이 프로토콜은 제품의 중요한 품질 특성에 대한 중요한 정보를 추출하기 위해 미생물 반응기에서 얻은 제한된 샘플의 분석을 다룹니다. 이러한 기술의 또 다른 장점은 최소한의 분석 시간을 사용하여 제조 된 제품의 품질 매개 변수를 지시하는 주요 특성을 결정한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 데이비드 파워스, 탈리아 페이슨, 필립 앙가르트, 내 실험실에서 연구 펠로우가 될 것입니다.
정제 시스템에 부착된 소프트웨어를 열고 정제된 항체 용염 및 50 밀리리터 원추형 튜브를 수집하여 분수 수집기로 높은 염분 세척 시 흐름을 수집하는 것으로 시작한다. 다음으로, 0.22 마이크로미터 모공 여과된 수확된 세포 배양액을 덮인 노즐이 있는 빈 12밀리리터 주사기에 추가합니다. 캡을 제거한 후, 정화 시스템의 수동 사출 포트에 주사기 노즐을 삽입한다.
주사기를 비틀어 시료의 전체 부피가 주입되고 부착된 10 밀리리터 대용량 샘플 루프에서 볼 수 있습니다. 저장된 메서드를 선택하고 계측기 소프트웨어의 메시지가 표시되면 실행을 클릭합니다. 모든 항체가 배제되면, 정제된 단백질을 1개의 어금니 트리베이스로 즉시 약 5.5의 pH로 중화한다.
정제된 항체를 원심분리에 농축하려면 100킬로달톤 필터를 여과 수집 튜브에 넣습니다. 필터를 이중 증류수 500마이크로리터로 세척한 다음 원심분리기를 세척합니다. 필터 세척을 두 번 반복합니다.
두 번째 세척 후, 여과를 버리고 헹구는 필터를 새로운 원심분리기 튜브로 옮겨냅니다. 다음으로 원심분리를 위해 각 필터에 500마이크로리터의 샘플을 추가합니다. 스핀의 끝에서, 최종 원심 분리와 농축 된 샘플을 얻기 위해 새로운 수집 튜브로 필터를 반전.
N-글리칸 라벨링 및 절연을 위해 각 농축 항체 샘플의 7.5 마이크로리터를 희석시하십시오. 키트에서 1밀리리터 튜브에 15.3 마이크로리터의 액체 크로마토그래피 질량 분광법 또는 LCMS 급 수분으로, 3분 동안 90°C에서 효소 친화적이고 질량 분광에 친화적인 계면활성제의 5%의 마이크로리터 6개를 사용하여 항체를 분해합니다. 데마처링이 끝나면 시료가 3분 동안 실온으로 냉각된 후 펩타이드 N-글리코시다아제 F의 마이크로리터를 섭씨 50도에서 5분간 배양할 수 있습니다.
시료를 실온까지 3분 동안 냉각한 후 실온에서 5분 동안 무수성 디메틸포르마미드에 용해된 12개의 형광 태깅 시약으로 샘플을 라벨로 지정합니다. 인큐베이션의 끝에서, 아세토닐트리의 358 마이크로리터로 표시된 N-글리칸 혼합물을 희석하고 심과 폐기물 쟁반이 있는 진공 매니폴드에 수성 성소 작용 크로마토그래피 플레이트를 놓습니다. 200 마이크로리터의 물을 진공으로 10~15킬로파스칼로 조절하여 액체가 15~30초 정도 걸리도록 하여 수성 성소 성소 염색체 수지를 통과합니다.
각 음질에 각 표지된 글리칸 혼합물의 400 마이크로리터를 적재하기 전에 15~30초 동안 85%의 아세토닐릴200 마이크로리터로 우물을 상화하여 각 새 액체를 첨가한 후 진공을 가집니다. 모든 시료를 첨가하면 수지600 마이크로리터1%의 마이크로리터와 세척당 90%의 아세토닐트리어로 두 번 세척하고 폐기물 트레이를 600마이크로리터 수집 튜브로 교체합니다. 그런 다음 30 마이크로리터 용량의 분광력 용출 버퍼로 표지된 N-글리칸을 회피하고 아세토닐틸리알 샘플링 용출제에서 310마이크로리터의 디메틸포르마미드로 풀 희석제를 희석시합니다.
형광 검출기및 비행 질량 분광계의 4중 시간에 결합된 초고성능 액체 크롬토그래피 시스템에서 표지된 N-글리칸 용출 샘플을 분석하려면 이동 단계에 대해 50 밀리머암모늄 용암모늄 과 100% LCMS 등급 아세토나이트를 사용하십시오. 초기 유량은 분당 0.4 밀리리터로 설정하고 LC 그라데이션은 용출 단계에서 암모늄 용산염을 증가시도록 합니다. 265 나노미터의 발산과 2 헤르츠의 샘플링 속도로 425 나노미터의 방출을 측정하기 위해 형광 검출기를 설정합니다.
100~2, 000 달톤의 질량 범위, 0.25초의 스캔 시간 및 연속체 데이터 수집으로 MS1 양성 이온 감도 모드로 비행하는 네 배의 시간을 설정합니다. 그런 다음 샘플을 자동 샘플러에 10°C로 로드하고 로드된 메서드를 실행합니다. 충전 변형 분석을 준비하기 위해 샘플을 탈염하려면 0.5 밀리리터 탈염 컬럼의 바닥 스토퍼를 스냅하고 상단 스토퍼를 풀고 탈염 컬럼을 1.7 밀리리터 원심분리기 튜브에 놓습니다.
새로운 컬럼을 새로운 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기고 밀리리터 항체 용액당 3.5밀리그램의 80마이크로리터를 컬럼 상단에 추가합니다. 열을 원래 방향에 정렬하고 열을 원심분리합니다. 그런 다음 탈염 컬럼을 버리고 농축 된 샘플을 철저히 혼합합니다.
96웰 플레이트의 단일 웰에 25 마이크로리터의 초순수 수분에서 밀리리터 농도당 2밀리그램으로 샘플을 희석하고 라벨링 버퍼 5개소와 라벨링 시약 5마이크로리터를 첨가합니다. 빛으로부터 보호되는 실온에서 10분 간 배양한 후 시약 등급의 물 60마이크로리터를 샘플과 혼합하고 원심 분리를 위한 플레이트 씰로 플레이트를 덮습니다. 전하 변형 칩을 준비하려면 저장 용액을 제거하고 우물 1, 3, 4, 7, 8 및 10을 물로 세척하십시오.
물을 pH 7.2 실행 버퍼로 교체하고 버퍼 튜브에 750 마이크로리터의 실행 버퍼를 추가합니다. 계측기 사용자 인터페이스에서 언로드 플레이트를 누르고 96웰 플레이트에서 씰을 제거합니다. 플레이트와 버퍼 튜브를 GX2 샘플 트레이의 표시된 지점에 삽입하고 로드 플레이트를 누릅니다.
칩 챔버에 칩을 놓고 뚜껑을 칩 챔버에 닫고 메시지가 표시될 때 HT 단백질 충전 변형 분석기를 선택하고 실행을 클릭합니다. 빠른 단백질 액체 크로마토그래피에 의해 자동화된 마이크로스케일 생물반응기로부터 수확된 세포 배양 시료의 정제를 통해 다양한 하류 분석 방법에 의한 정제된 단백질의 중요한 품질 특성의 특성을 입증할 수 있다. 질량 분석법에 의해 처리된 중국 햄스터 난소에서 생성된 단클론 항체의 N-글리칸 데이터는 이러한 대표적인 크로마토그램과 유사하게 나타나야 한다.
크기 배제 크로마토그래피 다중 각도 광 산란은 항체의 응집 프로파일 및 분자량을 평가하는 데 사용될 수 있다. 소량의 시료와 집계의 중요성은 이 기술을 자동화된 미생물 반응기 시스템에 매우 귀중한 보완 분석 도구로 만들기 위한 중요한 품질 특성입니다. 마이크로 모세관 영역 전기포광의 결과는 전기페로그램이며 단클론 항체에 대한 전하 변이체 프로파일을 표시하는 데 사용될 수 있으며, 이는 작동 pH에 매우 민감한 단백질에 대한 독특한 시그니처이다.
아미노산 소비는 또한 고갈이 항체의 중요한 품질 속성에 변경을 일으키는지 결정하기 위하여 감시될 수 있습니다. 분석 단계는 제대로 정제 된 단백질로만 수행 할 수 있기 때문에 제조 된 제품의 적절하고 효율적인 정제를 보장하는 것이 중요합니다. 이 제품은 펩티드 매핑 및 안정성 테스트를 실시할 수도 있습니다.
그러나 단백질이 하나의 특성화 방법에 사용되면 전형적으로 다른 특성화 방법을 사용할 수 없습니다. 이러한 기술은 소량의 높은 처리량 바이오 프로세싱 스크리닝 플랫폼에서 생산된 제품을 분석하여 바이오 프로세싱 파라미터가 제품 품질에 미치는 영향을 이해할 수 있게 합니다. 이러한 기술 중 일부는 농축 된 과염소산, 포름산, N-디메틸포르마미드를 사용하며, 모두 위험하며 적절한 보호 장비를 착용하는 동안 신중하게 처리해야합니다.
