Name: purification and analytics of a monoclonal antibody from chinese hamster ovary cells using an automated microbioreactor system
Uploaded: 2019-05-01T13:30:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System at JoVE.com

Die Autoren danken Scott Lute für die analytische Unterstützung, die er geleistet hat. Die teilweise interne Finanzierung und Unterstützung dieser Arbeiten erfolgt durch das CDER Critical Path Program (CA #1-13). Dieses Projekt wird zum Teil durch einen Termin für das Praktikums-/Forschungsbeteiligungsprogramm beim Office of Biotechnology Products, U.S. Food and Drug Administration, unterstützt, das vom Oak Ridge Institute for Science and Education zwischen dem US-Energieministerium und der FDA.

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Diese Veröffentlichung spiegelt die Ansichten des Autors wider und sollte nicht so ausgelegt werden, dass sie die Ansichten oder Richtlinien der FDA widerspiegelt.

HCCF enthält Schmutz und große Partikel, die kostspielige Instrumente verstopfen und zerstören können, so dass eine Kulturklärung vor der weiteren Weiterverarbeitung erforderlich ist. Zentrifugation ist im Allgemeinen der erste Ansatz, um Zellen und andere unlösliche Partikel von Proteinen zu trennen, gefolgt von Filtration. Dieser gefilterte HCCF wird dann zur Reinigung der Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) unterzogen. Die Reinigung von HCCF aus automatisierten Mikrobioreaktoren zur Gewinnung des Produkts ist ein wichtiger Schritt in der Weiterverarbeitung. Hier bei der Gewinnung monoklonaler Antikörper aus dem HCCF wird ein Tisch-FPLC-System mit einer Protein-A-Säule verwendet. Analysen für upstreame Prozesse können nützliche Einblicke in das Zellverhalten bieten und das Bioprozessdesign leiten und so zu einem konsistenten und zuverlässigen Qualitätsprodukt beitragen. Analytics ermöglicht es uns auch, Kritische Qualitätsattribute (CQAs) mit vor- und nachgelagerten Prozessen zu verknüpfen. Hier werden vier Assays vorgestellt, die häufig bei der Charakterisierung monoklonaler Antikörper verwendet werden. Diese Techniken sind robust, zuverlässig und für Prozess- und Produktanalysen aus einer Vielzahl von vorgelagerten Quellen, die nur teilweise gereinigt werden und noch Restmengen an DNA und HCP enthalten können, leicht einsetzbar.
Bei der Reinigung von Proben für Analysen muss ein wichtiges Gleichgewicht zwischen der Erstellung einer Probe, die für die Analyse ausreichend sauber ist, und der Erhaltung der Im Bioreaktor vorhandenen Variabilität gefunden werden. Die beiden häufigsten Kontaminanten, die sich auf das Produkt auswirken, sind DNA und HCP, die durch Messung der Verhältnisabsorption bei 260/280 nm und durch SDS-PAGE oder CE-SDS überprüft werden können. Die hier vorgestellten Assays reagieren nicht empfindlich auf niedrige DNA-Gehalte. Die Reinheit des Produktes ist >95% rein, wie durch die Definition von CE-SDS bestimmt.
Die Chargenvariantenanalyse mit einem mikrokapillaren Elektrophoresesystem bietet eine Methode mit hohem Durchsatz, um Ladungsvarianten mit Chips und Reagenzien zu identifizieren, die relativ einfach zu implementieren sind. Die Art der Technik und die Chemie des Etikettierungsreagenzsindsind sind sowohl empfindlich gegenüber Hilfsstoffen als auch anderen primären Aminen, was für die meisten Probenmatrixen einen Entsalzungsschritt erfordert. Erfahrungsgemäß wandern niedrige DNA-Werte mit dem Freifarbstoff aus der Etikettierungsreaktion und beeinflussen nicht die Qualität der Ergebnisse. Während die Variabilität der Grund-, Haupt- und Saurier-Spitzenquantifizierung in der Regel <1% beträgt, können höhere DNA-Spiegel und andere Verunreinigungen die Variabilität des Tests erhöhen. Es ist äußerst wichtig, mit der Proteinkennzeichnung konsistent zu sein und die schnelle Verwendung von DMF nach dem Entfernen aus der Flasche und dem Mix mit dem Farbstoff sicherzustellen. Lysin- und/oder Histidin-Standards werden als Etikettierkontrollen empfohlen. Im Laufe der Zeit und abhängig von der Probenqualität können Chips die Beschichtung auf den Mikrofluidienkanälen verunreinigen oder verlieren, was zu größerem Rauschen, dem Vorhandensein von Geisterspitzen und einer größeren Variation von Probe zu Probe führt. Um dieses Vorkommen zu identifizieren, wurden Inlädiele und ein Systemeignungsstandard (z.B. NISTmAb) in regelmäßigen Abständen gleichzeitig mit den Proben analysiert. Wenn Chipprobleme auftreten, können die Chips mit der Speicherlösung gewaschen oder ersetzt werden.
Die Methoden für die Glykananalyse von therapeutischen Glykoproteinen betreffen in erster Linie flüssige Chromatographie (LC) und/oder Massenspektrometrie (MS), wobei die Lectin-Mikroarray-Analyse als dritte Option an Popularität gewinnt25. Die in diesem Dokument beschriebene Methode verwendet sowohl LC als auch MS, was Vor- und Nachteile hat. Massenspektrometrische Methoden haben den Vorteil der Massenverifizierung der analysierten Glykane, was mit LC-basierten Methoden mit einem fluoreszierenden Detektionsausgang oder Lektin-Mikroarrays nicht möglich ist. Bei dieser Methode werden LC- und Fluoreszenzdetektionen verwendet, um Glykanidentitäten mithilfe eines Retentionszeitvergleichs einem Dextranleiterstandard zuzuweisen. Die Fluoreszenzüberwachung ermöglicht eine erhöhte Empfindlichkeit und Quantifizierung aufgrund der einfachen Detektion, bei der MS allein aufgrund der schlechten Ionisationseffizienz von Oligosacchariden möglicherweise nicht in der Lage ist, Arten mit geringer Häufigkeit zu quantifizieren. Die Masseninformationen von MS werden verwendet, um glykanische Identitäten zu bestätigen, aber die Verarbeitungssoftware verwendet keine Masseninformationen als primäre Zuweisungskriterien. Daher kann diese Methode ohne reproduzierbare Chromatographie und leicht lösbare Spitzen bei Glykan-Zuweisungen leiden. Glücklicherweise kann die Masseninformation bei Glykan-Zuweisungen helfen, selbst in Situationen, in denen die Chromatographie unterdurchschnittlich ist, wie z. B. Verschiebungen der Retentionszeit, die reproduzierbare Glykan-Aufgaben behindern. Wenn diese Methode ohne MS verwendet wird, muss die Chromatographie auf der höchsten Ebene sein, da Masseninformationen nicht verwendet werden können, um die Verweilzeitdrift zu korrigieren.
Die hier beschriebene Aminosäureanalysemethode nutzt LC-MS für die schnelle Quantifizierung unteriatisierter Aminosäuren in Rohzellkulturmedien. Alternative Aminosäureanalysemethoden erfordern Aminosäure-Derivatisierungsmittel, um den UV-Nachweis zu ermöglichen26. Die LC-MS-Methode bietet wichtige Vorteile gegenüber der LC-UV-Methode: Sie ermöglicht die Identifikation sowohl auf Retentionszeit als auch auf Ionenmasse im Gegensatz zur LC-UV-Methode, die durch einen Mangel an Massencharakterisierung begrenzt wird. Darüber hinaus bietet die LC-MS-Methode Zeit- und Reproduzierbarkeitsvorteile, da das LC-UV-Verfahren eine zeitaufwändige Ableitungsreaktion erfordert, die Probenvariabilität27vermitteln kann. Die Injektion von Rohzellkulturmedien in die LC-MS-Methode kann jedoch schädliche Auswirkungen auf das MS-Signal aufgrund von Ionenabschäum-Fouling haben. Eine Kalibrierleiter wird häufig als Systemeignungsprüfung injiziert, und die Stichprobenreihenfolge wird randomisiert, um Verzerrungen in den Daten zu verhindern.
Das Zellkulturverfahren zur Antikörperproduktion mit Mikrobioreaktoren wurde zuvor beschrieben9. In dieser Studie sind detaillierte Protokolle für monoklonale Antikörpercharakterisierungsmethoden, die Daten maximieren, die aus begrenzten Probenvolumina gewonnen wurden, klar definiert. Begrenzte Mengen an geernteter Zellkulturflüssigkeit können manchmal die erfassten Produktinformationen einschränken, und die Auswahl der richtigen Analyseverfahren zur Gewinnung von Produktqualitätsdaten ist unerlässlich. Analysen sind wichtig, um vorgelagerte Prozessparameter mit den Änderungen der Produktqualität zu verknüpfen. Hier wird eine Richtlinie für Den Anwender zur Charakterisierung von mAbs bei der Arbeit mit Mikrobioreaktoren bereitgestellt.

Protein-Therapeutika werden verwendet, um eine wachsende Vielfalt von Erkrankungen zu behandeln, einschließlich Gewebetransplantation Komplikationen, Autoimmunerkrankungen, und Krebs1. Seit 2004 dokumentiert die United States Food and Drug Administration (USFDA) einen steigenden Anteil an bioologischen Lizenzanträgen (BLAs) aller zulassungen, die vom Center for Drug Evaluation and Research (CDER) reguliert werden, wobei BLAs über 25 % der Zulassungen ausmachen. 2014 und 20152.
Angesichts dieses expandierenden Marktes sind biopharmazeutische Hersteller gefordert, schnell mehr Produkte mit gleichbleibender Qualität zu liefern. Die Bemühungen, die Produktausbeute zu steigern, konzentrierten sich auf CHO-Zelltechnik und Produktionslinien-Screening, obwohl die wichtigsten Verbesserungen auf Fortschritte bei der Optimierung der Medien-/Feed-Strategie und der Umgebungskontrollen für Zellenkulturen zurückzuführen sind1, 3 , 4 , 5 während des Herstellungsprozesses.
Da mAbs in einem biologischen System hergestellt werden, kann es eine inhärente Proteinvariabilität geben. Die Antikörperzusammensetzung kann posttranslational verändert werden, z. B. glykosyliert oder durch Abbau oder enzymatische Reaktionen beeinflusst werden. Diese strukturellen Variationen können gefährliche Immunreaktionen hervorrufen oder die Antikörperbindung verändern, was wiederum die beabsichtigte therapeutische Funktion reduzieren oder eliminieren kann5. Daher werden kritische Qualitätsattribute (CQAs) monoklonaler Antikörper - N-Glykanprofil, Ladungsvariantenverteilung und der Anteil der Antikörper in monomerer Form - regelmäßig im Rahmen eines Quality by Design (QbD)-Ansatzes während der Herstellungsprozesse1,6. In einem regulierten Produktionsumfeld müssen therapeutische Proteine die Akzeptanzkriterien erfüllen, um als zugelassenes kommerzielles Arzneimittel zugelassen zu werden7. Die hier vorgestellten Methoden wären in der Regel Teil des Qualitätscharakterisierungsprozesses für einen Antikörper7,8, und jeder Proteinwissenschaftler wird mit ihrer Verwendung vertraut sein.
In früheren Arbeiten9wurde die Anwendung und der Betrieb von Mikrobioreaktoren für das Hochdurchsatzscreening von Zellkulturbedingungen in der vorgelagerten Bioverarbeitung beschrieben. Das aus den unterschiedlichen Medienbedingungen gewonnene gereinigte Produkt wird einer N-Glykan-Analyse mit LC-MS unterzogen. Glykosylierungsmuster von therapeutischen Proteinen können mit den LC-MS-Techniken10,11und Das Vorhandensein verschiedener Glykanarten wurde mit Bioprozessparametern wie Futterstrategie, pH-Wert und Temperatur12in Verbindung gebracht. Die Auswirkungen der unterschiedlichen Medienbedingungen auf die Produktqualität, angegeben durch den Prozentsatz des resultierenden IgG in monomerer Form, werden auch mit Größenausschlusschromatographie- Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)13,14 , 15. Das Ladungsvariantenprofil stellt eine Reihe von Modifikationen16 dar, die sich auf die Funktion eines Produkts auswirken könnten. Die Mikrokapillarzonenelektrophorese (mCZE) ist eine Technik, die eine wesentlich schnellere Analysezeit im Vergleich zu herkömmlichen Kationenaustausch(CEX)-Chromatographien und kapillaren isoelektrischen Fokussierungsmethoden (cIEF) bietet, die für die Chargenvariantenanalyse verwendet werden17 ,18. Verbrauchte Bioreaktormedien wurden analysiert, um den Aminosäureverbrauch während der Proteinproduktion zu verfolgen, da sie sich auf Veränderungen der identifizierenden Eigenschaften des Antikörpers beziehen19,20,21,22 , 23.
Proteinanalysen ermöglichen es uns, kritische Prozessparameter (CPPs) basierend auf den Beziehungen zwischen Prozesseingaben und Änderungen in CQAs zu identifizieren. Während der Bioprozessentwicklung demonstriert die Identifizierung und Messung von CPPs grundsätzlich die Prozesssteuerung und stellt sicher, dass sich das Produkt nicht verändert hat, was in stark regulierten Fertigungsumgebungen unerlässlich ist. In diesem Beitrag werden Analysetechniken zur Messung einiger biochemischer Eigenschaften des Proteins vorgestellt, das am relevantesten für Produkt-CQAs (N-Glykanprofil, Ladungsvarianten und Größenhomogenität) ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:373px;">CHO DG44 Cell Line</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">A1100001</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Akta Avant 25</td>
			<td>General Electric Life Sciences</td>
			<td>28930842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>115115830</td>
			<td>Purification Stationary Phase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:373px;">Omnifit 10cm Column</td>
			<td style="width:191px;">Diba Fluid Intelligence</td>
			<td>006EZ-06-10-AA</td>
			<td style="width:177px;">Housing for Stationary Phase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18-1113-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#181;Dawn Multi Angle Light Scattering Detector</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td>WUDAWN-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.22 &#181;m Millex GV Filter Unit PVDF Membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12 mL Syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881512878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity DAD&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Sampler</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 uL Glass Inserts with Polymer Feet&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-Well Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>127737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BPA996-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACQUITY I-Class UPLC BSM</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>18601504612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186015000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACQUITY UPLC FLR Detector</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176015029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC810096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Amino Acid Standard, 1 nmol/&#181;L&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5061-3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amino Acid Supplement</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5062-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blue Screw Caps with Septa</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD OptiCHO AGT Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1122205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Charge Variant Chip</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>760435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Charge Variant Reagent Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS760670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Chromatography Water (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethylformamide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176003712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Buffer Tubes</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>697075- NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Detection Window Cleaning Cloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21912-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII HT Touch</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS138160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Ladder Tubes</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>C-3258-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Lint-Free Swab</td>
			<td>ITW Texwipe</td>
			<td>TX758B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Intact mAb Mass Check Standard</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm</td>
			<td>Imtakt</td>
			<td>WAA25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>840274100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td>WTREX-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Perchloric acid</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1034-960-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screw Top Clear Vial 2mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>383112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L</td>
			<td>Tosoh Biosciences</td>
			<td>003449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UNIFI Scientific Information System</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667005138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuum Manifold Shims</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuum Pump</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xevo G2 Q-ToF</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186005597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89883</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and analytics of a monoclonal antibody from chinese hamster ovary cells using an automated microbioreactor system

Monoklonale Antikörper (mAbs) sind eines der beliebtesten und am besten charakterisierten biologischen Produkte, die heute hergestellt werden. Am häufigsten mit chinesischen Hamster-Ovarialzellen (CHO) Zellen hergestellt werden, Muss Kultur und Prozessbedingungen optimiert werden, um Antikörper-Titter zu maximieren und Zielqualitätsprofile zu erreichen. In der Regel verwendet diese Optimierung automatisierte Mikroskalen-Bioreaktoren (15 ml), um mehrere Prozessbedingungen parallel zu überprüfen. Zu den Optimierungskriterien gehören die Kulturleistung und die kritischen Qualitätsattribute (CQAs) des monoklonalen Antikörperprodukts (mAb), die sich auf seine Wirksamkeit und Sicherheit auswirken können. Kulturleistungsmetriken umfassen Zellwachstum und Nährstoffverbrauch, während die CQAs die N-Glykosylierungs- und Aggregationsprofile des mAb, Ladungsvarianten und Molekulargewicht umfassen. Dieses detaillierte Protokoll beschreibt, wie HCCF-Proben, die von einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem erzeugt werden, gereinigt und anschließend analysiert werden, um wertvolle Leistungsmetriken und -ausgänge zu erhalten. Zunächst wird ein automatisiertes Protein-A-Methode zur schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) verwendet, um das mAb aus geernteten Zellkulturproben zu reinigen. Einmal konzentriert, werden die Glykinprofile mittels Einer bestimmten Plattform durch Massenspektrometrie analysiert (siehe Materialtabelle). Antikörper-Molekulargewichte und Aggregationsprofile werden mittels Größenausschlusschromatographie-Multiple-Winkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) bestimmt, während Ladungsvarianten mittels Mikrochip-Kapillarzonenelektrophorese (mCZE) analysiert werden. Zusätzlich zu den Kulturleistungsmetriken, die während des Bioreaktorprozesses erfasst wurden (d. h. Kulturlebensfähigkeit, Zellzahl und häufige Metaboliten wie Glutamin, Glukose, Laktat und Ammoniak), werden verbrauchte Medien analysiert, um verbesserung der Fütterungsstrategien und des gesamten Prozessdesigns. Daher wird auch ein detailliertes Protokoll zur absoluten Quantifizierung von Aminosäuren durch flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) verbrauchter Medien beschrieben. Die in diesem Protokoll verwendeten Methoden nutzen Plattformen mit hohem Durchsatz, die für eine große Anzahl von Samples mit kleinem Volumen kompatibel sind.

Die geerntete Zellkulturflüssigkeit aus dem automatisierten Mikro-Bioreaktor wird mit hilfe der schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) gereinigt, wie in Abbildung 1 zu sehen ist, und die kritischen Qualitätsmerkmale (CQAs) der gereinigten Proteine zeichneten sich durch verschiedene nachgelagerte Analysemethoden. Dies ist ein wesentlicher Vorteil des automatisierten Mikrobioreaktorsystems; Unterschiede in CQAs können schnell über eine Vielzahl von Bedingungen hinweg beurteilt werden. N-Glykandaten von CHO-produzierten mAbs, die durch Massenspektrometrie verarbeitet werden, sollten wie die in Abbildung 2dargestellten Chromatogramme erscheinen. Die Abbildung zeigt einen Vergleich zwischen zwei Chromatogrammen, die zeigen, dass die Mannose 5 Peak (M5) aus einer Probe deutlich niedriger ist. Wenn nur eine laute Basislinie anstelle von Spitzen beobachtet wird, kann dies bedeuten, dass der Chromatographieaufbau fehlerhaft ist oder dass die Prozedur nicht erfolgreich ist. Mithilfe von Steuerelementen kann die Fehlerbehebung vereinfacht werden. Bewerten Sie zunächst die FLR-Spitzen von der Dextran-Leiter aus; diese Spitzen deuten darauf hin, dass das chromatographische System ordnungsgemäß funktioniert. Vergleichen Sie als Nächstes die experimentell erhaltenen Spitzen mit denen eines verarbeiteten intakten mAb-Standards. Wenn Spitzen aus dem Standard sichtbar sind, aber keine Probenspitzen identifiziert werden, wurden die mAb-Proben nicht korrekt verarbeitet. Dies kann auf SDS oder Nucleophil Anwesenheit im Puffer stören n-glykanische Etikettierung und Reinigung sein.
SEC-MALS kann verwendet werden, um zwei weitere CQAs zu bewerten: das Aggregationsprofil und das Molekulargewicht des Antikörpers. Ein repräsentatives SEC-MALS-Chromatogramm ist mit dem in Abbildung 3dargestellten vergleichbar. Die molekulare Massenverteilung und das absolute Molekulargewicht wurden mit der erforderlichen Software mit einem Aussterbekoeffizienten von 1,37 ml*(mg*cm)-1 und einem dn/dc von 0,185 ml/g bestimmt. Da Spitzenaufrufe und festlegen der Baseline in der Software manuell ausgeführt werden, können die Ergebnisse von Benutzer zu Benutzer leicht variieren. Das absolute Molekulargewicht des monomeren IgG1 aus Abbildung 3 beträgt 1,504 x 105 Da bei 0,38 % (blau) und der Komplex höherer Ordnung 7,799 x 105 Da bei 3,0 % (rot). Die Polydispersität der Aggregate ist viel größer als die des Monomers, wie die rote Molmassenverteilung von Peak 1 (Abbildung 3) zeigt. Die geringe Menge an Proben und die Bedeutung der Aggregation als CQA machen diese Technik zu einem sehr wertvollen ergänzenden Analysewerkzeug zum automatisierten Mikrobioreaktorsystem.
Das Ergebnis von mCZE ist ein Elektropherogramm, wie in Abbildung 4, das das Ladungsvariantenprofil für einen monoklonalen Antikörper zeigt. Das Profil ist eine einzigartige Signatur für das untersuchte Protein und ist hochempfindlich gegenüber dem betriebsbereiten pH-Wert. Ebenfalls sichtbar ist eine Freifärbungsspitze links vom Ladungsvariantenprofil. Bei der Festlegung eines Betriebs-pH-Werts gibt es für den Bediener einen gewissen Ermessensspielraum, um Auflösung und Signal auszugleichen; Darüber hinaus muss der Bediener eine gute Trennung von der Freifärbungsspitze gewährleisten, die bei 30 s wandert. Die Probe kann nach der Kennzeichnung entsalzt werden, um diesen Peak zu entfernen, obwohl dies zu einem erheblichen Signalverlust führt. Sobald ein Betriebs-pH-Wert festgestellt ist, können die Probenprofile verglichen werden. Obwohl im Allgemeinen konsistent, können Änderungen der Etikettierungseffizienz oder Unterschiede in den Hilfsstoffen zu geringfügigen Unterschieden bei der Migration einer Probe und dem Ladungsvariantenprofil führen, was elektropherogramme schwer direkt vergleichen lässt. Stattdessen basiert die Vergleichsmethode in der Regel auf den Prozentsätzen der Basis-, Haupt- und Saurierarten. In diesem Fall können mit mCZE relative Unterschiede von nur 1-2% identifiziert werden.
Der Aminosäureverbrauch kann überwacht werden, um festzustellen, ob die Erschöpfung Veränderungen der CQAs verursacht. Mit Chromatogrammauslesungen aus dem Massenspektrometer kann die erfolgreiche Erstellung einer Kalibrierkurve zur absoluten Quantifizierung von Aminosäuren in Rohbioreaktor-Medienproben ausgewertet werden. Abbildung 5 zeigt zwei Gesamtionenchromatogramme (TIC) und ein extrahiertes Ionenchromatogramm (XIC) als repräsentative Ergebnisse während dieses Prozesses. In Abbildung 5Azeigt das gezeigte TIC das Hintergrundsignal aus dem Puffersystem, da nur ein Wasserrohling injiziert wurde. Abbildung 5 B zeigt einen repräsentativen TIC des Aminosäurestandards, bei dem im Vergleich zum Wasserrohling kleine Spitzen beobachtet werden können, die den einzelnen Aminosäurearten entsprechen (z. B. Lysin bei 7,96 Minuten). Um den Peak zu integrieren und die Quantifizierung der Peak-Fläche (und damit der Konzentration) zu erleichtern, wird das XIC verwendet, wo nur das Signal aus einem definierten "Chromatogramm-Massenfenster" angezeigt wird. Je nach Empfindlichkeit des Instruments und Qualität der chromatographischen Trennung muss das optimale Massenfenster vom Anwender bestimmt werden. In diesem Beispiel (Abbildung 5C) wird der XIC von Lysin (m/z = 147.1144) mit einem Massenfenster von 10 ppm gezeigt, wo Lysin im Aminosäurestandard bei 8,03 Minuten aus der Säule ausgeht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig1.jpg"> Abbildung 1 . Repräsentatives Chromatogramm des Reinigungsschemas mit der Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Technik. Reinigungsmethodenphasen, die dem Volumen (mL) entsprechen, werden entlang der x-Achse beschriftet. Die UV-Absorption bei 280 nm (mAU y-Achse, volumenförmige Linie) wird während des gesamten Reinigungszyklus überwacht. Nicht spezifisch gebundene Verunreinigungen werden durch erhöhung der Leitfähigkeit (mS/cm y-Achse, gestrichelte Linie) während der Hochsalzwäsche verdrängt. Antikörper werden aus Protein-A-Säule mit der Einführung eines Elutionspuffers (Conc B, gepunktete Linie) eluiert, wenn der pH-Wert auf 4 (nicht angezeigt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig2.jpg"> Abbildung 2. Ein repräsentatives Fluoreszenzchromatogramm, das aus getaggten Glykanen gewonnen wird, die massenverifiziert sind. Die x-Achse ist die Haltezeit (Minuten), während die y-Achse die Signalintensität ist. Der Peak bei 14,94 min stellt das Mannose 5 (M5) Glycan dar, wobei ein großer Unterschied zwischen der M5-Signalstärke zwischen den beiden überlagerten Proben beobachtet werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig3.jpg"> Abbildung 3. Molekulargewichtsverteilung von IgG1 monoklonalen Antikörpern. Chromatogramm eines intakten monoklonalen IgG1-Antikörpers, getrennt durch Größenausschlusschromatographie in 1x PBS (pH7.4). Die Absorption wird bei 280 nm (schwarz; linke Achse) überwacht und Lichtstreuungs- und Brechungsindexdetektoren wurden verwendet, um das absolute Molekulargewicht jedes Peaks (rot und blau; rechte Achse) zu berechnen. Hochmolekulare Arten werden mit der Spitze mit der Bezeichnung "HMW" angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig4.jpg"> Abbildung 4 . Chargenvariantenprofil eines monoklonalen IgG1-Antikörpers. Dieses Elektropherogramm wird auf einer mCZE-Plattform erzeugt. Ein Freifärbespitzenwanderwert wandert bei 30 s und ist gut vom IgG1 getrennt. Für die Quantifizierung wurden die Spitzen mithilfe von Instrumentendatenanalysesoftware in Basis-, Haupt- und saure Arten aufgeteilt. Die rote Linie umreißt die integrierten Spitzenbereiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig5.jpg"> Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse der Ionenchromatogramme für die Massenspektrometrie-basierte Aminosäureanalyse von Rohbioreaktormedien. Die x-Achse ist Zeit (Minuten), während die y-Achse Signalintensität ist (A) Ein Wasserrohling dient als Negativkontrolle und zeigt das Hintergrundsignal an, das im Laufe des Flüssigchromatographie-Gradienten beobachtet wird (B) Die 225 pmol/L-Aminosäure Standard wird hier als Positivkontrolle verwendet, da die einzelnen Spitzen, die in diesem Gesamtionenchromatogramm beobachtet werden, die verschiedenen Aminosäuren des Standardmixes darstellen, der chromatographisch aufgelöst wird (C) Ein repräsentativ extrahiertes Ionenchromatogramm für m /z 147.1144, das ist Lysin. Der 7,96 min Spitzenwert in B entspricht dem 8,03-Spitzenwert in C von Lysin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Ein detailliertes Protokoll zur Reinigung und anschließenden Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus geernteter Zellkulturflüssigkeit (HCCF) automatisierter Mikrobioreaktoren wurde beschrieben. Die Verwendung von Analysen zur Bestimmung kritischer Qualitätsattribute (CQAs) und zur Maximierung des begrenzten Stichprobenvolumens zum Extrahieren wichtiger Informationen wird ebenfalls vorgestellt.

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Dieses Protokoll befasst sich mit der Analyse begrenzter Proben, die aus Mikrobioreaktoren gewonnen wurden, um wichtige Informationen über die kritischen Qualitätsmerkmale der Produkte zu extrahieren. Ein weiterer Vorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie minimale Analysezeiten verwenden, um die Wichtigstenattribute zu bestimmen, die die Qualitätsparameter des hergestellten Produkts diktieren. Demonstrierend werden David Powers, Talia Faison und Phillip Angart, Forschungsstipendiaten aus meinem Labor sein.Beginnen Sie mit dem Öffnen der Software, die an das Reinigungssystem angeschlossen ist, und legen Sie 15 Milliliter konische Rohre, um den gereinigten Antikörper eluat eluat und 50 Milliliter konische Rohre zu sammeln, um den Durchfluss während der hohen Salzwäsche in den Fraktionensammler zu sammeln. Als nächstes fügen Sie 0,22 Mikrometer Poren gefilterte geerntete Zellkulturflüssigkeit zu einer leeren 12-Milliliter-Spritze mit einer gekappten Düse hinzu. Nach dem Entfernen der Kappe die Spritzendüse in den manuellen Injektionsanschluss des Reinigungssystems einlegen.Drehen Sie die Spritze, um sie an Ort und Stelle zu ziehen, und drücken Sie den Kolben, bis das gesamte Volumen der Probe injiziert wurde und in der beigefügten 10 Milliliter großen Probenschleife sichtbar ist. Wählen Sie die gespeicherte Methode aus, und klicken Sie auf Ausführen, wenn Sie von der Instrumentensoftware dazu aufgefordert werden. Wenn der gesamte Antikörper entglüht ist, neutralisieren Sie das gereinigte Protein sofort mit einer Molarentrisbasis auf einen pH-Wert von etwa 5,5.Um den gereinigten Antikörper durch Zentrifugation zu konzentrieren, legen Sie 100 Kilodaltonfilter in Filtrat-Sammelrohre. Waschen Sie die Filter mit 500 Mikroliter doppeldestilliertem Wasser, dann Zentrifuge. Wiederholen Sie die Filterwäsche zweimal.Nach dem zweiten Waschen das Filtrat entsorgen und die gerederten Filter in neue Zentrifugenrohre übertragen. Als Nächstes fügen Sie 500 Mikroliter Probe zu jedem Filter für die Zentrifugation hinzu. Am Ende der Drehung den Filter in ein neues Sammelrohr umkehren, um die konzentrierte Probe mit einer abschließenden Zentrifugation zu erhalten.Zur N-Glyglykan-Etikettierung und Isolierung 7,5 Mikroliter jeder konzentrierten Antikörperprobe verdünnen. Mit 15,3 Mikroliterflüssigchromatographie-Massenspektrometrie oder LCMS-Wasser in Ein-Milliliter-Röhren aus dem Kit und Denaturierung der Antikörper mit sechs Mikrolitern einer 5%-Lösung eines enzym- und massenspektrometriesfreundlichen Tensids bei 90 Grad Celsius für drei Minuten. Am Ende der Denaturierung lassen Sie die Proben drei Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie 1,2 Mikroliter Peptid N-Glykosidase F für eine fünfminütige Inkubation bei 50 Grad Celsius hinzufügen.Nachdem Sie die Proben drei Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt haben, beschriften Sie die Proben mit 12 Mikrolitern fluoreszierendem Tagging-Reagenz, das in wasserfreiem Dimethylformamid bei Raumtemperatur gelöst ist. Am Ende der Inkubation die markierte N-Glykan-Mischung mit 358 Mikroliter Acetonitril verdünnen und eine hydrophile Wechselwirkungschromatographieplatte in einen Vakuumkrümmer mit Schimsen und Abfallschale legen. Konditionieren Sie die Brunnen mit 200 Mikroliter Wasser mit dem Vakuum auf 10 bis 15 Kilopascal eingestellt, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit 15 bis 30 Sekunden dauert, um das hydrophile Interaktionschromatographieharz zu passieren.Die Brunnen mit 200 Mikrolitern 85%Acetonitril für 15 bis 30 Sekunden ausstatten, bevor 400 Mikroliter jedes markierten Glykangemischs auf jeden Brunnen geladen werden, wobei das Vakuum nach dem Zuführen jeder neuen Flüssigkeit aufgebracht wird. Wenn alle Proben zugegeben sind, waschen Sie das Harz zweimal mit 600 Mikroliter1%Ameisensäure und 90%acetonitril pro Waschgang und ersetzen Sie die Abfallwanne durch 600-Mikroliter-Sammelrohre. Dann entziehen Sie sich den beschrifteten N-Glykanen mit drei 30-Mikroliter-Volumen Spektrometrie-Elutionspuffer und verdünnen Sie die Beckenverdünnungen mit 310 Mikroliter Dimethylformamid in Acetonitex-Probeeluent.Um die beschrifteten N-Glykan-Elutionsproben auf einem ultraleistungsfähigen Flüssigchromatographiesystem zu analysieren, das an einen Fluoreszenzdetektor gekoppelt ist, und die vierfache Zeit des Flugmassenspektrometers verwenden Sie 50 Millimolar Ammoniumformat und 100%LCMS-Acetonitril für die mobilen Phasen. Legen Sie den anfänglichen Durchfluss auf 0,4 Milliliter pro Minute fest, wobei der LC-Gradient während der Elutionsphase ein zunehmendes Ammoniumformat bietet. Stellen Sie den Fluoreszenzdetektor ein, um eine Anregung von 265 Nanometern und eine Emission von 425 Nanometern mit einer Abtastrate von zwei Hertz zu messen.Stellen Sie die vierfache Flugzeit auf den MS1-positiven Ionenempfindlichkeitsmodus mit einem Massenbereich von 100 bis 2 000 Daltons, einer Scanzeit von 0,25 Sekunden und einer Kontinuumsdatenerfassung ein. Laden Sie dann die Samples in den auf 10 Grad Celsius eingestellten auto Sampler, und führen Sie die geladene Methode aus. Um eine Probe in Vorbereitung auf die Ladungsvariantenanalyse zu entsalzen, schnappen Sie den unteren Stopfen einer 0,5 Milliliter Entsalzungssäule ab, lösen Sie den oberen Stopfen und legen Sie die Entsalzungssäule in ein 1,7 Milliliter Zentrifugenrohr.Übertragen Sie die neue Säule in ein neues Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie 80 Mikroliter einer 3,5 Milligramm pro Milliliter Antikörperlösung an die Oberseite der Säule. Richten Sie die Spalte an der ursprünglichen Ausrichtung aus, und zentrieren Sie die Spalte. Dann entsorgen Sie die Entsalzungssäule und mischen Sie die konzentrierte Probe gründlich.Verdünnen Sie die Probe auf eine Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter in 25 Mikroliter Reinstwasser in einem einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte und fügen Sie fünf Mikroliter Etikettierpuffer und fünf Mikroliter Etikettierungsreagenz in den Brunnen. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Lichtschutz bei Raumtemperatur 60 Mikroliter Reagenzwasser mit der Probe mischen und die Platte mit einer Plattendichtung für die Zentrifugation bedecken. Um die Ladung Variante Chip vorzubereiten, entfernen Sie die Speicherlösung und waschen Brunnen eins, drei, vier, sieben, acht und 10 mit Wasser.Ersetzen Sie das Wasser durch pH 7.2-Laufpuffer und fügen Sie dem Pufferrohr 750 Mikroliter Laufpuffer hinzu. Drücken Sie auf der Benutzeroberfläche des Geräts die Entladeplatte und entfernen Sie die Dichtung von der 96-Well-Platte. Setzen Sie die Platte und das Pufferrohr in die angegebenen Stellen auf dem GX2-Probenfach ein und drücken Sie Die Lastplatte.Legen Sie den Chip in die Chipkammer, schließen Sie den Deckel an der Chipkammer, wählen Sie den HT-Proteinladungsvariantentest aus, wenn Sie dazu aufgefordert werden, und klicken Sie auf Ausführen. Die Reinigung der geernteten Zellkulturprobe aus dem automatisierten Mikroskalen-Bioreaktor durch schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie ermöglicht die Charakterisierung der kritischen Qualitätsmerkmale der gereinigten Proteine durch verschiedene nachgelagerte Analysemethoden, wie gezeigt. N-Glykan-Daten von chinesischen Hamster-Ovarial-produzierten monoklonalen Antikörpern, die durch Massenspektrometrie verarbeitet werden, sollten diesen repräsentativen Chromatogrammen ähnlich erscheinen.Größenausschlusschromatographie Multiple-Winkel-Lichtstreuung kann verwendet werden, um das Aggregationsprofil und das Molekulargewicht des Antikörpers zu bewerten. Die geringe Menge der Probe und die Bedeutung der Aggregation sind wichtige Qualitätsmerkmale, um diese Technik zu einem sehr wertvollen ergänzenden Analysewerkzeug zum automatisierten Mikrobioreaktorsystem zu machen. Das Ergebnis der Mikrokapillarzonenelektrophorese ist ein Elektropherogramm und kann verwendet werden, um das Ladungsvariantenprofil für einen monoklonalen Antikörper zu zeigen, eine einzigartige Signatur für das untersuchte Protein, das hochempfindlich auf den betriebsbereiten pH-Wert reagiert.Der Aminosäureverbrauch kann auch überwacht werden, um festzustellen, ob die Erschöpfung Veränderungen in den kritischen Qualitätsmerkmalen des Antikörpers bewirkt. Es ist wichtig, eine ordnungsgemäße und effiziente Reinigung des hergestellten Produkts zu gewährleisten, da die analytischen Schritte nur mit einem ordnungsgemäß gereinigten Protein durchgeführt werden können. Das Produkt kann auch Peptid-Mapping und Stabilitätstests unterzogen werden.Aber sobald das Protein für eine Charakterisierungsmethode verwendet wurde, kann es in der Regel nicht für eine andere verwendet werden. Diese Techniken ermöglichen die Analyse von Produkten, die aus Bioverarbeitungsplattformen mit geringem Volumen und hohem Durchsatz hergestellt werden, um den Einfluss von Bioverarbeitungsparametern auf die Produktqualität zu verstehen. Einige dieser Techniken verwenden konzentrierte Perchlorsäure, Ameisensäure, N-Dimethylformamid, die alle gefährlich sind und sorgfältig behandelt werden sollten, während sie die richtige Schutzausrüstung tragen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Forschung

Biotechnik

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatisierte Dia scannen und Segmentierung in Gewebekulturen beschriftet Gewebe mit einem Weitfeld High-Content Analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Pseudomonas Aeruginosa mit einem automatisierten höheren Durchsatz mikrofluidischen System Zelle Analyse der Schubspannung weiterleben

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...