Этот протокол касается анализа ограниченных образцов, полученных от микробиореакторов для извлечения жизненно важной информации о критических качествах продукции. Еще одним преимуществом этих методов является то, что они используют минимальное время анализа для определения ключевых атрибутов, которые диктуют параметры качества производимого продукта. Демонстрацией процедуры будут Дэвид Пауэрс, Талия Фэйсон и Филлип Ангарт, научные сотрудники из моей лаборатории.

Начните с открытия программного обеспечения, прикрепленного к системе очистки и размещения 15 миллилитров конических труб для сбора очищенных антител eluate и 50 миллилитров конических труб для сбора потока через во время высокой соль мыть в сборщик фракций. Затем добавьте 0,22 микрометровую фильтрованную жидкость культуры клеток в пустой 12-миллилитровый шприц с крышкой сопла. После снятия крышки вставьте сопло шприца в порт ручного впрыска системы очистки.

Твист шприц, чтобы затянуть его на месте и угнетать поршень до тех пор, пока весь объем образца был введен и виден в прилагаемом 10 миллилитров большой объем образца петли. Выберите сохраненный метод и нажмите Run по запросу программного обеспечения инструмента. Когда все антитела были ускользали, немедленно нейтрализовать очищенный белок с одним молярным трис базы рН около 5,5.

Чтобы сконцентрировать очищенные антитела центрифугой, поместите 100 килодальтонных фильтров в трубки для сбора фильтров. Вымойте фильтры 500 микролитров двойной дистиллированной воды, затем центрифугу. Повторите промыть фильтр два раза.

После второй стирки отбросьте фильтр и перенесите промытые фильтры в новые центрифуги. Затем добавьте 500 микролитров образца к каждому фильтру для центрифугации. В конце спина, инвертировать фильтр в новую трубку сбора для получения концентрированного образца с окончательной центрифугации.

Для маркировки и изоляции N-гликан разбавляют 7,5 микролитров каждого концентрированного образца антител. С 15,3 микролитров жидкой хроматографии масс-спектрометрии или LCMS-класса воды в одноми миллилитровых труб из комплекта, и денатурировать антитела с шестью микролитерами 5%-решение фермента дружественных и масс-спектрометрии дружественных сурфактант при 90 градусов по Цельсию в течение трех минут. В конце денатурации, дайте образцам остыть до комнатной температуры в течение трех минут, прежде чем добавить 1,2 микролитров пептида N-гликозидазы F в течение пяти минут инкубации при температуре 50 градусов по Цельсию.

После охлаждения образцов в течение трех минут до комнатной температуры, этикетка образцов с 12 микролитров флуоресцентных пометки реагент растворяется в агидроус диметилформамид в течение пяти минут при комнатной температуре. В конце инкубации разбавьте маркированную смесь N-гликан 358 микролитров ацетонитрила и поместите гидрофильные взаимодействия хроматографической пластины в вакууме многообразия с оболочками и отходов лоток. Состояние скважин с 200 микролитров воды с вакуумом регулируется от 10 до 15 килопаскалей для обеспечения того, чтобы жидкость займет от 15 до 30 секунд, чтобы пройти через гидрофильные взаимодействия хроматографии смолы.

Equilibrate скважин с 200 микролитров 85%acetonitrile в течение 15 до 30 секунд до загрузки 400 микролитров каждой помеченной смеси гликан для каждой скважины, применяя вакуум после каждой новой жидкости добавляется. Когда все образцы были добавлены, мыть смолы два раза с 600 микролитров 1%formic кислоты и 90%ацетонитрил на стирку и заменить отходы лоток с 600-микролитров сбора труб. Затем ускользните от помеченных N-гликанов с тремя 30-микролитровыми томами буфера спектрометрии и разбавьте разбавления бассейна 310 микролитров диметилформамида в ацетонитриле, отобранном элуентом.

Для анализа помеченных образцов N-гликан elution на ультраперформансной жидкой хроматографии системы в сочетании с детектором флуоресценции и четырехкратное время полета масс-спектрометра, используйте 50 миллимолярия аммония formate и 100% LCMS класса ацетонитрил для мобильных фаз. Установите начальную скорость потока до 0,4 миллилитров в минуту, при этом градиент LC обеспечивает увеличение количества аммония во время фазы элюции. Установите детектор флуоресценции для измерения возбуждения 265 нанометров и выброса 425 нанометров с процентной ставкой выборки в два герца.

Установите четырехкратное время полета в режим чувствительности MS1 с диапазоном масс от 100 до 2000 далтонов, время сканирования 0,25 секунды и сбор данных континуума. Затем загрузите образцы в автосборку, установленную до 10 градусов по Цельсию, и запустите загруженный метод. Чтобы дезавуировать образец в рамках подготовки к анализу варианта заряда, смахнуть нижнюю пробку 0,5 миллилитров опреснительной колонки, ослабить верхнюю пробку и поместить десалированную колонку в 1,7 миллилитровую центрифугу.

Перенесите новую колонку в новую микроцентрифугную трубку и добавьте 80 микролитров раствора антител на 3,5 миллиграмма в верхней части колонны. Выровняете столбец к первоначально ориентации и центрифуге колонки. Затем отбросьте десалирование колонки и тщательно перемешайте концентрированный образец.

Разбавить образец до двух миллиграммов на миллилитр концентрации в 25 микролитров ультрапурной воды в одном колодец 96-хорошо пластины и добавить пять микролитров маркировки буфера и пять микролитров маркировки реагента в колодец. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре, защищенной от света, смешайте с образцом 60 микролитров воды реагентного класса и накройте пластину уплотнением пластины для центрифугации. Чтобы подготовить чип варианта заряда, удалите раствор для хранения и вымойте колодцы одним, тремя, четырьмя, семью, восемью и 10 с водой.

Замените воду буфером для работы pH 7.2 и добавьте 750 микролитров бегущего буфера в буферную трубку. Нажмите Unload Плита на пользовательском интерфейсе инструмента и удалить печать из 96-ну пластины. Вставьте пластину и буферную трубку в указанные пятна на подносе образца GX2 и нажмите Нагрузную плиту.

Поместите чип в камеру чипа, закройте крышку к камере чипа, выберите вариант заряда белка HT, когда это предложено, и нажмите Run. Очистка образца клеточной культуры из автоматизированного микромасштабного биореактора с помощью быстрой белковой жидкой хроматографии позволяет, как было продемонстрировано, характеристика критических качественных атрибутов очищенных белков различными аналитическими методами ниже по течению. N-гликан данные из китайского хомяка яичников производства моноклональных антител, обработанных масс-спектрометрии должны появиться похожи на эти репрезентативные хроматограммы.

Размер исключения хроматографии многоугольного рассеяния света могут быть использованы для оценки профиля агрегации и молекулярного веса антитела. Небольшое количество выборки и важность агрегации являются важнейшими качества атрибутами для того, чтобы сделать этот метод очень ценным дополнительным аналитическим инструментом для автоматизированной системы микробиореакторов. Результатом микро капиллярной зоны электрофорез является электроферограмма и может быть использован, чтобы показать профиль варианта заряда для моноклонального антитела, уникальная подпись для исследуемого белка, который очень чувствителен к операционному рН.

Потребление аминокислот также можно контролировать, чтобы определить, является ли истощение вызывает изменения в критических качества атрибутов антитела. Важно обеспечить надлежащую и эффективную очистку производимого продукта, так как аналитические шаги могут осуществляться только с правильно очищенным белком. Продукт также может быть подвергнут пептидного картирования и стабильности тестирования.

Но как только белок был использован для одного метода характеристики, он обычно не может быть использован для другого. Эти методы позволяют анализу продукции, производимой из небольших объемов, высокой пропускной способности биообработки скрининговых платформ, чтобы понять влияние параметров биообработки на качество продукции. Некоторые из этих методов используют концентрированную перхлорную кислоту, мякоть, N-диметилформамид, все из которых являются опасными и должны быть обработаны тщательно при ношении надлежащего защитного оборудования.

Summary

Explore More Videos

147