Name: purification and analytics of a monoclonal antibody from chinese hamster ovary cells using an automated microbioreactor system
Uploaded: 2019-05-01T13:30:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System at JoVE.com

Yazarlar, sağladığı analitik destek için Scott Lute 'a teşekkür etmek istiyor. Kısmi iç finansman ve bu çalışmanın desteği CDER kritik yol programı (CA #1-13) tarafından sağlanmıştır. Bu proje, biyoteknoloji ürünleri ofisi 'nde staj/araştırma katılım programı 'na bir randevu tarafından desteklenmektedir, ABD Gıda ve Ilaç Idaresi, Oak Ridge Enstitüsü tarafından bilim ve eğitim için yönetilen bir ABD enerji ve FDA Bakanlığı arasında arası anlaşması.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).</li><li>New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm">https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm</a> (2015)</li><li>Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+Emergence+of+Therapeutic+Monoclonal+Antibodies.">Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies.</a> Circulation. 127, 2222-2230 (2013).</li><li>Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+clone+selection+using+high-throughput+bioreactors.">Advances in clone selection using high-throughput bioreactors.</a> Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).</li><li>Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+structural+modifications+of+immunoglobulin+G+and+their+effect+on+biological+activity.">Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity.</a> Analytical &amp; Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).</li><li>Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roadmap+for+implementation+of+quality+by+design+(QbD)+for+biotechnology+products.">Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products.</a> Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Council+for+Harminisation+of+Techinical+Requirements+for+Pharmaceuticals+for+Human+Use.">International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use.</a> ICH. , (1999).</li><li>Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+tools+for+characterizing+biopharmaceuticals+and+the+implications+for+biosimilars.">Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).</li><li>Velugula-Yellela, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+high-throughput+automated+microbioreactor+system+for+production+of+model+IgG1+in+CHO+cells.">Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+liquid+chromatography-mass+spectrometry+methods+for+the+comprehensive+characterization+of+therapeutic+glycoproteins,+from+released+glycans+to+intact+protein+level.">Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).</li><li>Yang, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+correlation+between+charge+and+glycosylation+of+IgG1+variants+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).</li><li>Agarabi, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+Process+Parameter+Screening+Utilizing+a+Plackett-Burman+Design+for+a+Model+Monoclonal+Antibody.">Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).</li><li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Exclusion+Chromatography+with+On-Line+Light-Scattering,+Absorbance,+and+Refractive+Index+Detectors+for+Studying+Proteins+and+Their+Interactions.">Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions.</a> Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).</li><li>Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+ranibizumab+(Lucentis)+or+bevacizumab+(Avastin)+with+dexamethasone+and+triamcinolone+acetonide:+An+in+vitro+stability+assessment.">Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).</li><li>Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+high-molecular-weight+nonnative+aggregates+and+aggregation+kinetics+by+size+exclusion+chromatography+with+inline+multi-angle+laser+light+scattering.">Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).</li><li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li><li>Han, H., Livingston, E., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+profiling+of+charge+heterogeneity+in+antibodies+by+microchip+electrophoresis.">High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).</li><li>Wheeler, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip+zone+electrophoresis+for+high-throughput+analysis+of+monoclonal+antibody+charge+variants.">Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).</li><li>Carrillo-Cocom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+consumption+in+naive+and+recombinant+CHO+cell+cultures:+producers+of+a+monoclonal+antibody.">Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).</li><li>Chen, P., Harcum, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+amino+acid+additions+on+ammonium+stressed+CHO+cells.">Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells.</a> Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).</li><li>Xing, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+amino+acid+composition+of+CHO+cell+culture+media+for+a+fusion+protein+production.">Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production.</a> Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+and+glucose+metabolism+in+fed-batch+CHO+cell+culture+affects+antibody+production+and+glycosylation.">Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).</li><li>Read, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentanomics+informed+amino+acid+supplementation+of+an+antibody+producing+mammalian+cell+culture.">Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture.</a> Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).</li><li>Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+A+chromatography+increases+monoclonal+antibody+aggregation+rate+during+subsequent+low+pH+virus+inactivation+hold.">Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold.</a> Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).</li><li>Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+analysis+of+therapeutic+glycoproteins.">Glycan analysis of therapeutic glycoproteins.</a> MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).</li><li>Wahl, O., Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+analysis+for+pharmacopoeial+purposes.">Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes.</a> Talanta. 154, 150-163 (2016).</li><li>Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive+method+for+quantitative+analysis+of+underivatized+amino+acids+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+(LC-MS/MS).">A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).</a> Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).</li></ol>

Bu yayın yazarın görüşlerini yansıtır ve FDA görüşleri veya politikaları temsil etmek için yorumlanmamalıdır.

HCCF kalıntısı ve pahalı enstrümantasyon imha edebilir büyük parçacıklar içerir, böylece kültür açıklama daha fazla aşağı işleme önce gereklidir. Santrifüjleme genellikle hücreleri ve diğer çözünmez parçacıklar filtrasyon tarafından izlenen proteinlerden ayırmak için ilk yaklaşımdır. Bu filtrelenmiş HCCF daha sonra arıtma için hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) tabi tutulur. Ürün elde etmek için otomatik mikrobioreactors HCCF arıtılması aşağı işleme önemli bir adımdır. Burada, proteinli bir FPLC sistemi, HCCF 'den monoklonal antikorlar elde etmek için bir kolon kullanılır. Upstream süreçleri için Analytics, tutarlı ve güvenilir bir ürün elde etmek için yardımcı hücre davranışı ve kılavuz Biyoproses tasarımı konusunda yararlı bilgiler sağlayabilir. Analytics Ayrıca kritik kalite niteliklerini (CQAs) upstream ve downstream süreçlere bağlamamıza olanak tanır. Burada sunulan dört asder yaygın monoklonal antikorların karakterizasyonu kullanılır. Bu teknikler, sadece kısmen arındırılmış ve hala DNA ve HCP kalıntı seviyeleri içeren çeşitli upstream kaynaklardan işlem ve ürün analizi için sağlam, güvenilir ve kolayca dağıtılabilir.
Analizler için numuneleri temizlerken, bioreactor içinde bulunan değişkenliği korurken analiz için yeterince temiz bir örnek oluşturarak önemli bir denge ortaya çıkmış olmalıdır. Ürün etkileyen iki en yaygın kirleticiler DNA ve HCP, 260/280 nm ve SDS-PAGE veya μCE-SDS oranı emilme oranını ölçerek kontrol edilebilir. Burada sunulan çeşitli DNA içeriği düşük seviyelerde duyarlı değildir. Ürünün saflığı >% 95 saf, μCE-SDS tarafından belirlenir.
Mikrokapiller elektroforez sistemi ile şarj varyantı analizi, kullanımı nispeten kolay olan cips ve reaktiflerle şarj çeşitlerini belirlemek için yüksek verimlilik yöntemi sağlar. Tekniklerin doğası ve etiketleme reakajının kimyası hem uyarılıkların hem de diğer primer aminlerin hassasiyetine sahiptir, böylece çoğu örnek matris için tuzsuz bir adım gerektirir. Tecrübeye göre, düşük DNA seviyeleri, etiketleme reaksiyonunda serbest boya ile göç ederek sonuçların kalitesini etkilemez. Temel, ana ve asidik tepe ölçülerinin varyasyon genellikle <% 1 ise, DNA ve diğer kirleticilerin daha yüksek seviyeleri tahlil değişkenlik artırabilir. Protein etiketleme ile tutarlı olmak ve şişeden çıkarıldıktan sonra DMF 'nin istem içinde kullanılması ve boya ile karıştırılması son derece önemlidir. Lizin ve/veya histidin standartları etiketleme kontrolleri olarak tavsiye edilir. Zaman içinde ve numune kalitesine bağlı olarak, cips faul veya mikrofluidics kanalları üzerinde kaplama kaybedebilir, daha fazla gürültü yol, hayalet dorukların varlığı, ve daha fazla örnek-to-Sample varyasyon. Bu oluşum, boşluklar ve sistem uygunluğu standardı (i.e. NISTmAb) tanımlamak için aynı anda düzenli aralıklarla örnekleri ile analiz edildi. Çip sorunları ortaya çıktığında, cips depolama çözeltisi ile yıkanabilir veya değiştirilir.
Terapötik glikoproteinlerin glikan analizi için kullanılan yöntemler, öncelikle sıvı kromatografi (LC) ve/veya kütle spektrometresi (MS) içerir Bu yazıda açıklanan yöntem, faydaları ve dezavantajları olan LC ve MS kullanır. Kütle spektrometrik yöntemleri, floresan algılama çıkışı veya Linde mikrodiziler kullanılarak LC tabanlı yöntemlerle mümkün olmayan, analiz edilen glisilerin kitle doğrulamasının avantajlarından yararlanır. Bu yöntem, bir dekstran merdiven standardına saklama süresi karşılaştırması kullanarak glikcan kimlikleri atamak için LC ve floresan algılaması kullanır. Floresans izleme, algılama kolaylığı nedeniyle daha fazla duyarlılık ve ölçüme olanak sağlar, bu da MS yalnız oligosackaritlerin kötü iyonizasyon verimliliği nedeniyle düşük bolluk türlerinin ölçülmesine mümkün olmayabilir. MS 'den gelen kütle bilgileri, glikcan kimliklerini onaylamak için kullanılır, ancak işleme yazılımı birincil atama kriterleri olarak kütle bilgilerini kullanmaz. Bu nedenle, tekrarlanabilir Kromatografi ve kolayca çözülebilir zirveler olmadan, bu yöntem glikan atamaları ile ilgili muzdarip olabilir. Neyse ki, kütle bilgileri, kromatografi subpar olduğu durumlarda bile glikan atamaları ile yardımcı olabilir, örneğin tekrarlanabilir glikol atamaları engelleyen bekletme süresi vardiya gibi. Bu yöntem MS olmadan kullanılırsa, kitle bilgileri ikamet zamanı sürüklenme için düzeltmek için kullanılamaz olduğundan Kromatografi en üst düzeyde olmalıdır.
Burada açıklanan amino asit analiz yöntemi, ham hücre kültürü medyasında underivatized amino asitler hızlı kantitasyon için LC-MS kullanır. Alternatif amino asit analiz yöntemleri UV algılama etkinleştirmek için amino asit türevlendirme ajanlar gerektirir26. LC-MS yöntemi, LC-UV metodu üzerinde önemli avantajlar sunar: kitle karakterizasyonu eksikliği ile sınırlı olan LC-UV yöntemine karşı hem saklama süresi hem de iyon kütlesine dayalı kimlik tespiti sağlar. LC-UV yöntemi, örnek değişkenliği27' ye verebilir, zaman alan bir derivatizasyon reaksiyonu GEREKTIRDIĞINDEN, LC-MS yöntemi de zaman ve yeniden Üretilebilirlik avantajları sunar. Ancak, LC-MS yönteminde ham hücre kültürü medyası enjeksiyonu, iyon Skimmer kirlenme nedeniyle MS sinyali üzerinde zararlı etkilere neden olabilir. Bir kalibrasyon merdiven genellikle bir sistem uygunluğu kontrol olarak enjekte edilir, ve örnek sipariş verileri önyargı önlemek için randomize.
Mikrobioreactors kullanarak antikor üretimi için hücre kültürü süreci daha önce9açıklanmıştır. Bu çalışmada, sınırlı numune hacimlerinden elde edilen verileri maksimize eden monoklonal antikor karakterizasyon yöntemleri için ayrıntılı protokoller iyi tanımlanır. Hasat edilen hücre kültürü sıvısı sınırlı miktarda bazen elde edilen ürün bilgilerini kısıtlayabilir ve ürün kalitesi verileri elde etmek için doğru analitik prosedürler seçimi esastır. Analytics, ürün kalitesindeki değişikliklere kadar upstream işlem parametrelerini birbirine bağlamak için önemlidir. Burada, kullanıcılar için mikrobioreactors ile çalışırken mAbs karakterlendirmek için bir kılavuz sağlanmıştır.

Protein terapisleri, doku nakli komplikasyonları, otoimmün bozukluklar ve kanserler dahil olmak üzere büyüyen çeşitli tıbbi koşulları tedavi etmek için kullanılmaktadır1. 2004 yılından bu yana, Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve Ilaç Idaresi (USFDA)% 25 üzerinde BLAs muhasebe ile, Ilaç değerlendirme ve Araştırma Merkezi (CDER) tarafından düzenlenmiş tüm onayların biyolojik lisans uygulamalarının (BLAs) artan bir oranını belgeledi 2014 ve 20152.
Bu genişleyen pazar göz önüne alındığında, biyofarmasötik üreticileri hızlı bir şekilde tutarlı kalitede daha fazla ürün teslim ile meydan. En önemli gelişmeler medya/yem stratejisi optimizasyonu ve hücre kültürü çevre kontrolleri1 gelişmeler nedeniyle olsa da, ürün VERIMI artırmak için çabaları Cho hücre mühendisliği ve üretim hattı taraması üzerinde duruldu 3 ' ü , 4 , 5 üretim sürecinde.
MAbs biyolojik bir sistemde üretildiğimden, içsel protein değişkenliği olabilir. Antikor kompozisyon sonrası translationally değiştirilebilir, glikosylation gibi veya bozulma veya enzimatik reaksiyonlar ile etkilenir. Bu yapısal varyasyonlar tehlikeli bağışıklık reaksiyonları provoke veya antikor bağlama değiştirebilir, hangi sırayla azaltabilir veya amaçlanan terapötik fonksiyon ortadan kaldırmak5. Böylece, monoklonal antikorların kritik kalite nitelikleri (CQAs)-N-glycan profili, şarj varyant dağılımı, ve monomerik formda antikor yüzdesi-düzenli olarak izlenen ve kontrollü bir parçası olarak kalite tasarım (QbD) yaklaşımı sırasında üretim süreçleri1,6. Düzenlenmiş bir üretim ortamında, terapötik proteinler onaylı bir ticari ilaç ürünü olarak lisanslanacak kabul kriterlerini karşılaması gerekir7. Burada sunulan yöntemler genellikle bir antikor için kalite karakterizasyonu sürecinin bir parçası olacak7,8, ve herhangi bir protein bilimcisi kullanımı aşina olacaktır.
Önceki çalışma9' da, mikrobiyoreaktörlerin üst düzey biyoişlemede hücre kültürü koşullarının yüksek verim taraması için uygulanması ve çalışması açıklanmıştır. Değişen medya koşullarından elde edilen arıtılmış ürün, LC-MS kullanarak N-glycan analizine tabi tutulur. terapötik proteinlerin Glikosylation desenleri tespit edilebilir ve LC-MS teknikleri10,11kullanılarak karakterize ve çeşitli glikcan türlerinin varlığı yem stratejisi, pH ve sıcaklık12gibi Biyoproses parametreleriyle bağlantılıdır. Monomerik formda elde edilen IgG yüzdesi ile belirtilen ürün kalitesinde değişen medya koşullarının etkisi de boyut dışlama kromatografi ile değerlendirilir-çok açılı ışık saçılma (SEC-oralar)13,14 , 15. şarj varyantı profili, bir ürünün fonksiyonunu etkileyebilecek bir dizi değişikliği16 temsil eder. Mikrokapiller bölgesi Elektroforez (mCZE), geleneksel KIF değişimi (CEX) Kromatografi ve kapiller izoelektrik odaklama (Cıef) metotları ile karşılaştırıldığında, şarj varyantı analizi için kullanılan çok daha hızlı bir analiz süresi sunan bir tekniktir17 ,18. Harcanan biyoreaktör medya protein üretimi sırasında amino asit tüketimini izlemek için analiz edildi olarak antikor 's tanımlama nitelikleri değişiklikleri ilgilidir19,20,21,22 , 23 yaşında.
Protein analizleri, işlem girişleri ve CQAs 'daki değişiklikler arasındaki ilişkilere dayanan kritik işlem parametrelerini (TBM 'Ler) tanımlamamıza izin verir. Biyoproses gelişimi sırasında TBM 'lerin belirlenmesi ve ölçümü temelde proses kontrolünü gösterir ve ürünün değişmemesini sağlar, bu da son derece düzenlenmiş üretim ortamlarında önemlidir. Bu yazıda, ürün CQAs (N-glycan profili, şarj türevleri ve boyut homojenliği) için en uygun protein biyokimyasal özelliklerinin bazılarını ölçmek için analitik teknikler sunulmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:373px;">CHO DG44 Cell Line</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">A1100001</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Akta Avant 25</td>
			<td>General Electric Life Sciences</td>
			<td>28930842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>115115830</td>
			<td>Purification Stationary Phase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:373px;">Omnifit 10cm Column</td>
			<td style="width:191px;">Diba Fluid Intelligence</td>
			<td>006EZ-06-10-AA</td>
			<td style="width:177px;">Housing for Stationary Phase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18-1113-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#181;Dawn Multi Angle Light Scattering Detector</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td>WUDAWN-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.22 &#181;m Millex GV Filter Unit PVDF Membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12 mL Syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881512878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity DAD&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Sampler</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Thermostat</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 uL Glass Inserts with Polymer Feet&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 mL Falcon tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-Well Plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>127737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BPA996-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACQUITY I-Class UPLC BSM</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>18601504612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186015000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ACQUITY UPLC FLR Detector</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176015029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC810096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Amino Acid Standard, 1 nmol/&#181;L&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5061-3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amino Acid Supplement</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5062-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blue Screw Caps with Septa</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD OptiCHO AGT Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1122205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Charge Variant Chip</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>760435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Charge Variant Reagent Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS760670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Chromatography Water (MS Grade)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethylformamide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176003712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Buffer Tubes</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>697075- NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Detection Window Cleaning Cloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21912-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII HT Touch</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS138160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Ladder Tubes</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>C-3258-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GXII Lint-Free Swab</td>
			<td>ITW Texwipe</td>
			<td>TX758B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Intact mAb Mass Check Standard</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm</td>
			<td>Imtakt</td>
			<td>WAA25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>840274100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td>WTREX-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Perchloric acid</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1034-960-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screw Top Clear Vial 2mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>383112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L</td>
			<td>Tosoh Biosciences</td>
			<td>003449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UNIFI Scientific Information System</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667005138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuum Manifold Shims</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuum Pump</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xevo G2 Q-ToF</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186005597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89883</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and analytics of a monoclonal antibody from chinese hamster ovary cells using an automated microbioreactor system

Monoklonal antikorlar (mAbs) bugün üretilen en popüler ve iyi karakterize biyolojik ürünlerden biridir. En yaygın Çince hamster yumurtlık (Cho) hücreleri kullanarak üretilen, kültür ve süreç koşulları antikor yazılar maksimize etmek ve hedef kalite profilleri elde etmek için optimize edilmelidir. Genellikle, bu iyileştirme otomatik mikroölçek Biyoreaktörler (15 ml) paralel olarak birden çok işlem koşullarını ekrana kullanır. Optimizasyon kriterleri arasında kültür performansı ve monoklonal antikor (mAb) ürününün kritik kalite nitelikleri (CQAs) bulunmaktadır ve bu da etkinliğini ve güvenliğini etkileyebilir. Kültür performans ölçümleri, hücre büyümesi ve besin tüketimini içerir, ancak CQAs mAb 'nin N-glycosylation ve toplama profilleri, şarj türevleri ve moleküler ağırlığı içerir. Bu ayrıntılı protokol, değerli performans ölçümleri ve çıkışları elde etmek için otomatik bir mikrobiyoreactor sistemi tarafından üretilen HCCF örneklerinin nasıl arındırılacağını ve daha sonra çözümleneceğini açıklar. İlk olarak, otomatik protein A hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) yöntemi hasat hücre kültürü örneklerinden mAb arındırmak için kullanılır. Konsantre olduktan sonra, glikan profilleri belirli bir platform kullanılarak kütle spektrometresi tarafından analiz edilir ( malzeme tablosunabakın). Antikor molekül ağırlıkları ve toplama profilleri boyut dışlama Kromatografi kullanılarak belirlenir-çoklu açı ışık saçılma (SEC-aküler), şarj türevleri mikroçip kapiller bölgesi Elektroforez (mCZE) kullanılarak analiz edilirken. Biyoreactor sürecinde yakalanan kültür performans ölçümleri ek olarak (yani, kültür viability, hücre sayıları, ve glutamin dahil olmak üzere ortak metabolitleri, glikoz, lakdamak, ve amonyak), harcanan medya için besin sınırlayıcı belirlemek için analiz edilir besleme stratejileri ve genel proses tasarımını geliştirin. Bu nedenle, harcanan medyanın sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile amino asitlerin mutlak ölçülmesini ayrıntılı bir protokol de açıklanmıştır. Bu protokolde kullanılan yöntemler, çok sayıda küçük hacimli numuneler için uyumlu olan yüksek verimlilik platformlarından yararlanır.

Otomatik mikroölçekli biyoreaktör hasat hücre kültürü sıvı hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) kullanılarak saflaştırılır, Şekil 1 ' de görüldüğü gibi ve arıtılmış proteinler ' kritik kalite nitelikleri (cqas) çeşitli ile karakterize edildi akış analitik yöntemleri. Bu, otomatik mikrobiyoreactor sisteminin önemli bir yararı; CQAs 'daki farklılıklar çok çeşitli koşullarda hızla değerlendirilebilir. Mass spektrometrisi tarafından işlenen CHO-üretilen mAbs 'den N-glycan verileri Şekil 2' de gösterilen Kromatogramlar gibi görünmelidir. Şekil, bir örnekteki mannoz 5 zirvesinde (M5) önemli ölçüde daha düşük olduğunu gösteren iki kromatogram arasında bir karşılaştırma gösteriyor. Zirveler yerine sadece gürültülü bir taban çizgisi gözlenirse, bu Kromatografi kurulumunun hatalı olduğu veya prosedürün başarılı olmadığı anlamına gelebilir. Denetimleri kullanarak, sorun giderme basitleştirilebilir. İlk olarak, dekstran merdiveninden FLR doruklarını değerlendirmek; Bu zirveler Kromatografi sisteminin düzgün çalıştığını gösterir. Daha sonra, işlenmiş bozulmamış mAb standardından elde edilen deneysel olarak elde edilen zirveleri karşılaştırın. Standart zirveleri görünüyorsa, ancak hiçbir örnek zirveler tanımlanır, sonra mAb örnekleri doğru işlenmedi. Bu, N-glycan etiketleme ve arıtma ile müdahale edilen tamponda SDS veya nükledil varlığı nedeniyle olabilir.
SEC-, iki CQAs değerlendirmek için kullanılabilir: toplama profili ve antikor molekül ağırlığı. Bir temsilci SEC-, kromatogram Şekil 3' te gösterilen karşılaştırılabilir. Moleküler kütle dağılımı ve mutlak moleküler ağırlık, 1,37 mL * (mg * cm)-1 ve 0,185 ml/g DN/DC 'nin yok olma katsayısı ile gerekli yazılım kullanılarak belirlendi. En yüksek arama ve yazılımın temel ayarı manuel olarak gerçekleştirildiği için, sonuçlar kullanıcıdan kullanıcıya biraz farklılık gösterebilir. Monomerik IgG1 mutlak molekül ağırlığı Şekil 3 ' te 1,504 x 105 da ± 0,38% (mavi) ve yüksek sipariş kompleksi 7,799 x 105 da ±% 3,0 (kırmızı) ' dir. Toplamları polydispersity çok monomer daha büyüktür, kırmızı molar kitle dağılımı ile belirtildiği gibi Peak 1 (Şekil 3). Küçük miktarda örnek ve bir CQA olarak toplama önemi bu tekniği otomatik mikrobioreactor sistemi için son derece değerli bir tamamlayıcı analitik aracı yapmak.
MCZE 'nin sonucu, monoklonal bir antikor için şarj varyantı profilini gösteren Şekil 4' te olduğu gibi bir elektropherogram. Profil, araştırılan protein için benzersiz bir imzaya sahiptir ve işletim pH 'Sında son derece duyarlıdır. Ayrıca görünür, şarj varyantı profilinin solundaki serbest boya tepe şeklindedir. Bir işletim pH 'Sı kurarken, çözünürlüğü ve sinyali dengelemek için operatörün bazı takdiri vardır; Ayrıca, operatör ~ 30 s 'de göç eden serbest boya zirvesinde iyi bir ayırma sağlamalıdır. Bu tepe kaldırmak için etiketleme sonra örnek tuzlanmış olabilir, bu sinyal önemli bir kayıp yol açar olsa. Bir işletim pH 'Sı kurulduktan sonra, örnek profiller karşılaştırılabilir. Genellikle tutarlı olmakla birlikte, etiketleme verimliliği veya uyarıcılarında farklılıklar değişiklikler bir örnek göç küçük farklılıklar ve şarj varyant profil elektrophergramlar doğrudan karşılaştırmak zor hale neden olabilir. Bunun yerine, karşılaştırma yöntemi genellikle temel, ana ve asidik türlerin yüzdeleri dayanmaktadır. Bu durumda,% 1-2 gibi küçük göreli farklar mCZE kullanılarak tanımlanabilir.
Amino asit tüketimi, tükenmesi CQAs değişiklikleri neden olup olmadığını belirlemek için izlenebilir. Kütle spektrometresi gelen kromatogram okumaları, ham biyoreaktör medya örneklerinde amino asitlerin mutlak ölçümü için bir kalibrasyon eğrisinin başarılı bir şekilde oluşturulmasını değerlendirmek için kullanılabilir. Şekil 5 , bu süreçte iki toplam iyon KROMATOGRAM (TIC) ve bir ayıklanan iyon kromatogrâsini (XIC) temsili sonuçlar olarak gösterir. Şekil 5a'da gösterilen TIC, tampon sistemden gelen arka plan sinyalini sadece bir su boşluğa enjekte edildiği gibi tasvir ediyor. Şekil 5 B bir temsılcı TIC amino asit standardı tasvir nerede, su boş karşılaştırıldığında, bireysel amino asit türlerine karşılık küçük doruklarda görülebilir (gibi lizin gibi 7,96 dakika). Zirvede entegre olmak ve zirve alanının (ve bu nedenle konsantrasyon) miktarını kolaylaştırmak için, XıC yalnızca tanımlanmış bir "kromatogram kitle penceresinden" gelen sinyalin görüntülendiği yerde kullanılır. Cihazın hassasiyetine ve kromatografik ayrımı kalitesine bağlı olarak, optimum kütle penceresinin Kullanıcı tarafından belirlenmesi gerekir. Bu örnekte (Şekil 5C), lizin Xic (m/z = 147,1144) bir kütle penceresi 10 ppm ile gösterilir, amino asit standardında lizin sütun 8,03 dakikada kapalı elutes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig1.jpg"> Şekil 1 . Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) tekniğini kullanarak arıtma planının temsili kromatogram. Hacim (mL) ile ilgili arıtma yöntemi aşamaları x ekseni boyunca etiketlenir. 280 nm 'de UV emici (mAU y ekseni, Solid Line) Arıtma döngüsü boyunca izlenir. Yüksek tuz yıkama sırasında iletkenlik (mS/cm y ekseni, kesikli çizgi) artırarak özellikle bağlı olmayan kirleri yerlerinden edilir. antikor proteinden elüsyon tampon (CONC B, noktalı çizgi), pH 4 ' e düştüğünde ( gösterilir). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig2.jpg"> Şekil 2. Kitle tarafından doğrulanmış etiketli glikan elde edilen bir temsili floresan kromatogram. Y ekseni sinyal yoğunluğu iken x ekseni bekletme süresi (dakika) ' dir. 14,94 min 'de tepe, M5 sinyal gücü arasındaki büyük farkın overlaid edilen iki numune arasında gözleneceği Mannose 5 (M5) glycan 'ı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig3.jpg"> Şekil 3. IgG1 monoklonal antikor moleküler ağırlık dağılımı. 1x PBS 'de boyut dışlama kromatografi ile ayrılan, bozulmamış IgG1 monoklonal antikor kromatogram (pH 7.4). Emici, 280 Nm (siyah; sol eksen) ve hafif saçılma ve Refraktif indeksler ile izlenir ve her bir zirvede (kırmızı ve mavi; sağ eksen) mutlak moleküler ağırlığı hesaplamak için kullanılır. Yüksek moleküler ağırlık türleri "HMW" etiketli zirve ile belirtilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig4.jpg"> Şekil 4 . IgG1 monoklonal antikor şarj varyant profili. Bu elektropherogram mCZE platformunda oluşturulur. Bir serbest boya pik ~ 30 s içinde göç ve iyi IgG1 ayrılır. Ölçme için, zirveler enstrüman veri analiz yazılımı kullanarak temel, ana ve asidik türler bölünmüştür. Kırmızı çizgi, entegre tepe alanlarını özetliyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig5.jpg"> Şekil 5. Ham biyoreaktör medyanın Kütle Spektrometrisi bazlı amino asit analizi için iyon kromatogrametinin temsili sonuçları. X ekseni saat (dakika) ise y ekseni sinyal yoğunluğuyla (a) bir su boşluğu negatif kontrol olarak hizmet verir ve sıvı kromatografi gradyan (B) 225 pmol/μL amino asidin boyunca gözlenen arka plan sinyalini ortaya çıkarır Standart olarak burada pozitif bir kontrol olarak kullanılır, bu toplam iyon kromatogram gözlenen bireysel doruklarda standart karışımı farklı amino asitler temsil edilir kromatografide çözülür (C) m için bir temsilci ayıklanan iyon kromatogram /z 147,1144, Lysine olan. B 7,96 min zirve Lysine C 8,03 tepe karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System at JoVE.com

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Otomatik microbioreactors hasat hücre kültürü sıvı (HCCF) bir monoklonal antikor arıtma ve sonraki analizi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Kritik kalite niteliklerini (CQAs) belirlemek ve önemli bilgileri ayıklamak için sınırlı numune hacmini maksimize etmek için analitiklerin kullanılması da sunulmaktadır.

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Bu protokol, mikrobiyoreaktörlerden elde edilen sınırlı numunelerin analizini ele alarak ürünlerin kritik kalite özellikleri hakkında hayati bilgiler edinimi ele almıştır. Bu tekniklerin bir diğer avantajı da, üretilen ürünün kalite parametrelerini belirleyen temel öznitelikleri belirlemek için en az analiz süreleri kullanmalarıdır. Gösteri prosedürü David Powers, Talia Faison ve Phillip Angart olacak.Arıtma sistemine bağlı yazılım açarak ve saflaştırılmış antikor eluate ve 50 mililitre konik tüpler fraksiyon toplayıcı içine yüksek tuz yıkama sırasında akış toplamak için toplamak için 15 mililitre konik tüpler yerleştirerek başlayın. Daha sonra, 0.22 mikrometre gözenek filtrelenmiş hücre kültür sıvısı kapaklı bir meme ile boş bir 12 mililitreşlik şırınga ekleyin. Kapağı çıkardıktan sonra, şırınga nozülünü arıtma sisteminin manuel enjeksiyon noktasına takın.Şırıngayı yerinde sıkmak için bükün ve numunenin tüm hacmi enjekte edilene ve ekli 10 mililitrelik büyük hacimli numune döngüsünde görünene kadar pistonu bastırın. Kaydedilen yöntemi seçin ve enstrüman yazılımı tarafından istendiğinde Çalıştır'ı tıklatın. Tüm antikor atlatıldığında, saflaştırılmış proteini bir azı tris tabanı yla hemen nötralize ederek yaklaşık 5,5 pH'ya indirin.Arınmış antikorsantrikasyon ile konsantre etmek için, filtrasyon toplama tüpleri içine 100 kilodalton filtreler yerleştirin. Filtreleri 500 mikrolitre çift distile su ile yıkayın, sonra santrifüj. Filtreyıkamayı iki kez tekrarlayın.İkinci yıkamadan sonra, filtrasyon atın ve yeni santrifüj tüpleriçin durulanmış filtreler aktarın. Ardından, santrifüj için her filtreye 500 mikrolitre numune ekleyin. Döndürmenin sonunda, son bir santrifüj le konsantre numuneyi elde etmek için filtreyi yeni bir toplama tüpüne ters çevirin.N-glikan etiketleme ve izolasyon için, her konsantre antikor örneğinin 7,5 mikrolitre seyreltin. 15.3 mikrolitre sıvı kromatografi kütle spektrometresi veya lCMS dereceli su ile bir mililitretüpler kit, ve dennature antikorlar ile bir enzim dostu ve kütle spektrometresi dostu yüzey aktif üç dakika için 90 santigrat derece bir enzim dostu ve kütle spektrometresi dostu bir% 5 çözeltisi altı mikrolitre ile antikorlar. Denatürasyon sonunda, 50 santigrat derecede beş dakikalık bir kuluçka için peptid N-glikosidaz F 1.2 mikrolitre eklemeden önce üç dakika oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.Numuneleri oda sıcaklığına kadar üç dakika soğuttuktan sonra, numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca susuz dimetilformamid içinde çözünmüş 12 mikrolitre floresan etiketleme reaktifi ile etiketleyin. Kuluçka sonunda, etiketli N-glikan karışımını 358 mikrolitre asetonitil ile seyreltin ve bir hidrofilik etkileşim kromatografi plakasını şimler ve atık tepsisi ile bir vakum manifolduna yerleştirin. Sıvının hidrofilik etkileşim kromatografi rekarnesinin geçmesi 15 ila 30 saniye sürer emin olmak için vakum 10 ila 15 kilopascals ayarlanmış vakum ile 200 mikrolitre su ile kuyular koşul.Her bir kuyuya her bir glikan karışımının 400 mikrolitresini yüklemeden önce 15 ila 30 saniye boyunca %85 asetonitile 200 mikrolitre ile kuyuları dengeleyin ve her yeni sıvı eklendikten sonra vakum uyguluyor. Tüm numuneler eklendiğinde, reçineyi 600 mikrolitre 1%formik asit ve yıkama başına %90 asetonitit ile iki kez yıkayın ve atık tepsisini 600 mikrolitrelik toplama tüpleri ile değiştirin. Daha sonra üç adet 30 mikrolitrelik spektrometre elüsyonu tamponu ile etiketlenmiş N-glikanlardan elude ve havuz seyreltmelerini 310 mikrolitre dimetilformamid ile seyreltin.Bir floresan dedektörü ve uçuş kütlesi spektrometre dört zaman birleştiğinde bir ultraperformance sıvı kromatografi sistemi üzerinde etiketli N-glisan elution örnekleri analiz etmek için, mobil aşamaları için 50 milimolar amonyum formatı ve% 100 LCMS dereceatontrile kullanın. Başlangıç akış hızını dakikada 0,4 mililitreye ayarlayın ve LC gradyanı elüsyon aşamasında artan amonyum formatı sağlar. Floresan dedektörünü 265 nanometre uyarma ve iki hertz örnekleme hızıile 425 nanometre lik bir emisyon ölçmek için ayarlayın.100-2, 000 Dalton arasında bir kütle aralığı, 0,25 saniyelik bir tetkik süresi ve sürekli veri toplama ile MS1-pozitif iyon duyarlılık moduna dört kez uçuş süresini ayarlayın. Ardından örnekleri 10 santigrat dereceye ayarlanmış otomatik numune ye yükleyin ve yüklenen yöntemi çalıştırın. Şarj varyant analizi için bir numuneyi tuzdan arındırmak için, 0,5 mililitrelik tuzsuzlama sütununun alt stoperini koparın, üst stopergevşetin ve tuzsuzlama sütununu 1,7 mililitrelik centrifuge tüpüne yerleştirin.Yeni kolonu yeni bir mikrosentrifüj tüpüne aktarın ve sütunun üst kısmına mililitre antikor çözeltisi başına 3,5 miligramlık 80 mikrolitre ekleyin. Sütunu özgün yönlendirmeye hizalayın ve sütunu santrifüj edin. Daha sonra tuzsuzma sütununa atın ve konsantre numuneyi iyice karıştırın.Numuneyi 96 kuyulu bir plakanın tek bir kuyusunda 25 mikrolitre ultrasaf suda mililitre başına iki miligram konsantrasyona seyreltin ve kuyuya beş mikrolitre etiketleme tamponu ve beş mikrolitre etiketleme reaktifi ekleyin. Işıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçkadan sonra, 60 mikrolitre reaktif dereceli suyu numuneyle karıştırın ve plakayı santrifüj için bir plaka mührü ile kaplayın. Şarj varyant yongasını hazırlamak için depolama çözümünü çıkarın ve 1, üç, dört, yedi, sekiz ve 10 numaralı kuyuları suyla yıkayın.Suyu pH 7.2 çalışan tampon ile değiştirin ve tampon tüpüne 750 mikrolitre çalışan tampon ekleyin. Cihaz kullanıcı arabirimindeki Plakayı Boşalt'a basın ve mührü 96 kuyuluk plakadan çıkarın. Plakayı ve tampon tüpü GX2 numune tepsisindeki belirtilen noktalara takın ve Yük Plakası'na basın.Çipi talaş odasına yerleştirin, kapağı talaş odasına kapatın, istendiğinde HT protein şarj ı varyant tonu'nu seçin ve Çalıştır'ı tıklatın. Hasat edilen hücre kültürü örneğinin otomatik mikro ölçekli biyoreaktörden hızlı protein sıvı kromatografisi ile saflaştırılması, saflaştırılmış proteinlerin kritik kalite niteliklerinin çeşitli aşağı analitik yöntemlerle karakterizasyonuna olanak sağlar. Kitle spektrometresi ile işlenen Çin hamster yumurtalık üretilen monoklonal antikorlar N-glikan verileri bu temsili kromatogramlar benzer görünmelidir.Antikorların toplama profilini ve molekül ağırlığını değerlendirmek için boyut dışlama kromatografisi çoklu açı ışık saçılımı kullanılabilir. Numunenin küçük miktarı ve agregasyonun önemi, bu tekniği otomatik mikrobiyoreaktör sistemi için son derece değerli bir tamamlayıcı analitik araç haline getirmek için kritik kalite özellikleridir. Mikro kapiller zon elektroforez sonucu bir elektroferogram ve bir monoklonal antikor için şarj varyant profili göstermek için kullanılabilir, faaliyet pH son derece duyarlı olan incelenen protein için benzersiz bir imza.Amino asit tüketimi de tükenmesi antikor kritik kalite özellikleri değişikliklere neden olup olmadığını belirlemek için izlenebilir. Analitik adımlar sadece düzgün saflaştırılmış bir protein ile gerçekleştirilebilir gibi, üretilen ürünün düzgün ve verimli bir saflaştırma sağlamak için önemlidir. Ürün ayrıca peptit haritalama ve stabilite testine tabi tutulabilir.Ama bir kez protein bir karakterizasyon yöntemi için kullanılan, genellikle başka bir için kullanılamaz. Bu teknikler, biyoişleme parametrelerinin ürün kalitesi üzerindeki etkisini anlamak için küçük hacimli, yüksek üretim biyoişleme tarama platformlarından üretilen ürünlerin analizini sağlar. Bu tekniklerden bazıları konsantre perklorik asit, formik asit, N-dimethylformamide, hepsi tehlikelidir ve uygun koruyucu ekipman giyerken dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Akustik Membran mikropartikül Teknoloji Geliştirme Özel Çin Hamsteri Yumurtalık-host Hücre Proteini Tahliller

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Otomatik slayt tarama ve segmentasyon Fluorescently etiketli dokularda Widefield yüksek-içeriği analiz sistemi kullanılarak

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Çin Hamster Yumurtalık Hücre Yetiştiriciliğinde Yüksek İş-İş BulaMetli Otomatik Mikro-Biyoreaktörler Kullanılarak Proses Optimizasyonu

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...