13.9K Views
•
10:50 min
•
May 1st, 2019
DOI :
May 1st, 2019
•0:04
Title
0:39
Antibody Purification
1:49
Purified Antibody Concentration
2:33
N-Glycan Labeling and Isolation
5:00
Labeled N-Glycan Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) Analysis
6:17
Charge Variant Sample Preparation
7:38
Charge Variant Chip Preparation
8:31
Results: Representative Purified Monoclonal Antibody Automated Microbioreactor System Analyses
9:58
Conclusion
Transcript
Detta protokoll behandlar analysen av begränsade prover som erhållits från mikrobioreaktorer för att extrahera vital information om produkternas kritiska kvalitetsattribut. En annan fördel med dessa tekniker är att de använder minimala tider för analys för att bestämma de viktigaste attribut som dikterar kvalitetsparametrar av den tillverkade produkten. Demonstrerar förfarande kommer att David Powers, Talia Faison och Phillip Angart, forskarstipendiater från mitt laboratorium.
Börja med att öppna programvaran som är fäst vid reningssystemet och placera 15 milliliter koniska rör för att samla upp den renade antikroppen eluat och 50 milliliter koniska rör för att samla in genomflödet under den höga salttvätten i fraktionssamlaren. Därefter tillsätt 0,22 mikrometer por filtrerad skördad cellkulturvätska till en tom 12-milliliter spruta med ett tak munstycke. När du har tagit bort locket, för du in sprutmunstycket i reningssystemets manuella insprutningsport.
Vrid sprutan för att dra åt den på plats och tryck ned kolven tills provets hela volym har injicerats och är synlig i den bifogade 10 milliliter provslingan med stor volym. Välj den sparade metoden och klicka på Kör när du uppmanas av instrumentprogramvaran. När hela antikroppen har gäckats, omedelbart neutralisera det renade proteinet med en molar tris bas till ett pH-värde på ca 5,5.
För att koncentrera den renade antikroppen genom centrifugering, placera 100 kilodaltonsfilter i filtratsamlingsrör. Tvätta filtren med 500 mikroliter dubbeldestillerat vatten, sedan centrifug. Upprepa filtertvätt två gånger.
Efter den andra tvätten, kassera filtratet och överför de sköljda filtren till nya centrifugrör. Därefter lägger du till 500 mikroliter prov till varje filter för centrifugeringen. Vid slutet av snurrandet, invertera filtret till ett nytt uppsamlingsrör för att få det koncentrerade provet med en slutlig centrifugering.
För N- glyskanmärkning och isolering, späd 7,5 mikroliter av varje koncentrerat antikroppsprov. Med 15,3 mikroliter av flytande kromatografi masspektrometri eller LCMS-grade vatten i en-milliliter rör från satsen, och denaturer antikropparna med sex mikroliter av en 5%lösning av en enzymvänlig och masspektrometri-vänligt ytaktiva vid 90 grader Celsius i tre minuter. I slutet av denaturering, låt proverna svalna till rumstemperatur i tre minuter innan du lägger till 1,2 mikroliter av peptid N-glykosa F för en fem minuters inkubation vid 50 grader Celsius.
Efter att ha kylt proverna i tre minuter till rumstemperatur, märk proven med 12 mikroliter av fluorescerande taggningsreagens upplöst i vattenfri dimetylformamid i fem minuter vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen späd den märkta N-glycanblandningen med 358 mikroliter acetonitril och placera en hydrofil interaktionskromatografiplatta i ett vakuumgrenrör med mellanlägg och spillbricka. Villkora brunnarna med 200 mikroliter vatten med vakuumet justerat till 10 till 15 kilopascals för att säkerställa att vätskan kommer att ta 15 till 30 sekunder att passera genom den hydrofila interaktionkromatografiharts.
Jämvikt brunnarna med 200 mikroliter av 85%acetonitrile i 15 till 30 sekunder innan du laddar 400 mikroliter av varje märkt glyanblandning till varje brunn, tillämpa vakuum efter varje ny vätska tillsätts. När alla prover har tillsatts, tvätta hartset två gånger med 600 mikroliter av 1%myrsyra och 90%acetonitril per tvätt och ersätta avfallsbrickan med 600-mikroliter uppsamlingsrör. Gäcka sedan de märkta N-glynaner med tre 30-mikrolitervolymer av spektrometri elueringsbuffert och späda ut poolutspädningarna med 310 mikroliter av dimetylformamid i acetonitrilprovad eluent.
För att analysera de märkta N-glycan elueringsproverna på ett ultraperformance vätskekromatografi system kopplade till en fluorescens detektor och fyrdubbla tiden för flyg masspektrometer, använd 50 millimolar ammonium formate och 100%LCMS grade acetonitrile för de mobila faserna. Ställ in den initiala flödeshastigheten till 0,4 milliliter per minut, med LC-gradienten som ger ökande ammoniumformate under elutionsfasen. Ställ in fluorescensdetektorn för att mäta en excitation av 265 nanometer och ett utsläpp av 425 nanometer med en samplingsfrekvens på två hertz.
Ställ in den fyrdubbla tiden för flygningen till MS1-positivt jonkänslighetsläge med ett massintervall på 100 till 2, 000 Daltons, en skanningstid på 0,25 sekunder och ett kontinuumdatainhämtning. Sedan ladda proverna i den automatiska sampler inställd på 10 grader Celsius och kör den laddade metoden. För att avsalta ett prov som förberedelse för analys av laddningsvarianten, snäpp av bottenproppen på en 0,5 milliliter desaltningskolumn, lossa den övre proppen och placera avsaltningskolumnen i ett 1,7 milliliter centrifugeringsrör.
Överför den nya kolumnen till ett nytt mikrocentrifugrör och tillsätt 80 mikroliter av en 3,5 milligram per milliliter antikroppslösning till toppen av kolumnen. Justera kolumnen mot den ursprungliga orienteringen och centrifugera kolonnen. Kassera sedan avsaltningskolumnen och blanda det koncentrerade provet noggrant.
Späd provet till en två milligram per milliliter koncentration i 25 mikroliter av ultrarent vatten i en enda brunn av en 96-brunnsplatta och tillsätt fem mikroliter märkningsbuffert och fem mikroliter märkning reagens till brunnen. Efter en 10-minuters inkubering vid rumstemperatur skyddad från ljus, blanda 60 mikroliter av reagens-grade vatten med provet och täck plattan med en platttätning för centrifugeringen. För att förbereda laddningsvariantchipet, ta bort förvaringslösningen och tvätta brunnar en, tre, fyra, sju, åtta och 10 med vatten.
Byt ut vattnet mot pH 7.2-rinnande buffert och tillsätt 750 mikroliter av löpbuffert till buffertröret. Tryck på Lossa plattan på instrumentets användargränssnitt och ta bort tätningen från 96-brunnsplattan. Sätt i plattan och buffertröret i de indikerade fläckarna på GX2 provfacket och tryck på Load Plate.
Placera chipet i spånkammaren, stäng locket till spånkammaren, välj HT proteinladdningsvariantanalys när du uppmanas till detta och klicka på Kör. Rening av det skördade cellodlingsprovet från den automatiserade mikroskalabioreaktorn genom snabb proteinvätskromatografi möjliggör karakterisering av de renade proteinernas kritiska kvalitetsattribut med olika analysmetoder nedströms, vilket påvisades. N- glycan data från kinesiska hamster äggstock-producerade monoklonala antikroppar bearbetas av masspektrometri bör visas liknar dessa representativa kromatogram.
Storlek uteslutningskromatografi multipel vinkel ljusspridning kan användas för att bedöma aggregering profil och molekylvikt av antikroppen. Den lilla mängden prov och aggregeringens betydelse är attribut av kritisk kvalitet för att göra denna teknik till ett mycket värdefullt kompletterande analysverktyg till det automatiserade mikrobioreaktorsystemet. Resultatet av mikro kapillärzonelektrofores är ett elektroferogram och kan användas för att visa laddningsvariantprofilen för en monoklonal antikropp, en unik signatur för det protein som undersöks som är mycket känsligt för det operativa pH-värdet.
Aminosyra konsumtion kan också övervakas för att avgöra om utarmningen orsakar förändringar i kritiska kvalitet attribut av antikroppen. Det är viktigt att säkerställa en korrekt och effektiv rening av den tillverkade produkten, eftersom analysstegen endast kan utföras med ett korrekt renat protein. Produkten kan också utsättas för peptidkartläggning och stabilitetstestning.
Men när proteinet har använts för en karakteriseringsmetod, det vanligtvis inte kan användas för en annan. Dessa tekniker gör det möjligt att analysera produkter som framställts av små volymer, hög genomströmning biobearbetning screening plattformar för att förstå påverkan av biobearbetning parametrar på produktkvalitet. Vissa av dessa tekniker använder koncentrerad perklorsyra, myrsyra, N-dimetylformamid, som alla är farliga och bör hanteras försiktigt medan du bär rätt skyddsutrustning.
Ett detaljerat protokoll för rening och efterföljande analys av en monoklonal antikropp från skördad cell odlings vätska (HCCF) av automatiserade mikrobioreaktorer har beskrivits. Användning av analys för att fastställa kritiska kvalitetsattribut (CQAs) och maximera begränsad provvolym för att extrahera viktig information presenteras också.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved