Rensing og analyse av en monoklonale antistoff fra kinesisk hamster eggstokk celler ved hjelp av en automatisert Microbioreactor system

Denne protokollen tar for seg analyse av begrensede prøver hentet fra mikrobioreaktorer for å trekke ut viktig informasjon om produktenes kritiske kvalitetsattributter. En annen fordel med disse teknikkene er at de bruker minimale tider med analyse for å bestemme de viktigste attributtene som dikterer kvalitetsparametrene til det produserte produktet. Å demonstrere prosedyren vil være David Powers, Talia Faison og Phillip Angart, stipendiater fra laboratoriet mitt.

Begynn med å åpne programvaren som er festet til rensesystemet og plassere 15 milliliter koniske rør for å samle det rensede antistoffet eluate og 50 milliliter koniske rør for å samle gjennomstrømningen under den høye saltvasken inn i fraksjonssamleren. Deretter legger du til 0,22 mikrometer pore filtrert høstet cellekulturvæske til en tom 12-milliliter sprøyte med en avkortet dyse. Når du har fjernet hetten, setter du sprøytedysen inn i den manuelle injeksjonsporten på rensesystemet.

Vri sprøyten for å stramme den på plass og trykk stempelet inn til hele volumet av prøven er injisert og er synlig i den vedlagte 10 milliliter store volumprøvesløyfen. Velg den lagrede metoden, og klikk Kjør når du blir bedt om det av instrumentprogramvaren. Når alt antistoffet er unnsluppet, nøytraliser umiddelbart det rensede proteinet med en molartrisbase til en pH på ca. 5,5.

For å konsentrere det rensede antistoffet ved sentrifugering, legg 100 kilodaltonfiltre i filtratoppsamlingsrør. Vask filtrene med 500 mikroliter dobbelt destillert vann, deretter sentrifuge. Gjenta filtervask to ganger.

Etter den andre vasken, kast filtratet og overfør de skyllede filtrene til nye sentrifugerør. Deretter legger du til 500 mikroliter prøve til hvert filter for sentrifugering. På slutten av spinnet, inverter filteret til et nytt oppsamlingsrør for å få den konsentrerte prøven med en endelig sentrifugering.

For N-glykolmering og isolasjon fortynnes 7,5 mikroliter av hver konsentrert antistoffprøve. Med 15,3 mikroliter flytende kromatografi massespektrometri eller LCMS-grade vann i en milliliter rør fra settet, og denature antistoffene med seks mikroliter av en 5% løsning av en enzym-vennlig og massespektrometri-vennlig overflateaktivt middel på 90 grader Celsius i tre minutter. På slutten av denningen, la prøvene avkjøles til romtemperatur i tre minutter før du legger til 1,2 mikroliter peptid N-glykosidase F for en fem minutters inkubasjon ved 50 grader Celsius.

Etter å ha avkjølt prøvene i tre minutter til romtemperatur, merk prøvene med 12 mikroliter fluorescerende merking reagens oppløst i vannfri dimetylformamid i fem minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen fortynnes den merkede N-glykolske blandingen med 358 mikroliter acetonitril og plasserer en hydrofil interaksjonskromatografiplate i en vakuummanifold med shims og avfallsbrett. Bekreft brønnene med 200 mikroliter vann med vakuumet justert til 10 til 15 kilopascals for å sikre at væsken vil ta 15 til 30 sekunder å passere gjennom hydrofile interaksjon kromatografi harpiks.

Likevekt brønnene med 200 mikroliter på 85% acetonitril i 15 til 30 sekunder før du laster 400 mikroliter av hver merkede glykolblanding til hver brønn, og påfører vakuumet etter at hver ny væske er tilsatt. Når alle prøvene er lagt til, vask harpiksen to ganger med 600 mikroliter på 1 % maursyre og 90 % acetonitril per vask og skift ut avfallsbrettet med 600 mikroliteroppsamlingsrør. Deretter unnvike merket N-glycans med tre 30-mikroliter volumer av spektrometri elution buffer og fortynne bassenget fortynninger med 310 mikroliter dimetylformamid i acetonitril samplet eluent.

For å analysere de merkede N-glycan elution prøvene på en ultraperformance flytende kromatografi system sammenlignet med en fluorescens detektor og firedoble tid av flymasse spektrometer, bruk 50 millimolar ammonium formate og 100% LCMS klasse acetonitril for de mobile fasene. Sett den opprinnelige strømningshastigheten til 0,4 milliliter per minutt, med LC-graderingen som gir økende ammoniumformat under elutionfasen. Sett fluorescensdetektoren til å måle en eksitasjon på 265 nanometer og et utslipp på 425 nanometer med en samplingsfrekvens på to hertz.

Sett firedobletiden for flyvningen til MS1-positiv ionfølsomhetsmodus med et masseområde på 100 til 2 000 Daltons, en skannetid på 0,25 sekunder og et viderespill datainnhenting. Last deretter prøvene inn i auto sampler satt til 10 grader Celsius og kjøre den lastede metoden. For å avsalte en prøve som forberedelse til ladevariantanalyse, snap av bunnproppen på en 0,5 milliliter avsaltingskolonne, løsne toppproppen og legg avsaltingskolonnen i et 1,7 milliliter sentrifugerør.

Overfør den nye kolonnen til et nytt mikrocentrifugerør og legg til 80 mikroliter av en 3,5 mg per milliliter antistoffløsning til toppen av kolonnen. Juster kolonnen etter den opprinnelige retningen, og sentrifuger kolonnen. Kast deretter avsaltingskolonnen og bland den konsentrerte prøven grundig.

Fortynn prøven til en to milligram per milliliter konsentrasjon i 25 mikroliter ultrapure vann i en enkelt brønn av en 96-brønns plate og tilsett fem mikroliter merking buffer og fem mikroliter merking reagens til brønnen. Etter en 10-minutters inkubasjon ved romtemperatur beskyttet mot lys, bland 60 mikroliter reagensvann med prøven og dekk platen med en plateforsegling for sentrifugering. For å forberede ladevariantbrikken, fjern lagringsløsningen og vask brønnene en, tre, fire, syv, åtte og 10 med vann.

Bytt vannet med pH 7.2 løpebuffer og tilsett 750 mikroliter med løpebuffer i bufferrøret. Trykk Loss Plate på instrumentets brukergrensesnitt og fjern tetningen fra 96-brønnplaten. Sett platen og bufferrøret inn i de angitte flekkene på GX2-prøveskuffen og trykk på Leggplate.

Plasser brikken i chipkammeret, lukk lokket til chipkammeret, velg HT proteinladningsvariantanalysen når du blir bedt om det, og klikk Kjør. Rensing av den høstede cellekulturprøven fra den automatiserte mikroskalabioreaktoren ved rask proteinvæskekromatografi tillater karakterisering av de kritiske kvalitetsattributtene til de rensede proteinene ved ulike nedstrøms analytiske metoder, som demonstrert. N-glykoldata fra kinesiske hamster eggstokk-produserte monoklonale antistoffer behandlet av massespektrometri bør vises lik disse representative kromatogrammer.

Størrelse eksklusjon kromatografi flere vinkel lys spredning kan brukes til å vurdere aggregering profil og molekylvekt av antistoffet. Den lille mengden av prøven og betydningen av aggregeringen er kritiske kvalitetsattributter for å gjøre denne teknikken til et svært verdifullt komplementært analytisk verktøy til det automatiserte mikrobioreaktorsystemet. Resultatet av mikrokapillær sone elektroforese er et elektroforammet og kan brukes til å vise ladevariantprofilen for et monoklonalt antistoff, en unik signatur for proteinet som undersøkes som er svært følsom for driftspH.

Aminosyreforbruket kan også overvåkes for å avgjøre om uttømmingen forårsaker endringer i de kritiske kvalitetsattributtene til antistoffet. Det er viktig å sikre en riktig og effektiv rensing av det produserte produktet, da de analytiske trinnene bare kan utføres med et riktig renset protein. Produktet kan også bli utsatt for peptid kartlegging og stabilitet testing.

Men når proteinet har blitt brukt til en karakteriseringsmetode, kan det vanligvis ikke brukes til en annen. Disse teknikkene tillater analyse av produkter produsert fra lite volum, høy gjennomstrømning bioprosessering screening plattformer for å forstå påvirkning av bioprosessering parametere på produktkvalitet. Noen av disse teknikkene bruker konsentrert perklorsyre, maursyre, N-dimetylformamid, som alle er farlige og bør håndteres forsiktig mens du bruker riktig verneutstyr.