Name: using the protozoan paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infections in zebrafish larvae
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae at JoVE.com

نود أن نشكر أعضاء الفريق كراتشلير لقراءة نقدية وتعليقات على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل على جائزة "نجم نظم حزب التحرير"، في بسرك، والمعاهد الوطنية للصحة (R01AI132354).

الزرد الرعاية والتربية والتجارب الموضحة هنا هي وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وأقرتها "لجنة رعاية الحيوان المؤسسية" من مركز العلوم الصحية في جامعة تكساس، البروتوكول رقم في الائتلاف المناهض للحرب-16-0127.
1-النمو والحفاظ على باراميسيا
<ol><li>الحصول على الثقافات الحية باراميسيا من مصادر مثل مركز الموارد الدولية الزرد (زيرك).</li>
	<li>من ثقافة حية متنامية، أضف 1 مل ثقافة باراميسيا، 1 مل ثقافة MG1655 كولاي (الكثافة البصرية OD600 1.0 – 2.0) حراكه في 1 x E3 (0.29 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 13 مغ/لتر بوكل، 44 مغ/لتر كاكل2, 81 مغ/لتر مجسو4 ، 0.48 غرام/لتر حبيس، درجة الحموضة 7.0، عقيمة)، و 8 مل 1 x E3 في قارورة زراعة الأنسجة 10 مل. دوامة طفيفة ومن ثم تخزين عند 22 درجة مئوية.</li>
	<li>للحفاظ على ثقافة، كل أسبوعين، ممر 1 مل ثقافة باراميسيا في قارورة زراعة الأنسجة 10 مل مع 9 مل من الطازجة المتوسطة x E3 1 التي تحتوي على 108 زيمبابوي/مل MG1655 كولاي حراكه في 1 x E3.</li>
</ol>2-تحديد الجرعة البكتيرية التي تديرها إلى الزرد
<ol><li>
تحديد العمر النصفي البكتيرية داخل براميسيوم ملاحظة: أن نصف العمر للبكتيريا داخل باراميسيا يتحدد بطلاء المستردة صالحاً كولاي من براميسيوم، كما هو موضح أدناه.<ol>
<li>عقب ح 2 حضانة البكتيريا (OD600 1.0) مع باراميسيا عند 22 درجة مئوية، الجمع بين باراميسيا وثقافة المشارك البكتيرية في أنبوب 50 مل مخروطية، أغسل باراميسيا مع 1 x E3، والعد عدد باراميسيا في المليلتر (كما هو موضح أدناه في الخطوات 3.2.7 و 3.2.8).</li>
		<li>وبعد إحصاء عدد باراميسيا، إزالة 50 ميليلتر باراميسيا وثقافة المشارك البكتيرية كل ساعة (على ح 6 بعد التعرض) وإضافة كل عينة في أنبوب جديد 1.5 مل.</li>
		<li>950 مكان ميليلتر من السطح النطاق 1% (انظر الجدول للمواد) مخزنة في الفوسفات المحلول الملحي (PBS) في كل من أنابيب 1.5 مل ودوامه لمدة 1 دقيقة في باراميسيا. 01:10 إجراء تخفيف لكل عينة باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة كمخفف (أي 100 ميليلتر في ميليلتر 900).</li>
		<li>لوحة 100 ميليلتر من كل تمييع على لوحات الانتقائي (tet رطل متوسطة: تريبتوني 1 غرام/لتر، واستخراج الخميرة 0.5 غرام/لتر، 1 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 30 ميكروغرام/مل التتراسيكلين) واحتضان في 37 درجة مئوية ح 16. عد في اليوم التالي، وسجل العدد المستعمرات البكتيرية على اللوحة (وحدات تشكيل مستعمرة، كفوس) عن طريق العد فقط مستعمرات فردية منعزلة ومتميزة. تحديد لوحة مع إضعاف الذي يعطي زيمبابوي 30 – 300.</li>
		<li>تحديد إضعاف عامل المستخدم. على سبيل المثال، إذا كان 1 ميليلتر من ثقافة البكتيرية مختلطة مع مل 99 من برنامج تلفزيوني العقيمة، هذا إضعاف 1: 100 (0.01). سوف يكون هذا الرقم عدد زيمبابوي في التخفيف. تنفيذ الحساب أدناه، لكل نقطة الوقت، لتحديد زيمبابوي في العينة الأصلية: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq1.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
		<li>حساب والرسم البياني عدد مجدية كولاي/براميسيوم المقابلة للساعات بعد التعرض باستخدام تركيز باراميسيا المحسوبة في الخطوة 3.3.1 وتحديد فترة نصف العمر داخل باراميسيا (الشكل 1).</li>
		<li>في زيمبابوي باستخدام رقم حسابها لكل نقطة الوقت، حساب والرسم البياني عدد مجدية كولاي كل براميسيوم على المحور الصادي مقابل الحضانة بعد ساعات على المحور س، استخدام تركيز باراميسيا المحسوبة في الخطوة 3.3.1. تحديد فترة نصف العمر داخل باراميسيا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تحديد معدل الجرعات من نصف الحياة الجرثومية البكتيرية وتنهب. ملاحظة: لتحديد الجرعة البكتيرية، فترة نصف العمر للبكتيريا داخل باراميسيا ومعدل الزرد على باراميسيا الضحية (راجع الخطوة 3، 4) يجب أن تؤخذ في الاعتبار.<ol>
<li>استخدم الصيغة التالية لتحديد البكتيرية الاضمحلال داخل باراميسيا: (1)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> حيث ن0 هي الكمية الأولية للبكتيريا الواحدة باراميسيا بعد الاحتضان ح 2، Nt هي الكمية المتبقية بعد الزمن t، τ أن الوقت قد حان بعد الذي انخفض إلى النصف العدد من البكتيريا قادرة على البقاء، و k هو ثابت الانحلال.</li>
		<li>من التجربة التدهور، تحديد k ثابت الانحلال استخدام نصف البكتيرية (أي الوقت انخفض إلى النصف بعد ذلك المبلغ من البكتيريا قادرة على البقاء/براميسيوم). (2)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq3.jpg" style="opacity: 0.9;"> لتحديد فترة نصف العمر، المصطلح <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq4.jpg" style="opacity: 0.9;"> و (3) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"> أو (4)<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq6.jpg" style="opacity: 0.9;"> ملاحظة: استناداً إلى الشكل 1، نصف عمر كولاي في باراميسيا حوالي 2.3 ح. وهكذا، باستخدام الصيغة (4)، ومعدل الانحلال، ك، كولاي : (5)<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq7.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
		<li>تحديد معدل الانحلال (k) من تجربة نصف العمر للعثور على جرعة البكتيريا قادرة على البقاء (Nt) تناول اليرقات الزرد بعد وقت الضحية (t)، حيث (P) هو معدل الضحية أو عدد باراميسيا تآكلها الأسماك واحدة كل ساعة: (6) <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq8.jpg" style="opacity: 0.9;"> أو (7)<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq9.jpg" style="opacity: 0.9;"> ملاحظة: في الشكل 1، هو الكمية الأولية للبكتيريا الواحدة باراميسيا (N0) بعد حضانة ح 2 (t) 790 زيمبابوي. كل فيلم 1 و الشكل 2، هو معدل الضحية (ع) 1539.</li>
		<li>باستخدام هذه القيم لتكون بديلاً في المعادلة (7)، وحساب الجرعة البكتيرية يستهلكها الزرد بعد حضانة ح 2 ك: (8)<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq10.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-المركبات التي تنقلها الأغذية عدوى الزرد
<ol><li>احتضان البكتيريا مع باراميسيا.
	<ol>
<li>إعداد ثقافة المشارك باراميسيا و MG1655 كولاي الليل قبل الإصابة. الجمع بين 8 مل الإعلام E3، 1 مل ثقافة باراميسيا الجارية، ومل 1 ثقافة MG1655 كولاي (OD600 = 1.0) حراكه في 1 x E3 في قوارير زراعة الأنسجة T25. احتضان قوارير في درجة حرارة الغرفة (RT) بين عشية وضحاها. لكل شرط المعاملة، إعداد قوارير اثنين من باراميسيا.</li>
		<li>تلقيح وسائط النمو البكتيرية (رطل: تريبتوني 1 غرام/لتر، استخراج الخميرة 0.5 غرام/لتر، 1 غرام/لتر كلوريد الصوديوم) مع العدوى بسلالة من البكتيريا، بانتقاء مستعمرة بكتيرية فردية من لوحة استخدام حلقة تطعيم عقيمة. احتضان ثقافة السائل عند 37 درجة مئوية وترك المصافحة في تناوب 110 في الدقيقة (لفة في الدقيقة) بين عشية وضحاها. ملاحظة: معدات الحماية الشخصية (معطف مختبر وقفازات) ينبغي أن ترتديه ومرافق المستوى 2 السلامة الأحيائية ينبغي أن تستخدم عند التعامل مع العوامل المعدية.</li>
		<li>في اليوم التالي، قياس OD600 الثقافة بين عشية وضحاها. حساب حجم الثقافة المطلوبة لتحقيق OD600 1 عند حراكه في 11 مل من وسائل الإعلام.</li>
		<li>حصاد حجم البكتيريا من الخطوة 3.1.2 عن طريق الطرد المركزي مبلغ 000 6 × ز لمدة 5 دقائق، وحجم واحد لكل قارورة من باراميسيا. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه البكتيرية في 1 مل الإعلام E3.</li>
		<li>بشكل اختياري، وصمة عار قبل البكتيريا بصبغة فلورسنت.<ol>
<li>أضف 1 ميليلتر من FM 4-64FX البكتيرية وصمة عار (5 ملغ/مل حل الأسهم). تغطية أنبوب مع إحباط لحماية من فوتوبليتشينج واحتضان الدورية أكثر من النهاية في RT لمدة 15 دقيقة.</li>
			<li>إزالة الصبغة الزائدة بالغسيل مع 1 x E3: بيليه البكتيريا عن طريق استخدام الطرد المركزي في 6,000 س ز ل 1.5 دقيقة، ثم ريسوسبيند بيليه في 1 مل الإعلام E3. كرر الخطوة يغسل مرتين.</li>
			<li>حصاد البكتيريا الملون عن طريق استخدام الطرد المركزي في س 6,000 ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه البكتيرية في 1 مل الإعلام E3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>أضف 1 مل المعلقات البكتيرية إلى كل من قوارير اثنين من باراميسيا الطازجة. تبني على RT ح 2. ملاحظة: إذا كان يعمل مع البكتيريا الملون، احتضان في الظلام على RT ح 2.</li>
	</ol></li>
	<li>يغسل البكتيريا/باراميسيا ثقافة المشارك.
	<ol>
<li>دمج محتويات كلا قوارير الثقافة المشارك باراميسيا/البكتيريا في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز عند 15 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي تبريد مسبقاً قبل هذه الخطوة.</li>
		<li>إزالة حوالي 10 مل من المادة طافية E3 استخدام ماصة مصلية وإضافة حوالي 10 مل 1 جديدة x E3 للأنبوبة المخروطية. ملاحظة: خلال جميع الخطوات الغسيل، من الضروري أن تكون سريعة جداً عند إزالة المادة طافية، كما ستبدأ باراميسيا للسباحة خارج بيليه. زيادة ونقصان وإزالة المادة طافية من أنبوب واحد في كل مرة لضمان معالجة سريعة بما يكفي في هذه الخطوة، وتجنب فقدان باراميسيا في المادة طافية.</li>
		<li>، وتدور عينات عن طريق استخدام الطرد المركزي في 300 غرام x عند 15 درجة مئوية لإزالة الحد الأدنى 5 حوالي 10 مل من المادة طافية E3 باستخدام ماصة مصلية إضافة حوالي 10 مل 1 جديدة x E3 للأنبوبة المخروطية. كرر هذه الخطوة مرتين.</li>
		<li>إزالة عينات من أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز عند 15 درجة مئوية للحد الأدنى 5 حوالي 10 مل من المادة طافية E3، مع الحرص على عدم عرقلة بيليه.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه إلى 10 مل المتبقية لوسائل الإعلام E3 ونقل 500 ميليلتر من التعليق في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة. بيليه 500 ميليلتر من باراميسيا التي سينتريفوجينج في 300 x ز لمدة 5 دقائق لعد عدد باراميسيا.</li>
		<li>إزالة 400 ميليلتر من E3 طافية من العينة 500 ميليلتر. إضافة 20 ميليلتر من 36.5% فورمالدهايد الحل إلى ميليلتر 100 المتبقية من باراميسيا وريسوسبيند برفق، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 22 درجة مئوية. ملاحظة: هذه الخطوة يقتل باراميسيا للسماح للعد.</li>
		<li>قياس الحجم الإجمالي الفعلي باستخدام ماصة وسجل. تمييع تعليق باراميسيا 1:1 v/v، مع حل تريبان الأزرق 0.4 في المائة.</li>
		<li>استخدام العداد الخلية أو هيموسيتوميتير لحساب عدد القتلى باراميسيا/مل. ملاحظة: بسبب خطوة التثبيت المسبق، سوف تكون باراميسيا معظم القتلى في هذه المرحلة، ولكن هذا الرقم يعكس عدد باراميسيا يعيش تجربة الحضانة المشتركة. الكتاب لم نجد الموت باراميسيا كبيرة بسبب حضانة المشارك البكتيرية، وبهذا يمكن تجاهلها كعامل هنا.</li>
	</ol></li>
	<li>شارك احتضان اليرقات باراميسيا والزرد.
	<ol>
<li>حساب تركيز باراميسيا: <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq11.jpg" style="opacity: 0.9;"> <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq12.jpg"> ملاحظة: يعطي هذا الحساب تركيز باراميسيا في أنبوب 50 مل المخروطية من الخطوة 3.2.5.</li>
		<li>حساب حجم غسلها باراميسيا اللازمة لتركيز من 2 × 105 مليلتر باراميسيا بحجم نهائي في 3 مل E3. ملاحظة: ويمكن تعديل تركيز باراميسيا استناداً إلى الجرعة المطلوبة البكتيرية، التي تخضع للتحسين.</li>
		<li>تخدير الزرد بإضافة تريكيني في تريس 100 ملم pH 8.0 إلى تركيز نهائي من 100 الزرد نقل 10 مغ/لتر. في كل بئر من لوحة 6-جيدا إلى حجم إجمالي 3 مل من E3 الطازجة التي تحتوي على تركيز مناسب من باراميسيا (المحسوبة في الخطوة 3.3.2)-ضمان نقل اليرقات في كمية صغيرة من السائل، لضمان أنها التعافي من التخدير في البئر المتلقية.</li>
		<li>احتضان عند 30 درجة مئوية ح 2 في حاضنة الدافيء تحت ظروف ضوء النهار، لتأمين ظروف البرق الأمثل لتنهب.</li>
		<li>أغسل الزرد 5 مرات على الأقل بنقل الأسماك إلى جديدة تتضمن أيضا 3 مل من E3 الطازجة التي تحتوي على تريكايني 100 مغ/لتر في كل مرة. ملاحظة: لا تحاول تجاهل تريكيني أثناء الخطوة الغسيل. نقل اليرقات المحمول دون تخدير يزيد خطر الضرر والشدة للحيوان.</li>
		<li>اختيارياً، تعد الزرد لتصوير عن طريق تضمين الزرد في 3 مل من 1% ذوبان منخفضة [اغروس] في لوحة 6-بئر مسورة الأسود: ذوبان منخفضة [اغروس] هو يتألف في 1xE3 وتسخينها في ميكروويف. حالما منصهرة، إضافة تريكيني بتركيز 160 مغ/مل نهائي. موقف الأسماك تحت ستيريوميكروسكوبي، استخدام هلام المقطوعة تحميل تلميح، التأكد من الرأس على اليسار والذيل على الحق (الشكل 3). انتظر لمدة 5 دقائق ل [اغروس] لتعيين، ثم تراكب الأسماك المضمنة مع x E3 1 التي تحتوي على تريكيني 160 ملغ/مل للتصوير.</li>
	</ol></li>
	<li>تحديد معدل الضحية. ملاحظة: تجربة منفصلة لا يحتاج إلى إعداد لتحديد معدل الضحية. بدلاً من ذلك، يمكن أن يتم ذلك خلال الخطوة 3.3.4، كما هو موضح أدناه.<ol>
<li>خلال الخطوة 3.3.4، أعرض الزرد الضحية على شريط فيديو ستيريوميكروسكوبي والقبض على القبض على الفريسة.</li>
		<li>نقاط لقطات الفيديو. التقاط فريسة تتسم بضرب من الزرد نحو الفريسة. عد كل ضربة كفريسة واحدة التقاط الحدث، على الرغم من أن هذا فقط تقريبي (انظر المناقشة).</li>
		<li>حساب متوسط عدد فريسة التقاط الأحداث كل ساعة من مقاطع الفيديو متعددة، كل منها يمثل يرقة الزرد مختلفة (الشكل 2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+to+Salmonella+Typhimurium,+a+model+enteric+pathogen.">Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen.</a> Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).</li><li>Stones, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+(Danio+rerio)+as+a+Vertebrate+Model+Host+To+Study+Colonization,+Pathogenesis,+and+Transmission+of+Foodborne+Escherichia+coli+O157.">Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Vibrio+cholerae+enterotoxicity+in+a+zebrafish+infection+model.">Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).</li><li>Logan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+can+modulate+host+intestinal+mechanics+to+displace+gut+bacterial+symbionts.">The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).</li><li>Howlader, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+novel+model+for+non-typhoidal+Salmonella+pathogenesis,+transmission+and+vaccine+efficacy.">Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy.</a> Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).</li><li>Troll, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+promote+secretory+cell+determination+in+the+intestinal+epithelium+by+modulating+host+Notch+signaling.">Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Gut+Motility+Promotes+Competitive+Exclusion+within+a+Model+Intestinal+Microbiota.">Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota.</a> PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).</li><li>Rendueles, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+zebrafish+model+of+oro-intestinal+pathogen+colonization+reveals+a+key+role+for+adhesion+in+protection+by+probiotic+bacteria.">A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria.</a> PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).</li><li>Varas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+induces+cloacitis-like+symptomsin+zebrafish+larvae.">Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae.</a> Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).</li><li>Runft, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+natural+host+model+for+Vibrio+cholerae+colonization+and+transmission.">Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).</li><li>Meier, R., Wiessner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+algae-free+Paramecium+bursaria+with+symbiotic+Chlorella+sp.+Isolated+from+green+paramecia:+I.+Effect+of+the+incubation+period.">Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period.</a> European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).</li><li>Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phagotrophy+in+the+mixotrophic+ciliate+Paramecium+bursaria+using+GFP-expressing+yeast+cells.">Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells.</a> FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliate+Paramecium+is+a+natural+reservoir+of+Legionella+pneumophila.">Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila.</a> Scientific Reports. 6, 24322 (2016).</li><li>Bragg, A. N., Hulpieu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+of+Demonstrating+Acidity+of+Food+Vacuoles+in+Paramecium.">A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium.</a> Science. 61 (1580), 392 (1925).</li><li>Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prey+capture+by+larval+zebrafish:+evidence+for+fine+axial+motor+control.">Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control.</a> Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).</li><li>Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+guided+gradation+of+prey+capture+movements+in+larval+zebrafish.">Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish.</a> Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).</li><li>Megraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+Helicobacter+pylori:+faecal-oral+versus+oral-oral+route.">Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).</li><li>Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+enteropathogenic+and+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+pathogenesis.">A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).</li><li>Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prey+capture+behavior+evoked+by+simple+visual+stimuli+in+larval+zebrafish.">Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).</li><li>Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+prey+capture+in+larval+zebrafish+is+controlled+by+identified+reticulospinal+neurons+downstream+of+the+tectum.">Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).</li><li>Westphal, R. E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+locomotor+maneuvers,+and+improving+sensory+capabilities,+give+rise+to+the+flexible+homing+strikes+of+juvenile+zebrafish.">Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

البروتوكول الأساسية الموصوفة هنا تم الأمثل للممرضة كولاي، وقد تم تكييف بنجاح للأنواع البكتيرية الأخرى، بما في ذلك انتيريكا السالمونيلا و الكوليرا. لبعض الأنواع التي لم تستعمر الأمعاء الزرد بعد غمر حمام، بما في ذلك بعض سلالات السالمونيلا انتيريكا وبعض اللاهوائيات، العدوى المنقولة عن طريق الأغذية كما هو موضح هنا يمكن بنجاح إنشاء الاستعمار. ميكروجافاجي، الذي يستخدم أيضا إنشاء ارتفاع أعباء البكتيرية في الأمعاء اليرقات، بالمقارنة مع العدوى المنقولة عن طريق الأغذية من الناحية التقنية أقل تحديا ويتطلب معدات متخصصة أقل. ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل المعلمات حرجة للأنواع البكتيرية وسلالات لاستخدامها. وتشمل هذه العوامل البكتيرية وبراميسيوم الكثافة للخطوة ثقافة المشارك البكتيريا-براميسيوم: إذا كانت أرقام البكتيرية داخل باراميسيا منخفضة، هذا يمكن تحسينها من خلال زيادة كثافة البكتيرية في الخطوة ثقافة المشارك. بعض الأنواع البكتيرية قد يسبب الضرر للمضيف براميسيوم وينبغي تقييم هذا الفحص المجهري.
عامل مهم آخر في هذا البروتوكول استيلاء فريسة الزرد. ويستند على افتراض أن كل التقاط فريسة الإضراب النتائج في ابتلاع براميسيوم واحد معدل الضحية كما هو موضح هنا. وتستخدم كثافات عالية من باراميسيا كل الأسماك في البروتوكول لضمان ارتفاع معدلات الضحية. ومع ذلك، التقاط فريسة اعتماداً على كثافة باراميسيا في النظام، وفي الثقافات براميسيوم مخفف جداً، قد تكون الضحية معدلات منخفضة تصل إلى 13 – 15 باراميسيا كل ساعة21،22. حد هو أن معدلات التقاط الفريسة أيضا تعتمد بشدة على ظروف الإضاءة وفي الظلام، ومعدلات التقاط 80% أقل مما في ضوء الظروف21 ، وهذا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند إعداد تجارب. إذا كان مرات التعرض فريسة لتوسيع نطاق لتحسين الاستعمار، قد النظر للتعرض الثانوي للبكتيريا عن طريق البراز. لا يكاد هذا التعرض الظروف المذكورة أعلاه – ح 2 من التعرض فريسة –، منذ وقت مرور القناة الهضمية من البكتيريا أكثر من 1 ح وتركيز البكتيريا في السيارة أعلى بكثير مما في البراز. ومع ذلك، إذا كان إلى حد كبير هو زيادة وقت التعرض فريسة، هذا قد تصبح عاملاً هاما.
ضوابط ملائمة ينبغي أن تدرج في هذا البروتوكول، بما في ذلك استعمار الزرد عقب التغذية مع باراميسيا المحتوية على غير ممرضة كولاي MG1655. إذا مقارنة السلالات البكتيرية متعددة لقدرتها على استعمار البلد المضيف الزرد، فمن المهم اختبار ما إذا كان نصف العمر بهم داخل باراميسيا قابل للمقارنة. الطفرات البكتيرية، بما في ذلك المساس بسلامة جدار الخلية أو حمض الاستشعار، قد يعرض للخطر الاستقرار البكتيرية داخل باراميسيا. في مثل هذه الحالات، والتغذية الزرد قد يتعين تعديلها لمراعاة الاختلافات في الجرعة.
يمكن استخدام البروتوكول هو موضح هنا للتحقيق الاستعمار الجرثومي ونتائجها، بما في ذلك التصوير الاستعمار الجرثومي من الزرد كما هو موضح أعلاه، فضلا عن تحديد زيمبابوي الواحدة الزرد من الأنسجة هوموجيناتي3، أو التحقيق المرتبطة بالإصابة بالأمراض والوفيات. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تستخدم السلالات البكتيرية معربا عن البروتينات الفلورية مثل مشري أو البروتين الأحمر نيون (RFP) للتصور البكتيرية،. سيسمح هذا التصور من تزايد السكان البكتيرية. إذا لم يكن وراثيا أصعب السلالة البكتيرية أو يمنع استخدام تعبير البروتينات الفلورية لأسباب أخرى، قد ملطخة البكتيريا بصبغة فلورسنت، مثل وزير الخارجية 4-64FX، السابقة الثقافة شارك مع باراميسيا. عند استخدام بروتوكول الموصوفة هنا، ثقافة المشارك مع باراميسيا عدم تقليل سطوع الصبغ والبكتيريا ملطخة مرئية بوضوح في الأمعاء الزرد. ومع ذلك، سوف المخفف الصبغة على مر الزمن ينبغي أن يحدث انتشار البكتيرية كبيرة داخل البلد المضيف الزرد. وفي كلتا الحالتين، الأحمر نيون البكتيريا الأفضل على البكتيريا الخضراء-فلوري، منذ أوتوفلوريسسينسي الأنسجة يمكن أن تكون أعلى في الأخضر في القناة الحمراء.
وقد وجد أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها للهوائي والأنواع البكتيرية ميكروايروفيليك. قد يكون من الممكن لتكييفه لتغذية الجراثيم والأنواع الفطرية، على الرغم من أن هذا لا يزال يمكن اختباره تجريبيا.

حصة الزرد شكلياً ووظيفيا حفظت الميزات مع الثدييات، بما في ذلك الأنساب جرانولوسيتيك (مثلاً، العَدلات) والوحيدات/بلعم-مثل الخلايا والمستقبلات الشبيهة بعدد القتلى، السيتوكينات الموالية التحريضية والببتيدات المضادة للميكروبات1 . الأمعاء في الزرد تماما توضع في 6 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية)، ويظهر حفظ الخصائص المورفولوجية والوظيفية مع الجهاز الهضمي الثدييات، مثل تنظيم النسخي مصانة في الخلايا الظهارية المعوية 2-وهذا يجعل من الزرد نموذجا رائعا لاستعمار الجراثيم المعوية والمرضية. ودرست مجموعة واسعة من الجراثيم المعوية في النموذج الزرد، بما في ذلك enterohemorrhagic الإشريكيّة القولونية3،4، الكوليرا5،6من انتيريكا السالمونيلا، الزرد الحجمية7،8، ودور البروبيوتيك في حصانة المعوية9. هي ميزة النموذج الزرد هو المستعمر بالعديد من الميكروبات دون تعطيل الحجمية الذاتية، مما يسمح التحقيق في سلوك الميكروبية في سياق المختلطة السكان الميكروبية3، 6. حاليا، معظم النماذج الزرد الاستعمار المعدية المعوية، والمرض تعتمد على الإدارة للميكروبات بغمر حمام، حيث هي المحتضنة الزرد في تعليق بكتيرية لمقدار معين من الوقت10. ومع ذلك، هذا يجعل من الصعب تحديد الجرعة الدقيقة من البكتيريا التي تديرها، ويؤدي إلى استعمار محدودة مع بعض الميكروبات، لا سيما مع البكتيريا غير ممرضة. بدلاً من ذلك، تعليق بكتيرية ويدار بالصيد عن طريق الفم تزقيمية مدتها11، ولكن هذا من الناحية الفنية صعبة ومحدودة لليرقات كبار السن والأسماك الكبار.
ويصف هذا البروتوكول استخدام بروتوزوا اونيسلولر caudatum براميسيوم كوسيلة لإيصال المنقولة عن طريق الأغذية من الميكروبات إلى الجهاز الهضمي ليرقات الزرد. هي سهلة ورخيصة للحفاظ على باراميسيا وقادرون على تغذية في مجموعة متنوعة واسعة من الجراثيم، بما في ذلك الطحالب والفطريات، والبكتيريا، وأنها تستوعب من خلال13،،من12أخدود شفوي عضو14. بمجرد استيعابه، البكتيريا وتعقد في فاكوليس، التي أسيديفي في نهاية المطاف، ومحتويات المتدهورة على مدى زمني لعدة ساعات15. الزرد اليرقات التقاط باراميسيا كفريسة الطبيعية قريبا بعد الفقس، حوالي 3-4 إدارة الشرطة الاتحادية تبعاً لدرجة الحرارة16، ويستغرق منهم بكفاءة عالية. عملية التقاط فريسة يأخذ في المتوسط 1.2 s من الكشف للقبض على17، ويتم بسرعة هضمها باراميسيا تم التقاطها في المعي الزرد، أن تطلق البكتيريا قادرة على البقاء المدخلة في الأمعاء3. كنتيجة لذلك، يمكن استخدام باراميسيا كوسيلة سريعة وسهلة لتقديم جرعة عالية ومتسقة من البكتيريا في الجهاز الهضمي من الزرد. يمكن أما أن تتحول البكتيريا تم تسليمها للتعبير عن بروتين فلورية، مثل مشري كما هو موضح هنا، أو، في حالة البكتيريا وراثيا مستعصية على الحل، ويمكن أن تكون ملطخة مسبقاً مع صبغة فلورسنت للسماح للتصور داخل الجهاز الهضمي.
يصف هذا البروتوكول تقديم تنقلها الأغذية انتيروباثوجينيك كولاي (انتيروهيمورهاجيك كولاي [الإشريكيّة] وملتصقة الغازية كولاي [أيك]), وموفر انتيريكا السالمونيلا تيفيموريوم. الممرضة كولاي و تيفيموريوم س المرسلة عن طريق ال18،البراز طريق الفم19، ويمكن أن تكون مكتسبة عن طريق تلوث الأغذية، مثل اللحوم والخضروات ومنتجات الألبان. استخدام كوداتوم P. كوسيلة، كولاي و تيفيموريوم س. استعمار بنجاح اليرقات الزرد ضمن 30 – 60 دقيقة لاحتضان المشارك مع السيارة براميسيوم. يقع عبء البكتيرية تحقق قوية بما يكفي لتصور الاستعمار وتحديد العبء بطلاء هوموجيناتيس الأنسجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Paramecium caudatum, live</td>
			<td style="width:133px;">Carolina</td>
			<td style="width:123px;">131554</td>
			<td style="width:411px;">no not store growing cultures below room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">0.4% Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T8154-20ML</td>
			<td>liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td>276855-100ML</td>
			<td>store in a solvent safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Escherichia coli, MG1655</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">ATCC 700926</td>
			<td>can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FM 4-64FX stain</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">F34653</td>
			<td>aliquot and store frozen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8775-4X25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">LB Broth</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">L3397-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">87128-25G</td>
			<td>toxic, irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">hemocytometer or cell counter</td>
			<td style="width:133px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:133px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">table-top centrifuge</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">microwave</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">rotator wheel</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">heated shaking incubator</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">aquatics facilities</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">breeding tanks</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the protozoan paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infections in zebrafish larvae

نظراً لشفافيتها والصوبه الوراثية، وسهولة الصيانة، أصبحت الزرد (دانيو rerio) نموذج الفقارية المستخدمة على نطاق واسع للأمراض المعدية. وبطبيعة الحال تفترس اليرقات الزرد بروتوزوا اونيسلولر caudatum براميسيوم. ويصف هذا البروتوكول باستخدام كاوداتوم P. كوسيلة للعدوى المنقولة عن طريق الأغذية في الزرد اليرقات. كوداتوم P. استيعاب مجموعة واسعة من البكتيريا والخلايا البكتيرية تظل قابلة للاستمرار لعدة ساعات. ثم تفترس الزرد P. caudatumوهو الإفراج عن الحمولة البكتيرية في المعي عند الهضم السيارة براميسيوم والبكتيريا استعمار الأمعاء. البروتوكول يتضمن وصفاً مفصلاً لصيانة باراميسيا، تحميل مع البكتيريا، تحديد تدهور البكتيرية والجرعة، وكذلك العدوى من الزرد بالتغذية مع باراميسيا. وميزة استخدام هذا الأسلوب من العدوى المنقولة عن طريق الأغذية هو أنه عن كثب يحاكي طريقة العدوى في الأمراض التي تصيب البشر، ويؤدي إلى استعمار أكثر قوة بالمقارنة مع البروتوكولات الغمر، ويتيح دراسة طائفة واسعة من العوامل الممرضة. يمكن استخدام العدوى المنقولة عن طريق الأغذية في النموذج الزرد للتحقيق في التعبير الجيني البكتيرية داخل المضيف، والتفاعلات المضيف الممرض، والسمات المميزة للقدرة الإمراضية بما في ذلك عبء البكتيرية والتعريب ونشرها والاعتلال.

سهولة الزاجرة caudatum براميسيوم طائفة واسعة من البكتيريا في مخزن فاكوليس. كثافة داخل الخلايا البكتيرية يعتمد على الكثافة من البكتيريا وباراميسيا في ثقافة المشاركة، فضلا عن الأنواع البكتيرية المستخدمة. مع مرور الوقت، أسيديفي فاكوليس وتدهور البكتيرية تستتبعه. معدل تدهور قد يتحدد فردياً لجميع السلالات المستخدمة. كولايالمسببة للمرض هو كثافة البكتيرية الأولية البكتيريا 790/براميسيوم، والبكتيريا المتدهورة مع نصف عمر حوالي 2.3 ح (الشكل 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig1.jpg"> رقم 1: تحديد العمر النصفي البكتيرية في باراميسيا- (أ) ح 2 التالية الحضانة المشتركة مع المعدية كولاي, P. كوداتوم كان غسلها ونقل إلى متوسطة دون البكتيريا. في النقاط الزمنية المشار إليها، أرقام لصالحه كولاي تم تحديد الخلايا بتمييع الطلاء على أجار انتقائية. النتائج وسائل ± الخطأ المعياري للوسط (وزارة شؤون المرأة؛ n = 3). (ب) صورة نموذجية لتحمل براميسيوم استيعاب البكتيريا، مع حقل مشرق (Bi)، البكتيريا الفلورسنت (Bii)، ودمج القنوات (بيي). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
علاوة على ذلك، الزرد تنهب معدل، وهو المعدل الذي الزرد استيعاب باراميسيا محملة بالبكتيريا على الحضانة المشتركة، درس. بدء الزرد اليرقات لمطاردة والتقاط فريسة حية من إدارة الشرطة الاتحادية 520، على الرغم من أن قد وجد أن، عندما أثيرت عند 30 درجة مئوية، هو تسارع التنمية اليرقات والحيوانات عرض سلوك الضحية من 4 إدارة الشرطة الاتحادية. تنهب مصحوبا بخاصية ضرب السلوك20 (الشكل 2A)، وتحديد معدل الضحية يستند إلى الافتراض بأن كل ضربة يؤدي إلى استيعاب براميسيوم واحد، على الرغم من أن هذا يمكن فقط أن ينظر تقريب (انظر المناقشة). استناداً إلى الملاحظات التي وصف هذه الوثيقة لاصطياد اليرقات الزرد، هو معدل امتصاص باراميسيا 1,539 تقريبا كل ح (الشكل 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig2.jpg"> رقم 2: تحديد معدل الضحية الزرد. (أ) الصور الثابتة من فيديو الضحية، عرض الزرد اليرقات (5 إدارة الشرطة الاتحادية) تنهب باراميسيا تحمل البكتيريا الفلورسنت. مرة في [ثانية]. يشير السهم إلى المحور الرئيسي للحركة خلال الإضراب. (ب) التحديد الكمي لمعدل الضحية (المدخول باراميسيا ساعة)، استناداً إلى n = 10 أشرطة الفيديو التي اتخذت مع مرور الوقت التعرض الكامل ح 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
وبعد استيعاب باراميسيا، يحط الزرد كفاءة الفريسة في المعي، الإفراج عن البكتيريا المعدية في الجهاز الهضمي. كما هو موضح هنا، تدهور باراميسيا العائدات بسرعة، ويمكن الكشف عن البكتيريا الحرة في الأمعاء في غضون 30 دقيقة من تنهب. مجاناً البكتيريا ثم الانتقال من المعي بالامعاء المتوسط والخلفي، حيث يتم الكشف عن حوالي 1 – 2 ح بعد بداية الضحية (الشكل 3). استمرار وجود البكتيريا في الأمعاء يعتمد على الأنواع والجرعات ولكن نطاقات من ح عدة لعدة أيام في حالة كولاي وس. انتيريكا. يموضع س. انتيريكا في المقام الأول ماكس المعوية، مع بعض غزو الظهارية (3D الشكل)، مما أدى إلى تسلل العَدلات في الظهارة (الشكل 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig3.jpg"> الشكل 3: استعمار الزرد مع البكتيريا. الزرد في إدارة الشرطة الاتحادية 5 ترك مصابة (A) أو استعمرت مع مشري معربا عن كولاي من (ب) أو (ج) س. انتيريكا. قد يتم تنفيذ تجارب العدوى في الأسماك البرية نوع (A و B) أو خطوط محوره وراثيا (مثلاً خط تيراغرام (MPO::EGFP) أنا114 معربا عن العَدلات الفلورية الخضراء المبين في (ج). افتتاح المستقيم يتسم سهم. (د) أعلى التكبير قسم المعوية من اليرقات مضمن جبل كل مصاب بعدوى السالمونيلا انتيريكا . الأزرق (Di) = هويشت وسم النوى، الأرجواني (دي) = فالويدين وسم واكتين، الأحمر (ديي) = السالمونيلا، دمج (Div). شريط المقياس = 5 ميكرومترات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58949/58949mov1.jpg"> الفيلم 1: لقطات فيديو لالتقاط الفريسة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/PreyCapture.mp4" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

أصبحت الزرد (دانيو rerio) نموذج حيوانات الفقارية المستخدمة على نطاق واسع للاستعمار الميكروبي والمرضية. ويصف هذا البروتوكول استخدام بروتوزوا caudatum براميسيوم كوسيلة للعدوى المنقولة عن طريق الأغذية في اليرقات الزرد. كوداتوم P. الزاجرة البكتيريا بسهولة والحصول على تناول الزرد اليرقات من خلال سلوك الضحية الطبيعية.

استخدام البرزي caudatum براميسيوم كوسيلة للأمراض المنقولة بالأغذية في "اليرقات الزرد"

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة حول ديناميات الاستعمار والعدوى من قبل الكائنات الحية الدقيقة في الجهاز الهضمي. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها أكثر تمثيلا للعدوى التي تنقلها الأغذية في البشر وأنها تقلل من تلف الأنسجة المحتملة في الأسماك مقارنة مع الزلاجة الفموية. المرئية التوضيحية لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما يمكن أن يكون من الصعب على خطوات الغسيل لتنفيذ بسبب طبيعة عالية من المظلة.من ثقافة النمو الحية، إضافة ملليلتر واحد من ثقافة البارامسيوم وميليلتر واحد من ثقافة MG1655 الإشريكية القولونية إلى قارورة زراعة الأنسجة عشرة ملليلتر تحتوي على ثمانية ملليلتر من E3 المتوسطة. دوامة طفيفة القارورة قبل وضعه في 22 درجة مئوية تمرير ملليلتر واحد من الثقافة المشتركة في قارورة جديدة ثقافة الأنسجة عشرة ملليلتر تحتوي على تسعة ملليلتر من المتوسط E3 الطازجة، وتستكمل مع 108 وحدات تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر من القولونية القولونية MG1655، كل أسبوعين. لتحديد نصف العمر البكتيري داخل paramecium عدد الباراميا من كثافة بصرية من 600 بكتيريا الباراميا المشتركة في الثقافة وإضافة 50 ميكرولتر aliquot من اغرات إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentrifuge كل ساعة لمدة ست ساعات.إضافة 950 ميكرولترات من واحد في المئة السطحي غير الأيونية في برنامج تلفزيوني إلى الأنابيب. وتحلل البارامسيا في كل عينة مع دقيقة واحدة من دوامة، ثم جعل واحد من كل عشرة تمييعات من كل عينة في برنامج تلفزيوني عقيمة. ولوحة 100 ميكروليتر من كل تخفيف على لوحات انتقائية لاحتضان 16 ساعة في 37 درجة مئوية.في اليوم التالي، عد فقط المستعمرات الفردية المعزولة والمتميزة لتحديد عدد المستعمرات البكتيرية على اللوحة. وتحديد لوحة مع التخفيف الذي ينتج 30-300 مستعمرة تشكيل وحدات. في اليوم السابق للعدوى، وجمع حجم واحد من البكتيريا من كثافة بصرية من 600 ثقافة لكل علاج عن طريق الطرد المركزي.وإعادة تعليق الكريات في ملليلتر واحد من E3 المتوسطة لكل أنبوب. بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد من وصمة عار بكتيرية مناسبة لكل تعليق بكتيري. وحماية أنابيب تبييض الصور مع احباط.قبل احتضان عينات البكتيريا مع تناوب نهاية النهاية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل البكتيريا مرتين في حجم كبير من E3 المتوسطة لإزالة صبغة الزائدة. وإعادة تعليق الكريات في ملليلتر واحد من طازج E3 المتوسطة لكل أنبوب.ثم، إضافة ملليلتر واحد من التعليق البكتيري إلى كل من قارورة اثنين من الباراميسيا الطازجة لكل حالة لاحتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. سحب محتويات كل من قارورة لكل حالة في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر الفردية. وبليه العينات عن طريق الطرد المركزي.باستخدام ماصة معقمة، استبدال ما يقرب من عشرة ملليلترات من E3 supernatant في كل أنبوب مع عشرة ملليلترات من E3 المتوسطة الطازجة ل3 يغسل عن طريق الطرد المركزي. بعد الغسيل الأخير، إزالة ما يقرب من عشرة ملليلترات من عظمى E3، مع الحرص على عدم تعطيل الكريات، وإعادة تعليق الكريات في المليلترات العشر المتبقية من E3 المتوسطة. نقل 500 ميكرولتررس من كل تعليق إلى أنابيب 1.5 ملليلتر microcenrifuge الفردية و بيليه البارامسيا عن طريق الطرد المركزي.تجاهل 400 ميكرولترات من supernatants، وإضافة 20 ميكرولترات من حل الفورمالديهايد 36.5 في المئة إلى 100 ميكرولترات المتبقية من البارامسيا مع الأنابيب لطيف. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وقياس الحجم الفعلي في كل أنبوب بواسطة ماصة قبل عد عدد البارامشيا الميتة لكل ملليلتر. بالنسبة للعدوى التي تنقلها الأغذية من الحمار الوحشي، تمييع عينات الباراماسية إلى ضعفين عشرة إلى خمسة بارامسيا لكل ملليلتر من التركيز المتوسط E3.وإضافة 3 ملليلتر من كل ثقافة الباراشيا إلى بئر واحد من 6 لوحة جيدا لكل حالة. بعد ذلك، نقل عشرة حمار وحشي مُهدّد إلى كل بئر في حجم أدنى من السائل. واحتضان الثقافات المشتركة لمدة ساعتين في 30 درجة مئوية في حاضنة نهارية في ظل ظروف النهار.لتحديد معدل الافتراس، شاهد سمك الحمار الوحشي المغذي تحت مجهر ستيريو أثناء الحصول على لقطات فيديو لالتقاط الفريسة. وتتميز فريسة القبض على ضرب من الحمار الوحشي نحو الفريسة. ويقدر أن كل ضربة هي حدث واحد للقبض على فريسة.في نهاية الحضانة، وغسل حمار وحشي في 5 آبار مختلفة تحتوي على 3 ملليلتر من المتوسط E3 الطازجة تكملها 100 ملليغرام لكل لتر من تريكين في بئر. وتضمين كل حمار وحشي في 3 ملليلتر من 1 في المئة من أغاروز منخفضة الذوبان في لوحة سوداء جيدة ستة. عندما تم تضمين كل من الأسماك، ضع لوحة تحت مجهر ستيريو واستخدام تلميح تحميل هلام قص للتأكد من أن رؤساء على اليسار والذيول هي على اليمين في كل حقل عرض.انتظر لمدة 5 دقائق لagarose لتعيين، ثم تراكب الأسماك جزءا لا يتجزأ مع المتوسط E3 الطازجة تكملها tricaine، وصورة حمار وحشي على المجهر الفلورسنت لتقييم التقدم المحرز في الالتهابات البكتيرية. بالنسبة للكولي الإليئي المسبب للأمراض، تكون الكثافة البكتيرية الأولية 790 بكتيريا لكل باراميكيوم، وتتحلل البكتيريا داخل الفاكوليات لكل ذرة قطع باراميكيوم مع نصف عمر حوالي 2.3 ساعة. ويرافق افترس سلوك ضرب مميزة، وتحديد معدل افتراس يستند على افتراض كل ضربة يؤدي إلى استيعاب 1 paramecium.بعد الهضم، تنتقل البكتيريا الحرة من الأمعاء الأمامية إلى الأمعاء الوسطى واللاحقة، حيث يتم اكتشافها بعد حوالي 1 إلى 2 ساعة من بداية الفريسة. S-enterica، على سبيل المثال، يُترجم في المقام الأول في الغشاء المخاطي المعوي مع بعض الغزو الظهاري مما يؤدي إلى تسلل العدلات إلى الظهارة. لا تنس أن العمل مع أنواع معينة من البكتيريا يمكن أن تكون خطرة للغاية، وأن الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة يجب أن تتخذ دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

غير الغازية التصوير من المبيضات المنتشر في يرقات اسماك الزرد

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

لين العريكة التهابات خلايا الثدييات مع طفيل وحيد الخلية، تستعد البكتيريا

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D التصوير تعدد الوسائط من<em&gt; الليمونية rodentium</em&gt; التهابات في الفئران

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

الزرد نموذجا لتقييم إمكانات المسخية من النطرون

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

باستخدام نماذج الزرد من الإنسان الأنفلونزا فيروس العدوى الى الشاشة المضادة للفيروسات المخدرات وتوصيف المضيف المناعي الردود خلية

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...