncentreret antistofprøve. Med 15,3 mikroliter flydende kromatografi massespektrometri eller LCMS-grade vand i en-milliliter rør fra sættet, og protese antistofferne med seks mikroliter af en 5% opløsning af en enzym-venlige og massespektrometri-venlige overfladeaktive ved 90 grader Celsius i tre minutter. Ved afslutningen af denatureringen skal prøverne køle af til stuetemperatur i tre minutter, før der tilsættes 1,2 mikroliter af peptid N-glycosidase F i en fem minutters inkubation ved 50 grader Celsius.
Efter afkøling af prøverne i tre minutter til stuetemperatur mærkes prøverne med 12 mikroliter fluorescerende taggingreageser opløst i vandfri dimethylformamid i fem minutter ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning fortyndes den mærkede N-glycanblanding med 358 mikroliter acetonitrile, og der sættes en hydrofil interaktionskromatografiplade i en vakuummanifold med shims og affaldsbakke. Betingelse brøndene med 200 mikroliter vand med vakuum justeret til 10 til 15 kilopascal for at sikre, at væsken vil tage 15 til 30 sekunder at passere gennem den hydrofile interaktionkromatografi harpiks.
Ligevægt brøndene med 200 mikroliter på 85%acetonitril i 15 til 30 sekunder, før du lægger 400 mikroliter af hver mærket glycan blanding til hver brønd, anvende vakuum efter hver ny væske er tilføjet. Når alle prøverne er tilsat, vaskes harpiksen to gange med 600 mikroliter på 1 % myresyre og 90%acetonitril per vask, og affaldsbakken udskiftes med 600 mikrolitersamlingsrør. Derefter undgås de mærkede N-glycaner med tre 30-mikroliter mængder af spektrometri elution buffer og fortyndet puljen fortyndinger med 310 mikroliter dimethylformamid i acetonitrile samplet elluent.
For at analysere de mærkede N-glycan-elutionsprøver på et ultraperformancevæskekromatografisystem koblet til en fluorescensdetektor og firedobbelt flyvemassespektrometer skal du bruge 50 millimolar ammoniumformat og 100% LCMS-streger til de mobile faser. Indstil den oprindelige strømningshastighed til 0,4 milliliter pr. minut, hvor LC-gradienten giver stigende ammoniumformat i elueringsfasen. Indstil fluorescensdetektoren til at måle en excitation på 265 nanometer og en emission på 425 nanometer med en samplinghastighed på to hertz.
Indstil den firedobbelte flyvningstid til MS1-positiv ionfølsomhedstilstand med et masseområde på 100 til 2.000 Daltons, en scanningstid på 0,25 sekunder og en continuum-dataindsamling. Læg derefter prøverne i den automatiske sampler indstillet til 10 grader Celsius og køre den indlæste metode. For at afsalte en prøve som forberedelse til analyse af ladevarianten skal du tage bundproppen af en 0,5 milliliterdelerning, løsne den øverste prop og anbringe afsaltningskolonnen i et 1,7 milliliter centrifugerør.
Overfør den nye kolonne til et nyt mikrocentrifugerør, og der tilsættes 80 mikroliter af en antistofopløsning på 3,5 mg pr. milliliter til toppen af kolonnen. Juster kolonnen i forhold til den oprindelige retning, og centrifuger kolonnen. Derefter kasseres afsaltningskolonnen, og den koncentrerede prøve blandes grundigt.
Prøven fortyndes til en koncentration på to milligram pr. milliliter i 25 mikroliter ultrarent vand i en enkelt brønd på en 96-brøndplade, og der tilsættes fem mikroliter mærkningsbuffer og fem mikroliter mærkning af reagens til brønden. Efter 10 minutters inkubation ved stuetemperatur, der er beskyttet mod lys, blandes 60 mikroliter reagensvand sammen med prøven, og pladen dækkes med en pladetætning til centrifugering. For at klargøre ladningsvariantchippen skal du fjerne opbevaringsopløsningen og vaske brøndene en, tre, fire, syv, otte og 10 med vand.
Udskift vandet med pH 7.2 løbebuffer og tilsæt 750 mikroliter løbebuffer til bufferrøret. Tryk på Aflæs pladen på instrumentets brugergrænseflade, og fjern forseglingen fra 96-brøndpladen. Sæt plade- og bufferrøret i de angivne pletter på GX2-prøvebakken, og tryk på Belastningspladen.
Placer chippen i spånkammeret, luk låget til spånkammeret, vælg HT-proteinladningsvariantanalysen, når du bliver bedt om det, og klik på Kør. Rensning af den høstede cellekulturprøve fra den automatiserede mikroskalabioreaktor ved hjælp af hurtig proteinlikvid kromatografi gør det muligt at karakterisere de rensede proteiners kritiske kvalitetsegenskaber ved hjælp af forskellige downstream-analysemetoder, som påvist. N-glycandata fra kinesiske hamsterovariesyndede monoklonale antistoffer, der behandles ved massespektrometri, skal ligne disse repræsentative kromatogrammer.
Størrelse udelukkelse kromatografi flere vinkel lys spredning kan bruges til at vurdere sammenlægning profil og molekylvægt af antistoffet. Den lille mængde af prøven og betydningen af sammenlægningen er kritiske kvalitetsattributter for at gøre denne teknik til et yderst værdifuldt supplerende analyseværktøj til det automatiserede mikrobioreaktorsystem. Resultatet af mikrokapillær zone elektroforese er et elektroferogram og kan bruges til at vise ladningvariantprofilen for et monoklonalt antistof, en unik signatur for det protein, der undersøges, og som er meget følsomt over for driftspH-zonen.
Aminosyre forbrug kan også overvåges for at afgøre, om udtynding forårsager ændringer i den kritiske kvalitet attributter af antistoffet. Det er vigtigt at sikre en korrekt og effektiv rensning af det fremstillede produkt, da de analytiske trin kun kan udføres med et korrekt renset protein. Produktet kan også underkastes peptidkortlægning og stabilitetstest.
Men når proteinet er blevet brugt til en karakteriseringsmetode, kan det typisk ikke bruges til en anden. Disse teknikker gør det muligt at analysere produkter fremstillet af biobehandlingsplatforme med stort kapacitet for at forstå bioprocesparametres indflydelse på produktkvaliteten. Nogle af disse teknikker anvender koncentreret perchlorsyre, myresyre, N-dimethylformamid, som alle er farlige og bør håndteres omhyggeligt, mens de bærer det korrekte beskyttelsesudstyr.
Der er blevet beskrevet en detaljeret protokol for rensning og efterfølgende analyse af et monoklonalt antistof fra den høstede cellekultur væske (HCCF) af automatiserede mikrobioreaktorer. Brug af Analytics til at bestemme kritiske kvalitets attributter (CQAs) og maksimering af begrænset prøvevolumen til at udtrække vitale oplysninger er også præsenteret.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved