Name: using the protozoan paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infections in zebrafish larvae
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae at JoVE.com

原稿の重要な読書とコメントの Krachler グループのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、UT システム スター賞、BBSRC、および NIH (R01AI132354) によって賄われていた。

ゼブラフィッシュ飼育、繁殖、, ここで説明実験ケアおよび実験動物の使用のためのガイドに従い、およびプロトコルであるテキサス大学健康科学センターの機関の動物福祉委員会によって承認されています。番号 AWC-16-0127。
1. 成長とゾウリムシの維持
<ol><li>ゼブラフィッシュ国際リソース センター (ジルコニウム) などのソースからライブ ゾウリムシのカルチャを取得します。</li>
	<li>ライブ成長文化からゾウリムシ文化、1 で再停止される大腸菌MG1655 文化 (外径600 1.0-2.0 光密度) の 1 mL の 1 mL を追加 x E3 (0.29 g/L の NaCl、KCl、13 mg/L 44 mg/L CaCl2、81 mg/L MgSO4、0.48 g/L HEPES、pH 7.0、滅菌)、1 の 8 mL と 10 mL の培養フラスコに x E3。軽く旋回し、22 ° C で保存</li>
	<li>文化を維持するために、2 週間ごと通路ゾウリムシ文化の 1 mL に新鮮な 1 x E3 培 10 の 9 mL と 10 mL の培養フラスコ8 CFU/mL 1 で再停止される大腸菌MG1655 の x E3。</li>
</ol>2. ゼブラフィッシュに投与された細菌の用量の決定
<ol><li>
ゾウリムシ内細菌の半減期を決定します。 注:ゾウリムシ内細菌の半減期は、以下のとおり実行可能な大腸菌が治ったゾウリムシ、めっきによって決定されます。<ol>
<li>次の細菌 (外径600 1.0) 22 ° C でゾウリムシの 2 時間培養、ゾウリムシと 50 mL の円錐管に細菌培養を組み合わせて、x、E3 とカウント 1 でゾウリムシを洗う (下記のとおりの手順では 1 ミリリットルあたりゾウリムシの数3.2.7 および 3.2.8)。</li>
		<li>ゾウリムシの数を数え、ゾウリムシと細菌培養 (暴露 6 h 後) のすべての時間の 50 μ L を削除し、新しい 1.5 mL チューブに各サンプルを追加します。</li>
		<li>1% 非イオン性界面活性剤の場所 950 μ L (材料表参照) 各 1.5 mL チューブとゾウリムシを溶解する 1 分の渦にリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) ソリューション。1:10 を実行 (すなわち、900 μ L、100 μ L) 希釈剤として滅菌 PBS を使用する各サンプルの希釈液です。</li>
		<li>選択式ナンバー プレート上に各希釈の 100 μ L をプレート (LB テト媒体: 30 μ G/ml テトラサイクリン 1 g/L の NaCl, 0.5 g/L 酵母エキス 1 g/L トリプトン) と 16 h の 37 ° C で孵化させなさい。次の日はカウントし、のみ分離と異なる個々 のコロニーを数えることによってプレート (コロニー形成単位 CFUs) の細菌のコロニー数を記録します。30-300 CFU を与える希釈とプレートを識別します。</li>
		<li>希釈を決定する係数を使用しています。たとえば、細菌文化の 1 μ L は 99 mL の滅菌 PBS と混合、これは (0.01) 1: 100 希釈です。この番号は、希釈 CFU の数になります。元のサンプル CFU を判断するためのすべての時間ポイントの下、計算を実行します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq1.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
		<li>計算し実行可能なエシェリヒア属大腸菌の数をグラフ/時間に対応するゾウリムシ ステップ 3.3.1 で計算されたゾウリムシの濃度を使用して露出を投稿し、ゾウリムシ (図 1) 内での半減期を決定します。</li>
		<li>CFU を使用して各時間ポイント数が計算される計算し、実行可能な大腸菌軸、y 軸、x 軸の時間ポスト インキュベーション対ゾウリムシあたりステップ 3.3.1 で計算されたゾウリムシの濃度を使用して、グラフに表す。ゾウリムシの半減期を決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細菌細菌の半減期からの投与と捕食率を決定します。 注:細菌の量を判断するには、は、ゾウリムシの中の細菌の半減期とゾウリムシのゼブラフィッシュの捕食率を考慮する必要 (3.4 の手順を参照してください)。<ol>
<li>ゾウリムシ内細菌の崩壊を決定する次の数式を使用します。 (1)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> N0が 2 時間培養後初期ゾウリムシあたりの細菌数は、Nt は時間 t 後、残りの数量、τ はその後細菌数は半減、時間、k は崩壊定数。</li>
		<li>分解実験から細菌の半減期を用いた減衰定数 k を決定する (つまり、実行可能な細菌/ゾウリムシの量が半減すた後時間)。 (2)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq3.jpg" style="opacity: 0.9;"> 半減期の決意の言葉<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq4.jpg" style="opacity: 0.9;">と (3)<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq5.jpg" style="opacity: 0.9;">または (4)<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq6.jpg" style="opacity: 0.9;"> 注:図 1に基づき、ゾウリムシのエシェリヒア属大腸菌の半減期は、約 2.3 時間です。したがって、式 (4)、減衰率、k を使用して、エシェリヒア属大腸菌のためです。 (5)<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq7.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
		<li>細菌 (Nt) ゼブラフィッシュの幼虫によってとらの用量を見つけるため半減期実験から減衰率 (k) を決定 (P) が捕食率かゾウリムシ時速 1 匹の魚に食べられて数後捕食時間 (t)。 ( <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq8.jpg" style="opacity: 0.9;">6)</img>または (7)<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq9.jpg" style="opacity: 0.9;"> 注:図 1初期ゾウリムシ (N0) 2 時間培養 (t) 後あたりの菌量が 790 CFU。ムービー 1と図 2、捕食率 (P) が 1539 です。</li>
		<li>これらの値を使用して、式 (7) に代入、次として 2 時間インキュベーション ゼブラフィッシュによって消費される細菌の投与量を計算します。 (8)<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq10.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ゼブラフィッシュの食品媒介感染症
<ol><li>ゾウリムシは細菌を孵化させなさい。
	<ol>
<li>ゾウリムシや大腸菌MG1655 の共培養感染前に夜を準備します。E3 メディア 8 mL、継続的なゾウリムシ文化の 1 mL と大腸菌MG1655 文化の 1 mL を組み合わせる (外径600 = 1.0) 1 で再停止されるコート t25 フラスコ培養フラスコに x E3。室温 (RT) でフラスコを一晩インキュベートします。各処理条件のゾウリムシの 2 つのフラスコを準備します。</li>
		<li>細菌の成長媒体を接種する (ポンド: 1 g/L トリプトン 0.5 g/L 酵母エキス、塩化ナトリウム 1 g/L) 細菌の感染株板から個々 の細菌のコロニーを選択することにより使用して滅菌接種ループ。37 ° C で液体培養をインキュベートし、110 回転/分 (rpm) 一晩で揺れを残します。 注:(研究室コートと手袋) 保護具を着用してください、感染性病原体を取り扱う際、バイオ セーフティ レベル 2 の施設・設備を使用する必要があります。</li>
		<li>次の日、一晩かけて培養の OD600を測定します。1 mL の培地 11 で再停止されるときの外径600を達成するために必要な文化の量を計算します。</li>
		<li>ゾウリムシの 6,000 x gで 5 分、各フラスコ 1 つのボリュームでの遠心分離を介してステップ 3.1.2 からの細菌の量を収穫します。上澄みを廃棄し、E3 メディアの 1 つの mL で細菌のペレットを再懸濁します。</li>
		<li>必要に応じて、あらかじめ蛍光色素を細菌を染色します。<ol>
<li>FM 4 64FX 細菌染色 (5 mg/mL 原液) 1 μ L を追加します。カバー退色から保護し、回転オーバー エンド ・常温 15 分間インキュベートする箔管。</li>
			<li>1 で洗浄することにより余分な染料を削除 x E3: 1.5 分間 6,000 × gで遠心分離を介して細菌をペレット、E3 メディアの 1 mL にペレットを再懸濁します。洗浄ステップを 2 回繰り返します。</li>
			<li>6,000 x gで 5 分間破棄で汚された細菌を介して遠心上清を収穫し、E3 メディアの 1 つの mL で細菌のペレットを再懸濁します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>それぞれ新鮮なゾウリムシの 2 つのフラスコの細菌懸濁液の 1 mL を追加します。2 時間室温で孵化させなさい。 注:ステンド グラスの細菌を扱う場合は、2 h の RT で暗闇の中で孵化させなさい。</li>
	</ol></li>
	<li>洗って細菌/ゾウリムシ培養。
	<ol>
<li>50 mL の円錐管にゾウリムシ/細菌培養の両方のフラスコの内容を結合します。300 x gで 10 分間の 15 ° c で遠心分離機サンプル遠心分離機はこの工程の前に予冷を確認します。</li>
		<li>血清ピペットを使用して E3 清約 10 mL を削除し、新鮮な 1 の約 10 mL を追加円錐管に x E3。 注:洗浄の手順をすべての時に、非常に迅速に、上澄みを取り外す際、ゾウリムシがペレットの泳いでいくと重要です。スピン時この段階で十分に速く処理できるように 1 つの管から上清を除去し、上澄みにゾウリムシの損失を防ぐ。</li>
		<li>5 分削除血清ピペットを使用して E3 上澄みの約 10 mL の 15 ° C で 300 × g で遠心分離を介してサンプルをスピンし、新鮮な 1 の約 10 mL を追加し円錐管に x E3。この手順を 2 回繰り返します。</li>
		<li>15 ° C、5 分で 300 × gで遠心分離機サンプルは、ペレットを妨害しないように世話 E3 清約 10 mL を削除します。</li>
		<li>E3 メディアの残り 10 mL にペレットを再懸濁し、懸濁液 500 μ L を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。ゾウリムシの数をカウントする 5 分間 300 × gで遠心分離によるゾウリムシの 500 μ L をペレットします。</li>
		<li>500 μ L のサンプルから培養上清中の E3 の 400 μ L を削除します。ゾウリムシの残りの 100 μ L に 36.5% ホルムアルデヒド液 20 μ L を追加し、優しく再懸濁し、22 ° C で 5 分間インキュベート 注:このステップを数えるためにゾウリムシを殺します。</li>
		<li>ピペットとレコードを使用して実際の総容積を測定します。ゾウリムシ懸濁液 1:1 v/v で 0.4% トリパン ブルー溶液を希釈します。</li>
		<li>ゾウリムシ/mL の死者の数をカウントするのにセル カウンターまたは検定を使用します。 注:前固定ステップのためほとんどゾウリムシはこの時点で死んでいるだろうが、この数は共同培養実験のための生きているゾウリムシの数を反映します。著者は、これはここに要因として無視できるので細菌の共培養による重要なゾウリムシ死を発見していません。</li>
	</ol></li>
	<li>共同ゾウリムシやゼブラフィッシュの幼虫を孵化させなさい。
	<ol>
<li>ゾウリムシの濃度を計算します。 <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq11.jpg" style="opacity: 0.9;"> <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq12.jpg"> 注:この計算は、3.2.5 のステップから 50 mL の円錐管にゾウリムシの濃度を提供します。</li>
		<li>E3 の 3 mL の最終巻で 2 x 105ゾウリムシ/mL の濃度に必要な洗浄のゾウリムシのボリュームを計算します。 注:ゾウリムシの濃度は、最適化される目的の細菌量に基づいて調整できます。</li>
		<li>ゼブラフィッシュを (ステップで計算されたゾウリムシの適切な濃度を含む新鮮な E3 の 3 mL の容量に 6 ウェル プレートの各ウェルに 100 mM トリス ph 8.0 を最終濃度 100 MG/L 転送 10 ゼブラフィッシュの tricaine を追加することで麻酔します。3.3.2). 受信者も麻酔から回復できるように、液体の最小限の量で幼虫を転送することを確認します。</li>
		<li>食い物の最適な照明条件を確保するため、日の光条件の下で昼間のインキュベーターで 2 h 30 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>新鮮な E3 のたびに 100 mg/L tricaine を含むに対応する新しいも含む 3 mL に魚を移すことによって、少なくとも 5 回ゼブラフィッシュを洗ってください。 注:洗浄工程中に、tricaine を省略しないでください。麻酔なしモバイル幼虫を転送する損害と動物に苦痛のリスクが高まります。</li>
		<li>必要に応じて、黒壁 6 ウェル プレートで 1% 低溶解アガロースの 3 mL にゼブラフィッシュを埋め込むことによってイメージング用ゼブラフィッシュを準備: 低溶解アガロースは 1xE3 で作り上げた、電子レンジで加熱します。一度溶融、160 mg/mL の最終的な集中に tricaine を追加します。確実な頭の左右の尾の先端を読み込むクリップされたゲルを用いた顕微鏡下位置魚は右側 (図 3)。設定する、agarose のため 5 分間待機し、1 x E3 含む 160 mg/mL tricaine イメージングのための埋め込まれた魚をオーバーレイします。</li>
	</ol></li>
	<li>捕食率を決定します。 注:別の実験を捕食率を決定するように設定する必要はありません。むしろ、この行うことができます段階 3.3.4、以下のとおり。<ol>
<li>3.3.4 のステップ中に獲物捕獲の実体顕微鏡とキャプチャ映像の食い物ゼブラフィッシュを表示します。</li>
		<li>ビデオ映像をスコアします。獲物捕獲獲物に向かってゼブラフィッシュの顕著な特徴です。これは単なる目安ですが 1 つの獲物捕獲イベントとして各ストライクをカウント (ディスカッションを参照してください)。</li>
		<li>それぞれ異なるゼブラフィッシュ幼虫 (図 2) を表す複数のビデオ クリップから 1 時間あたりの獲物捕獲イベント数の平均値を計算します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

ここで説明されている基本的なプロトコルは病原大腸菌、ために最適化された、サルモネラコレラ菌など他の細菌種に正常に適応されています。次の浸漬法、いくつか由来サルモネラといくつかの嫌気性菌を含むゼブラフィッシュ腸を植民地化を行ういくつかの種の食品媒介感染前述のように使用できます正常に植民地を確立します。幼虫の腸管に高い細菌負荷を確立するために使用も、microgavage と比較して食品媒介感染症は技術的により困難より特殊な機器が必要です。ただし、重要なパラメーターが菌種・系統を使用するために最適化。このような要因を含める細菌ゾウリムシ培養ステップの細菌とゾウリムシ密度: 共培養の手順で細菌の密度を増やすことでこれが改善できればゾウリムシ内細菌数が少ない場合。いくつかの細菌種のゾウリムシ ホストにおそれ、これは顕微鏡によって評価される必要があります。
このプロトコルでもう一つの重要な要因は、ゼブラフィッシュで獲物のキャプチャです。前述のように捕食率はすべての獲物の捕獲が 1 つゾウリムシの摂取で結果を打つことを前提に基づいています。魚ごとゾウリムシの高密度は、捕食率を確保するためプロトコルで使用されます。獲物のキャプチャは、システム、ゾウリムシの密度に依存し、非常に希薄ゾウリムシの文化で捕食率は 13-15 時間21,22あたりゾウリムシとして低いかもしれない。制限は、獲物捕獲率は、暗闇の中、照明条件に強く依存して、キャプチャ率 80% の光の条件で21これ必要があります考慮する実験を設定する場合よりも低いです。獲物に露出時間は植民地化を最適化するために展開する必要がある、考慮は糞便を介して細菌への二次暴露に与えられるしています。-獲物露出の 2 h-上記の条件の下でこの露出は、細菌の腸内通過時間が 1 時間以上と車両の細菌の集中は糞便中よりもはるかに高いので、ごくわずかです。ただし、獲物の露出時間が大幅に増加、重要な要因になるかもしれません。
適切なコントロールは、次の非病原性大腸菌が含まれているゾウリムシの餌ゼブラフィッシュの植民地化を含む、このプロトコルに含まれるべき MG1655。複数菌株ゼブラフィッシュ ホストを植民地化する能力で比較すると、ゾウリムシの内でその半減期が同等かどうかをテストすることが重要です。細胞壁の整合性や酸の検知を損なうことを含む細菌の突然変異は、ゾウリムシ内細菌の安定性が損なわれます。このような場合は、ゼブラフィッシュの餌付けは、投与量の違いをアカウントを調整します。
ここで説明されているプロトコルは細菌の植民地化と組織ホモジネート3、ゼブラフィッシュあたり CFU を決定することによってだけでなく、前述のように、ゼブラフィッシュの細菌の定着をイメージングし、その結果を検討する使用ことができますか感染症による罹患率と死亡率を調査します。理想的には、細菌の可視化表現 mCherry などの蛍光タンパク質や赤色けい光たんぱく質 (RFP) の菌株を使用ください。細菌の人口増加の可視化できるようになります。細菌の歪みは遺伝的扱いやすい蛍光蛋白質の表現の使用が他の理由で無効になるか、細菌染色の FM 4-64FX などの蛍光色素をゾウリムシと共培養する前に。ゾウリムシ共培養が染料の明るさを減らないここで説明されているプロトコルを使用している場合、ゼブラフィッシュ腸にはっきりと見えるステンド グラス細菌です。ただし、ゼブラフィッシュ ホスト内で発生する重要な細菌の増殖をする必要があります時間をかけて染料を希釈するでしょう。どちらの場合で、赤蛍光細菌は、以来、赤のチャンネルにより緑で高くすることは組織の自家蛍光グリーン蛍光細菌に望ましい。
このプロトコルに適応できることがわかった好気性と微好気細菌種。これを実験的にテストする残るが胞子、真菌種の給餌のため適応することがあります。

ゼブラフィッシュ共有形態学的および機能的保存顆粒球系統 (好中球など)、単球/マクロファージのような細胞、Toll 様受容体、炎症性サイトカイン、抗菌ペプチド1 を含む哺乳類の機能.ゼブラフィッシュの腸管が完全に 6 日間ポスト受精 (dpf) で開発および哺乳類の消化管、腸管上皮細胞における保存された転写制御などの形態的, 機能的省を示しています2。 これによりゼブラフィッシュ、腸内微生物の定着と病原性に優れたモデル。ゼブラフィッシュ モデルでは、腸管出血性大腸菌3、コレラ4、5、サルモネラ6、腸内微生物の広い範囲を研究されている、ゼブラフィッシュ叢7、8、および腸管免疫9でプロバイオティクスの役割。ゼブラフィッシュ モデルの明確な利点は、それは混合微生物集団3,のコンテキストで微生物の行動の調査を可能にする内因性細菌叢を中断させることがなく多くの微生物によって植民地6. 現在、胃腸の植民地化および病気のほとんどのゼブラフィッシュ モデルは一定時間10の細菌懸濁液のゼブラフィッシュを培養する場所、浸漬法による微生物の管理に依存します。ただし、これは投与し、細菌の正確な投与量の決定が難しく、非病原性細菌、特にいくつかの微生物と限られた植民地化に 。また、細菌懸濁液は経口11を介して魚に投与されるが、これは技術的に挑戦的より古い幼虫と大人の魚に限定。
このプロトコルでは、単細胞の原生動物ゾウリムシのゼブラフィッシュ幼虫の消化管への微生物の食品媒介配信するための手段としての使用について説明します。ゾウリムシは簡単かつ安価に維持するために、様々 な藻類、菌類および細菌は、口部の繊毛溝12,13,14を通して彼らを内面化をはじめとする、微生物の供給が可能です。内面、細菌は空胞で開催されます一度最終的に酸性し、目次はいくつかの時間15時間をかけて溶かされます。ゼブラフィッシュ稚魚キャプチャ ゾウリムシ自然の獲物として孵化後すぐに約 3-4 dpf 温度16、によって異なり、高効率でそれらを取る。獲物捕獲のプロセスは、検出から平均 1.2 の17をキャプチャして、内面化された細菌が腸管3に解放されるようにキャプチャされたゾウリムシ、ゼブラフィッシュ前腸で消化されるすぐに。その結果、ゾウリムシは、ゼブラフィッシュの消化管に細菌の高と一貫した線量を提供する速く、簡単な方法として使用できます。配信された細菌は、前述のように、mCherry などの蛍光蛋白質を表現するか変換ことができますまたは、事前内で可視化できるように蛍光色素で染色できる遺伝的難治性細菌の場合、消化管。
このプロトコルを記述する腸管病原大腸菌食中毒配信 (腸管出血性大腸菌[EHEC] 付着性と侵襲性大腸菌[AIEC]) とサルモネラssp ネズミチフス菌。病原性大腸菌、サルモネラ送信経由で糞便口頭ルート18,19, と取得を介して汚染された食品では、肉、野菜、乳製品などをすることができます。ゾウリムシを使用すると、車両として、エシェリヒア属大腸菌およびサルモネラ正常に植民地化ゾウリムシ車両と共同の孵化の 30-60 分以内ゼブラフィッシュ幼虫。達成の細菌負荷は、植民地化を視覚化し、組織ホモジネートをメッキすることによって負担を決定する十分な堅牢です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Paramecium caudatum, live</td>
			<td style="width:133px;">Carolina</td>
			<td style="width:123px;">131554</td>
			<td style="width:411px;">no not store growing cultures below room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">0.4% Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T8154-20ML</td>
			<td>liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td>276855-100ML</td>
			<td>store in a solvent safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Escherichia coli, MG1655</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">ATCC 700926</td>
			<td>can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FM 4-64FX stain</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">F34653</td>
			<td>aliquot and store frozen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8775-4X25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">LB Broth</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">L3397-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">87128-25G</td>
			<td>toxic, irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">hemocytometer or cell counter</td>
			<td style="width:133px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:133px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">table-top centrifuge</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">microwave</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">rotator wheel</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">heated shaking incubator</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">aquatics facilities</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">breeding tanks</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the protozoan paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infections in zebrafish larvae

それらの透明性、遺伝的少ないとメンテナンスの容易さのためゼブラフィッシュ (動脈分布) は感染症に広く使われている脊椎動物のモデルになっています。ゼブラフィッシュ稚魚は当然のことながらゾウリムシの単細胞原生動物を捕食します。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ稚魚における食品媒介感染症のための車両としてクローナルエイジングの使用について説明します。ゾウリムシは細菌の広い範囲を内面化し、細菌細胞が数時間で実行可能なまま。ゼブラフィッシュは、ゾウリムシの捕食、ゾウリムシ車両の消化時に前腸の細菌の負荷が解放され、細菌が腸を植民地化します。プロトコルには、ゾウリムシの餌でのゾウリムシ メンテナンス、細菌、装荷ゼブラフィッシュの感染だけでなく、バクテリアの用量決定の詳細な説明が含まれています。食品媒介感染症のこのメソッドを使用する利点は、密接に人間の病気にみられる感染症のモードを模倣、液浸のプロトコルと比較してより堅牢な植民地化につながるし、病原体の広い範囲の履修ができるようです。ゼブラフィッシュ モデルにおける食品媒介感染症は、細菌の遺伝子発現ホスト、ホスト病原体の相互作用、および病原性細菌の負担、ローカライズ、普及罹患率などの特徴を調査する使用できます。

ゾウリムシは容易にストレージの液胞に細菌の広い範囲を内部します。細胞内細菌密度菌と共培養だけでなく、使用される細菌種ゾウリムシの密度に依存します。時間をかけて、液胞の酸性し、細菌の劣化はすさまじい。低下の割合は、全供によって決められます。病原性大腸菌、初期の細菌密度は 790 細菌/ゾウリムシ、および細菌は、約 2.3 時間 (図 1) の半減期と分解されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig1.jpg"> 図 1: ゾウリムシの細菌の半減期の測定。(A) 次の 2 h 共同培養感染性大腸菌、ゾウリムシは洗浄し、細菌なしメディアに転送します。番号が指定された時点で実行可能なエシェリヒア属大腸菌のセルは、選択寒天培地で希釈めっきを定められました。結果は手段の平均値 ± 標準誤差 (SEM; n = 3)。(B) ゾウリムシを運ぶの典型的なイメージは細菌、明るいフィールド (Bi)、蛍光菌 (Bii) を内面化し、チャンネル (Biii) を合併します。スケール バー = 20 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
さらに、捕食率、ゼブラフィッシュは、どのゼブラフィッシュ レート共同培養細菌ロード ゾウリムシを内面化、調べた。それが分かった、30 ° C で発生すると、幼生は加速され、動物表示 4 dpf から捕食動作が、ゼブラフィッシュ稚魚は狩りし、5 の dpf の20日からライブ獲物をキャプチャを開始します。行動20 (図 2 a)、印象的な特性と一緒に伴われる食い物と捕食率の決定は各ストライクが 1 つゾウリムシの内面化につながることを前提に基づいて、これはだけみなすことができるが、近似 (ディスカッションを参照してください)。H (図 2 b) あたり約 1,539 ゼブラフィッシュ幼虫を捕食のここに記述された観測に基づく、ゾウリムシの吸収率です。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig2.jpg"> 図 2: ゼブラフィッシュ捕食率の定量します。(A) 示すゼブラフィッシュ飼育幼虫 (5 dpf) 蛍光細菌を運ぶゾウリムシの捕食捕食ビデオから静止画像。時間 [秒] です。矢印は、殴打の間に動きの主要な軸を示します。捕食率 (時間あたりゾウリムシ摂取量) の (B) の定量化による n = 10 動画完全 2 h 露出時間をかけて撮影します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
ゾウリムシの内面化、次、ゼブラフィッシュは効率的に前腸、消化器系に伝染性の細菌を放出で獲物を低下します。ゾウリムシ劣化進む、すぐに前述の本と腸管で食い物の 30 分以内無料細菌を検出できます。細菌を無料し、前腸から半ばと後部の腸に移動、彼らが検出された食い物 (図 3) の初めの後約 1-2 時間。種、線量の範囲に依存する腸内細菌の永続性大腸菌と米由来の場合いくつかの日にいくつかの時間から。上皮 (図 3) に好中球の浸潤につながるいくつかの上皮の侵入 (図 3 D) と、小腸の粘膜を中心に米由来をローカライズします。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig3.jpg"> 図 3: ゼブラフィッシュ細菌の植民地化します。5 dpf でゼブラフィッシュ感染していない (A) を左または mCherry (B)エシェリヒア属大腸菌あるいは (C)米由来の表現で植民地化します。感染実験は、野生型 (AとB) の魚や形質転換線で行われるかもしれない (ライン Tg (MPO::EGFP) 例えば、私114 (C) に示すように緑色の蛍光好中球を表現します。直腸の開口部は、矢印で示されます。(D) 全体マウント組込幼虫サルモネラ感染症に感染しているから腸のセクションの高倍率。(ディ) 青 = ヘキスト (Dii) 紫の核をマーキング マーキング (Diii) 赤 F アクチン ファロイジンを = = サルモネラ (Div) マージ。スケール バー 5 μ m を =。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58949/58949mov1.jpg"> 映画 1: 獲物捕獲の映像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/PreyCapture.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。

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Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

ゼブラフィッシュ (動脈分布) 微生物のコロニー形成の病因の広く使われている、脊椎動物の動物モデルとなっています。このプロトコルでは、原生動物ゾウリムシのゼブラフィッシュ幼虫における食品媒介感染症のための車両としての使用について説明します。クローナルエイジングは容易に細菌を内部し、自然な捕食行動をゼブラフィッシュ稚魚によって取られて得る。

ゼブラフィッシュ幼虫における食品媒介感染症のための車両として原虫ゾウリムシを使用してください。

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

この方法は、腸管内の微生物によるコロニー形成と感染のダイナミクスに関する微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、それが人間の食物媒介性感染症のより代表的であり、経口のギャバジと比較して魚の潜在的な組織損傷を減少させることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、パラメシアの高い運動性の性質のために、洗浄工程を行うことが困難であり得るため、重要である。生育培養から、8ミリリットルのE3培地を含む10ミリリットルの組織培養フラスコに、パラメシウム培養物1ミリリットルと大腸菌MG1655培養液1ミリリットルを加える。フラスコを22度に軽く旋回させてから、コカルチャーの1ミリリットルを新鮮なE3培地の9ミリリットルを含む新しい10ミリリットルの組織培養フラスコに通過させ、2週間ごとに1ミリリットル当たり108コロニー形成単位を補う。パラメシウム内の細菌の半減期を決定するために、パラメシア菌の共培養の光学密度からパラメシアの数を数え、新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に50マイクロリットルの上澄み液を6時間追加する。PBSに1%の非イオン界面活性剤の950マイクロリットルをチューブに加えます。そして、各サンプルのパラメシアを1分間の渦で溶精し、滅菌PBSで各サンプルの10回に1回希釈する。そして、摂氏37度で16時間のインキュベーションのために、各希釈の100マイクロリットルを選択的プレートにプレートします。翌日、プレート上の細菌コロニーの数を決定するために、孤立した個々のコロニーのみをカウントします。そして30-300コロニー形成単位を得る希釈と板を識別する。感染前日、遠心分離による治療当たり600培養の光学密度から1体積の細菌を採取する。そして、チューブあたりE3培地の1ミリリットルでペレットを再中断します。次に、各細菌懸濁液に適切な細菌染色の1マイクロリットルを加える。そして、ホイルでチューブ写真の漂白を保護します。室温で15分間エンドオーバー回転で細菌サンプルをインキュベートする前に。インキュベーションの終わりに、過剰な染料を除去するために大量のE3培地で細菌を2回洗浄する。そして、チューブあたり新鮮なE3培地の1ミリリットルでペレットを再中断します。次に、室温で2時間インキュベーションするために、条件ごとに新鮮なパラメシアの2つのフラスコのそれぞれに細菌懸濁液の1ミリリットルを加える。個々の50ミリリットルの円錐管に条件ごとに両方のフラスコの内容物を引っ張ります。そして遠心分離により試料をペレット化する。滅菌ピペットを使用して、各チューブ内のE3上清の約10ミリリットルを、遠心分離によって3つのスケを行う新鮮なE3培地の10ミリリットルに置き換えます。最後の洗浄後、約10ミリリットルのE3上清を取り除き、ペレットを破壊しないように気をつけて、残りの10ミリリットルのE3培地中のペレットを再び懸濁します。各懸濁液500マイクロリットルを、個々の1.5ミリリットルマイクロセニフュージチューブに移し、遠心分離によってパラメシアをペレットに入れ替えます。上清400マイクロリットルを捨て、36.5%ホルムアルデヒド溶液の20マイクロリットルを穏やかなピペットで残りの100マイクロリットルのパラメシアに加えます。室温で5分後、1ミリリットル当たりの死んだパラメシアの数を数える前に、ピペットで各チューブの実際の総量を測定します。ゼブラフィッシュの食物媒介感染の場合、パラメシアサンプルをE3培地濃度の1ミリリットル当たり10〜5パラメシアに希釈する。そして、各パラメシア培養の3ミリリットルを条件ごとに6ウェルプレートの1つの井戸に加えます。次に、麻酔ゼブラフィッシュを10匹ずつ、最小限の量の液体で各ウェルに移します。そして、昼間の条件下で日経インキュベーターで摂氏30度で2時間の共培養をインキュベートします。捕食率を決定するには、捕食捕獲のビデオ映像を取得しながら、ステレオ顕微鏡の下で餌ゼブラフィッシュを見ます。獲物捕獲は、獲物に向かってゼブラフィッシュの打撃によって特徴付けられる。各ストライキは、1 つの獲物キャプチャ イベントであると推定されます。インキュベーションの終わりに, 5 種類のウェルでゼブラフィッシュを洗浄 3 新鮮な E3 培地のミリリットルを含む 100 トリケーヌのリットルあたり 100 ミリグラムあたりよく.そして、黒い井戸6ウェルプレートに1%低融解アガロースの3ミリリットルに各ゼブラフィッシュを埋め込みます。すべての魚が埋め込まれたら、プレートをステレオ顕微鏡の下に置き、クリップされたゲルローディングチップを使用して、ヘッドが左側にあり、各視野の右側に尾が表示されていることを確認します。アガロースがセットされるまで5分間待ってから、組み込み魚をトリカインを添加した新鮮なE3培地で重ね、ゼブラフィッシュを蛍光顕微鏡で画像化して細菌感染の進行を評価します。病原性大腸菌の場合、最初の細菌密度はパラメシウム当たり790個の細菌であり、各パラメシウムの真空中で細菌が約2.3時間の半減期で原子を切断して分解される。獲物は特徴的な打撃行動を伴い、捕食率の決定は、各ストライキが1パラメシウムの内部化につながるという仮定に基づいています。消化後、遊離菌は前腸から中腸および後腸に移動し、捕食開始から約1〜2時間後に検出される。例えば、S-エンテニカは、主に腸内粘膜に局地的に、上皮への好中球の浸潤につながるいくつかの上皮浸潤を伴う。特定の種類の細菌を使用することは非常に危険であり、適切な個人用保護具を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。

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