Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Dit protocol richt zich op de analyse van beperkte monsters verkregen uit microbioreactoren om essentiële informatie over de kritische kwaliteitskenmerken van de producten te extraheren. Een ander voordeel van deze technieken is dat ze minimale tijden van analyse gebruiken om de belangrijkste kenmerken te bepalen die de kwaliteitsparameters van het vervaardigde product dicteren. Demonstrerende procedure zijn David Powers, Talia Faison en Phillip Angart, onderzoekers van mijn laboratorium.

Begin met het openen van de software die aan het zuiveringssysteem is bevestigd en plaats 15 milliliter conische buizen om het gezuiverde antilichaam eluaat en 50 milliliter conische buizen te verzamelen om de flow-through tijdens de hoge zoutwassing in de fractiecollector te verzamelen. Voeg vervolgens 0,22 micrometer porie gefilterde geoogste celcultuurvloeistof toe aan een lege spuit van 12 milliliter met een afgetopt mondstuk. Na het verwijderen van de dop plaatst u de spuitmond in de handmatige injectiepoort van het zuiveringssysteem.

Draai de spuit om het op zijn plaats aan te draaien en druk de zuiger totdat het volledige volume van het monster is geïnjecteerd en is zichtbaar in de bijgevoegde 10 milliliter grote volume monster lus. Selecteer de opgeslagen methode en klik op Uitvoeren wanneer de instrumentsoftware daarom vraagt. Wanneer al het antilichaam is ontweken, neutraliseer het gezuiverde eiwit onmiddellijk met één molaire tris basis tot een pH van ongeveer 5,5.

Om het gezuiverde antilichaam door centrifugatie te concentreren, plaatst u 100 kilodaltonfilters in filtraatopvangbuizen. Was de filters met 500 microliter dubbel gedestilleerd water en centrifuge vervolgens. Herhaal filterwas twee keer.

Gooi na de tweede wasbeurt het filtraat weg en breng de gespoelde filters over naar nieuwe centrifugebuizen. Voeg vervolgens 500 microliter monster toe aan elk filter voor centrifugatie. Aan het einde van de spin, omkeren van het filter in een nieuwe collectie buis om het geconcentreerde monster te verkrijgen met een laatste centrifugatie.

Verdun voor N-glycan-etikettering en isolatie 7,5 microliter van elk geconcentreerd antilichaammonster. Met 15,3 microliter vloeibare chromatografie massaspectrometrie of LCMS-grade water in één milliliter buizen uit de kit, en denatureren de antilichamen met zes microliters van een 5%-oplossing van een enzymvriendelijke en massaspectrometrievriendelijke oppervlakteactieve stof bij 90 graden Celsius gedurende drie minuten. Laat de monsters aan het einde van de denaturatie drie minuten afkoelen tot kamertemperatuur voordat ze 1,2 microliter peptide N-glycosidase F toevoegen voor een incubatie van vijf minuten bij 50 graden Celsius.

Na het koelen van de monsters gedurende drie minuten tot kamertemperatuur, etiketteren de monsters met 12 microliter tl fluorescerende tagging reagens opgelost in watervrije dimethylformamide gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verdun aan het einde van de incubatie het gelabelde N-glycanmengsel met 358 microliters acetonitril en plaats een hydrofiele interactiechromatografieplaat in een vacuümspruitstuk met shims en afvalbak. Conditioneer de putten met 200 microliters water met het vacuüm aangepast aan 10 tot 15 kilopascals om ervoor te zorgen dat de vloeistof 15 tot 30 seconden duurt om door de hydrofiele interactiechromatografie hars te gaan.

Equilibrate de putten met 200 microliter van 85%acetonitril gedurende 15 tot 30 seconden voor het laden van 400 microliters van elk gelabeld glycan mengsel op elke put, het toepassen van het vacuüm na elke nieuwe vloeistof wordt toegevoegd. Wanneer alle monsters zijn toegevoegd, was de hars twee keer met 600 microliter van 1%mierenzuur en 90% acetonitril per wasbeurt en vervang de afvalbak door 600 microliter inzamelbuizen. Ontwijk vervolgens de gelabelde N-glycanen met drie 30-microlitervolumes spectrometrie elutiebuffer en verdun de verdunningen van de pool met 310 microliter dimethylformamide in acetonitrile bemonsterd eluent.

Voor het analyseren van de gelabelde N-glycan elutie monsters op een ultraperformance vloeibare chromatografie systeem gekoppeld aan een fluorescentie detector en viervoudige tijd van de vlucht massaspectrometer, gebruik 50 millimolar ammonium formaat en 100% LCMS rang acetonitril voor de mobiele fasen. Stel de initiële stroomsnelheid in op 0,4 milliliter per minuut, waarbij de LC-gradiënt tijdens de elutiefase steeds meer ammoniumforium biedt. Stel de fluorescentiedetector in om een excitatie van 265 nanometer en een emissie van 425 nanometer met een bemonsteringssnelheid van twee hertz te meten.

Stel de viervoudige vluchttijd in op ms1-positieve ionengevoeligheidsmodus met een massabereik van 100 tot 2.000 Daltons, een scantijd van 0,25 seconden en een continuüm-gegevensverwerving. Laad vervolgens de monsters in de automatische sampler ingesteld op 10 graden Celsius en voer de geladen methode. Om een monster te desalt ter voorbereiding van de analyse van de ladingsvariant, klikt u de onderste stop van een ontziltingskolom van 0,5 milliliter, maakt u de bovenste stop kwijt en plaatst u de desaltingkolom in een centrifugebuis van 1,7 milliliter.

Breng de nieuwe kolom in een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 80 microliter van een 3,5 milligram per milliliter antilichaam oplossing aan de bovenkant van de kolom. Lijn de kolom uit op de oorspronkelijke afdrukstand en centrifugeren de kolom. Gooi vervolgens de desaltingkolom weg en meng het geconcentreerde monster grondig.

Verdun het monster tot een concentratie van twee milligram per milliliter in 25 microliter ultrazuiver water in een enkele put van een 96-putplaat en voeg vijf microliters labelbuffer en vijf microliter van het etiketteren van reagens toe aan de put. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht, meng 60 microliters reagenswater met het monster en bedek de plaat met een plaatafdichting voor centrifugatie. Om de laadvariantchip voor te bereiden, verwijdert u de opslagoplossing en wast u de putten één, drie, vier, zeven, acht en tien met water.

Vervang het water door pH 7.2 lopende buffer en voeg 750 microliter van lopende buffer aan de bufferbuis toe. Druk op De Plaat van het ontlaad op de gebruikersinterface van het instrument en verwijder de verbinding van de 96-putplaat. Plaats de plaat en bufferbuis in de aangegeven plekken op de GX2-monsterlade en druk op Load Plate.

Plaats de chip in de chipkamer, sluit het deksel op de chipkamer, selecteer de HT-eiwitladingvariant test wanneer daarom wordt gevraagd en klik op Uitvoeren. Zuivering van de geoogste celkweek monster uit de geautomatiseerde microschaal bioreactor door snelle eiwit vloeibare chromatografie maakt de karakterisering van de kritische kwaliteit attributen van de gezuiverde eiwitten door middel van verschillende downstream analytische methoden, zoals aangetoond. N-glycan gegevens van Chinese hamster eierstok geproduceerde monoklonale antilichamen verwerkt door massaspectrometrie moeten lijken op deze representatieve chromatogrammen.

Grootte uitsluiting chromatografie meerdere hoek lichtverstrooiing kan worden gebruikt om de aggregatie profiel en moleculair gewicht van het antilichaam te beoordelen. De kleine hoeveelheid monster en het belang van de aggregatie zijn kritische kwaliteitskenmerken om van deze techniek een zeer waardevol aanvullend analytisch instrument te maken voor het geautomatiseerde microbioreactorsysteem. Het resultaat van micro capillaire zone elektroforese is een elektroferogram en kan worden gebruikt om de lading variant profiel voor een monoklonale antilichaam, een unieke handtekening voor het eiwit wordt onderzocht dat zeer gevoelig is voor de operationele pH tonen.

Aminozuur consumptie kan ook worden gecontroleerd om te bepalen of de uitputting veroorzaakt veranderingen in de kritische kwaliteit attributen van het antilichaam. Het is belangrijk om te zorgen voor een goede en efficiënte zuivering van het vervaardigde product, omdat de analytische stappen alleen kunnen worden uitgevoerd met een goed gezuiverd eiwit. Het product kan ook worden onderworpen aan peptide mapping en stabiliteit testen.

Maar zodra het eiwit is gebruikt voor een karakterisering methode, het meestal niet kan worden gebruikt voor een ander. Deze technieken maken het mogelijk om producten te analyseren die zijn geproduceerd uit kleine volume- en bioprocessingscreeningplatforms met een hoge doorvoer om de invloed van bioprocessingparameters op de productkwaliteit te begrijpen. Sommige van deze technieken maken gebruik van geconcentreerd perchloorzuur, mierenzuur, N-dimethylformamide, die allemaal gevaarlijk zijn en zorgvuldig moeten worden behandeld tijdens het dragen van de juiste beschermende apparatuur.