Name: using the protozoan paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infections in zebrafish larvae
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer os membros do grupo Krachler para leitura crítica e comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado por um prêmio de UT sistemas STAR e o BBSRC NIH (R01AI132354).

Zebrafish cuidados, reprodução e experiências aqui descritas estão em conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelo Comitê institucional de bem-estar Animal do University of Texas Health Science Center, protocolo número AWC-16-0127.
1. o crescimento e manutenção de protozoários
<ol><li>Obter culturas de protozoários ao vivo de fontes tais como o centro de recursos internacional Zebrafish (ZIRC).</li>
	<li>De uma cultura viva e crescente, adicionar 1 mL da cultura paramécios, 1ml de uma cultura de MG1655 de e. coli (densidade óptica OD600 1.0 – 2.0) resuspended em 1 x E3 (0,29 g/L NaCl, 13 mg/L de KCl, 44 mg/L de CaCl2, 81 mg/L de MgSO4 HEPES, pH 7.0, estéril de 0,48 g/L) e 8 mL de 1 x E3 para um balão de cultura de tecidos de 10 mL. Agite levemente e em seguida armazenar a 22 ° C.</li>
	<li>Para manter uma cultura, a cada duas semanas, passagem 1 mL de uma cultura de protozoários para um balão de cultura de tecidos de 10 mL com 9 mL de meio fresco de x E3 1, contendo 108 UFC/mL de Escherichia coli MG1655 resuspended em 1 x E3.</li>
</ol>2. determinação da bacteriana Dose administrada de Zebrafish
<ol><li>
Determinar a meia-vida bacteriana dentro de Paramecium Nota: A meia-vida de bactérias dentro paramécios é determinado pelo chapeamento viável Escherichia coli recuperou paramécio, conforme descrito abaixo.<ol>
<li>Após uma incubação de 2h de bactérias (OD600 de 1.0) com paramécios a 22 ° C, combine os paramécios e cultura bacteriana de co em um tubo cónico de 50 mL, lavar os protozoários com 1 x E3 e a contagem do número de protozoários por mililitro (como descrito abaixo em passos 3.2.7 e 3.2.8).</li>
		<li>Depois de contar o número de protozoários, remover 50 µ l dos paramécios e cultura bacteriana co cada hora (para pós-exposição de 6 h) e adicionar a cada amostra em um tubo 1,5 mL.</li>
		<li>µ L de lugar 950 de surfactante não iônico de 1% (ver Tabela de materiais) em fosfato tamponado fisiológico (PBS) em cada um dos tubos de 1,5 mL e vórtice para 1 min lisar os paramécios. Executar 01:10 diluições de cada amostra usando PBS estéril como diluente (ou seja, 100 µ l em 900 µ l).</li>
		<li>Placa de 100 µ l de cada diluição em placas seletivas (meio LB tet: triptona 1 g/L, extrato de levedura 0,5 g/L, 1 g/L de NaCl, 30 tetraciclina µ g/mL) e incubar a 37 ° C, durante 16 h. No dia seguinte, contar e registrar o número de colônias bacterianas na placa (Colônia formando as unidades, CFUs) contando só as isoladas e distintas colônias individuais. Identifica uma placa com uma diluição que dá 30 – 300 CFU.</li>
		<li>Determinar a diluição fator utilizado. Por exemplo, se 1 µ l de cultura bacteriana é misturado com 99 mL de PBS estéril, isto é uma diluição de 1: 100 (0,01). Este número será o número de UFC na diluição. Realizar o cálculo abaixo, para cada ponto de tempo, para determinar o UFC na amostra original: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq1.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
		<li>Calcular e gráficos o número de viável Escherichiacoli/paramécio correspondente às horas pós exposição usando a concentração de protozoários calculada na etapa 3.3.1 e determinar o Half-Life dentro os paramécios (Figura 1).</li>
		<li>Usando o UFC número calculado para cada ponto de tempo, calcular e o número de viável e. coli por paramécio no eixo y contra a incubação de post horas no eixo x, usando a concentração de protozoários calculada na etapa 3.3.1 do gráfico. Determine o Half-Life dentro os paramécios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determine a taxa de dosagem de Half-Life bacteriana bacteriana e atacando. Nota: Para determinar a dosagem bacteriana, a meia-vida das bactérias dentro os paramécios e predando taxa de zebrafish na paramécios (ver passo 3.4) tem que ser tidos em conta.<ol>
<li>Use a seguinte fórmula para determinar a deterioração bacteriana dentro de protozoários: (1)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> Onde N0 é a quantidade inicial de bactérias por protozoários após a incubação de 2 h, Nt é a quantidade restante após o tempo t, τ é o tempo após o qual o número de bactérias viáveis tem reduzido a metade, e k é a constante de decaimento.</li>
		<li>No experimento de degradação, determinar o k constante de decaimento, usando a meia-vida bacteriana (ou seja, o tempo após o qual a quantidade de bactérias viável/paramécio tem reduzido a metade). (2)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq3.jpg" style="opacity: 0.9;"> Para a determinação do Half-Life, o termo <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq4.jpg" style="opacity: 0.9;"> e (3) <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"> ou (4)<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq6.jpg" style="opacity: 0.9;"> Nota: Com base na Figura 1, a meia-vida de e. coli em paramécios é de aproximadamente 2,3 h. Assim, usando a fórmula (4), a taxa de decaimento, k, para Escherichia coli é: (5)<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq7.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
		<li>Determinar a taxa de decaimento (k) do experimento de Half-Life para encontrar a dose de bactérias viáveis (Nt), retomada por larvas zebrafish depois predando tempo (t), onde (P) é a taxa predando ou o número de protozoários comido por um peixe por hora: (6) <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq8.jpg" style="opacity: 0.9;"> ou (7)<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq9.jpg" style="opacity: 0.9;"> Nota: Por Figura 1, a quantidade inicial de bactérias por protozoários (N0) após uma incubação de 2 h (t) é 790 CFU. Por filme 1 e Figura 2, a taxa predando (P) é de 1539.</li>
		<li>Usando esses valores para substituir na equação (7), calcular a dosagem bacteriana consumida por um zebrafish após uma incubação de 2 h como: (8)<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq10.jpg" style="opacity: 0.9;">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. food-borne infecção de Zebrafish
<ol><li>Incube as bactérias com protozoários.
	<ol>
<li>Prepare uma cultura co de paramécios e Escherichia coli MG1655 a noite antes da infecção. Combinar a 8 mL da E3 media, 1 mL de uma cultura de protozoários em curso e 1 mL de uma cultura de MG1655 de e. coli (OD600 = 1.0) resuspended em 1 x E3 em frascos de cultura de tecidos de T25. Incube os frascos em temperatura ambiente (RT) durante a noite. Para cada condição de tratamento, prepare dois balões de paramécios.</li>
		<li>Inocular a mídia de crescimento bacteriano (LB: triptona 1 g/L, extrato de levedura 0,5 g/L, 1 g/L de NaCl) com infecciosa cepa de bactérias, escolhendo uma colônia bacteriana individual de uma placa utilizando uma ansa de inoculação estéril. Incubar a 37 ° C, a cultura líquida e deixar a tremer em 110 rotações por minuto (rpm) durante a noite. Nota: Devem ser usados equipamentos de proteção individual (luvas e um casaco de laboratório) e instalações de nível 2 de segurança biológica devem ser usadas quando a manipulação de agentes infecciosos.</li>
		<li>No dia seguinte, medir a OD600 da cultura durante a noite. Calcule o volume de cultura necessária para alcançar uma OD600 de 1 quando resuspended em 11 mL de mídia.</li>
		<li>Colha o volume de bactérias do passo 3.1.2 através de centrifugação a 6.000 x g durante 5 min, um volume para cada frasco de paramécios. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o bacteriana em 1 mL de E3 media.</li>
		<li>Opcionalmente, pre-manche as bactérias com um corante fluorescente.<ol>
<li>Adicione 1 µ l de mancha bacteriana de FM 4-64FX (5 mg/mL de solução). Cobrir o tubo com papel alumínio para proteger de fotobranqueamento e incubar a rotação mais completa em RT por 15 min.</li>
			<li>Remover o corante em excesso por lavagem com 1 x E3: bactérias através de centrifugação a 6.000 x g durante 1,5 min de pelotas e, em seguida, resuspenda o pellet em 1 mL de mídia E3. Repita a etapa de lavagem duas vezes.</li>
			<li>Colheita manchada de bactérias através de centrifugação a 6.000 x g por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o bacteriana em 1 mL de E3 media.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicione 1 mL das suspensões bacterianas para cada um dos dois frascos de paramécios frescos. Incube a RT por 2 h. Nota: Se trabalhar com bactérias coradas, incube no escuro em RT por 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavagem de bactérias/paramécios co-cultura.
	<ol>
<li>Combine o conteúdo de ambos os frascos de co-cultura paramécios/bactérias em um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar as amostras a 300 x g a 15 ° C durante 10 min. Verifique se o centrifugador é pre-cooled antes desta etapa.</li>
		<li>Cerca de 10 mL do sobrenadante E3 com uma pipeta sorológica de remover e adicionar cerca de 10 mL de fresco 1 x E3 para o tubo cônico. Nota: Durante todas as etapas de lavagem, é essencial para ser muito rápido ao remover o sobrenadante, como os paramécios começará a nadar fora a pelota. Girar e remover sobrenadante de um tubo de cada vez para garantir a manipulação rápida o suficiente para esta etapa e evitar a perda de protozoários no sobrenadante.</li>
		<li>Girar as amostras através de centrifugação a 300 x g a 15 ° C por 5 min. remover cerca de 10 mL do sobrenadante E3 com uma pipeta sorológica e adicionar cerca de 10 mL de fresco 1 x E3 para o tubo cônico. Repita duas vezes.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 300 x g a 15 ° C por 5 min. remover cerca de 10 mL do sobrenadante E3, tomando cuidado para não perturbar a pelota.</li>
		<li>Resuspenda o pellet nos restante 10 mL da E3 media e 500 µ l da suspensão de transferência para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Pelota a 500 µ l de paramécios por centrifugação a 300 x g por 5 min contar o número de protozoários.</li>
		<li>Retire a amostra de 500 µ l 400 µ l do sobrenadante a E3. Adicionar 20 µ l de solução de formaldeído de 36,5% para os restantes 100 µ l de paramécios e ressuspender delicadamente e incubar durante 5 min à 22 ° C. Nota: Esta etapa mata os paramécios para permitir a contagem.</li>
		<li>Medir o volume total real usando a pipeta e registro. Dilua o paramécios suspensão 1:1 v/v com solução de azul de Tripan 0,4%.</li>
		<li>Use um contador de célula ou hemocytometer para contar o número de mortos paramécios/mL. Nota: Devido a etapa de fixação prévia, a maioria dos paramécios será mortos neste momento, mas este número refletir o número de protozoários ao vivo para a experiência de incubação co. Os autores não encontraram morte paramécios significativo devido à incubação co bacteriana, então isso pode ser desconsiderado como um fator aqui.</li>
	</ol></li>
	<li>Co incube paramécios e zebrafish as larvas.
	<ol>
<li>Calcule a concentração de protozoários: <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq11.jpg" style="opacity: 0.9;"> <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq12.jpg"> Nota: Este cálculo dá a concentração de protozoários no tubo cónico de 50 mL do passo 3.2.5.</li>
		<li>Calcule o volume de lavado paramécios necessários para uma concentração de 2 x 105 paramécios/mL em um volume final de 3 mL de E3. Nota: A concentração de protozoários pode ser ajustada baseado na dosagem bacteriana desejada, sujeita a otimização.</li>
		<li>Anestesiar o zebrafish adicionando tricaina em 100 mM Tris pH 8.0 para uma concentração final de 100 mg/L. transferência 10 zebrafish para cada poço de uma placa em um volume total de 3 mL de E3 fresco contendo a concentração adequada de paramécios (calculado na etapa 6 3.3.2). Certifique-se de transferir as larvas em uma quantidade mínima de líquido, para garantir que eles recuperar da anestesia no poço destinatário.</li>
		<li>Incube a 30 ° C, durante 2 h em uma incubadora diurna sob condições de luz do dia, para garantir condições de iluminação ideal para rapinar.</li>
		<li>Lave o zebrafish pelo menos 5 vezes pela transferência de peixe para um novo bem contendo 3 mL de E3 fresco contendo metanosulfonato de 100 mg/L de cada vez. Nota: Não tente omitir a tricaina durante a etapa de lavagem. Transferência de larvas móveis sem anestesia aumenta o risco de danos e sofrimento para o animal.</li>
		<li>Opcionalmente, preparar zebrafish para a imagem latente por incorporação zebrafish em 3 mL de agarose de baixo ponto de fusão de 1% em uma parede preto 6 placa: agarose de baixo ponto de fusão é feita em 1xE3 e aquecida no microondas. Depois de derretido, adicione tricaina a uma concentração final de 160 mg/mL. Posição o peixe sob um estereomicroscópio, usando um gel cortado carregando ponta, certificando-se de que a cabeça está na esquerda e a cauda é à direita (Figura 3). Aguarde 5 minutos para o agarose definir e, em seguida, o peixe incorporado com 1 x E3 contendo metanosulfonato de 160 mg/mL para a imagem latente de sobreposição.</li>
	</ol></li>
	<li>Determine a taxa rapinando. Nota: Nenhuma experiência separada precisa ser configurado para determinar a taxa rapinando. Pelo contrário, isso pode ser feito durante a etapa 3.3.4, conforme descrito abaixo.<ol>
<li>Durante a etapa 3.3.4, Ver os zebrafish rapinando em uma microscópio estereoscópico e captura imagens de vídeo a captura de presas.</li>
		<li>Marca as imagens de vídeo. Captura de presas é caracterizada por marcante de zebrafish em direção a presa. Contar cada greve como evento de captura uma presa, embora esta seja apenas uma aproximação (ver discussão).</li>
		<li>Calcule o número médio de eventos de captura de presas por hora de vários clipes de vídeo, cada um representando uma larva de zebrafish diferentes (Figura 2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo básico descrito aqui foi otimizado para a patogenicidade de e. colie foi adaptado com sucesso para outras espécies bacterianas, incluindo a Salmonella typhi e Vibrio cholerae. Para algumas espécies que não a colonizar o intestino de zebrafish após imersão de banho, incluindo algumas estirpes de typhi Salmonella e alguns anaeróbios, infecção de origem alimentar conforme descrito aqui pode ser usada para estabelecer com sucesso a colonização. Em comparação com microgavage, que também é usado para estabelecer elevados encargos bacterianos no trato intestinal larval, infecção de origem alimentar é tecnicamente menos desafiador e requer equipamentos menos especializados. No entanto, os parâmetros críticos devem ser otimizados para as espécies bacterianas e as tensões para ser usado. Tais fatores incluem a densidade bacteriana e paramécio para a etapa de co-cultura de bactérias-paramécio: se bacteriana números dentro paramécios são baixos, isto pode ser melhorado, aumentando a densidade bacteriana na etapa de co-cultura. Algumas espécies bacterianas podem causar danos ao host paramécio, e isto deve ser avaliado por microscopia.
Outro fator importante neste protocolo é a captura de presas por zebrafish. A taxa predando conforme descrito aqui é baseada no pressuposto de que cada captura de presas strike resultados na ingestão de um paramécio. Altas densidades de paramécios por peixes são usadas no protocolo para garantir altas taxas rapinando. No entanto, a captura de presas é dependente da densidade de protozoários no sistema, e em culturas muito diluído paramécio, predando taxas podem ser tão baixas quanto 13 – 15 paramécios por hora21,22. Uma limitação é que taxas de captura de presas também são fortemente dependentes em condições de iluminação e no escuro, as taxas de captura são 80% mais baixos do que em condições de luz21 e isso devem ter em conta quando a criação de experiências. Se os tempos de exposição a presa precisa ser expandida para otimizar a colonização, consideração deve ser dada à exposição secundária a bactéria através de fezes. Nas condições descritas acima – 2 h de exposição de rapina – esta exposição é negligenciável, desde que o tempo de passagem do intestino de bactérias é mais de 1h e a concentração de bactérias no veículo é muito maior do que nas fezes. No entanto, se o tempo de exposição de rapina é significativamente maior, isto pode tornar-se um fator significativo.
Controlos adequados devem ser incluídos no presente protocolo, incluindo a colonização do zebrafish seguindo alimentação com paramécios contendo não-patogênicas de Escherichia coli MG1655. Se várias estirpes bacterianas são comparadas pela sua capacidade de colonizar o zebrafish host, é importante testar se seus Half-Life dentro paramécios é comparável. Mutações bacterianas, incluindo aqueles comprometer a integridade da parede celular ou sensoriamento de ácido, podem comprometer a estabilidade bacteriana dentro de paramécios. Em tais casos, zebrafish alimentação tem que ser ajustado para dar conta das diferenças na dosagem.
O protocolo descrito aqui pode ser usado para investigar a colonização bacteriana e suas consequências, incluindo por imagem colonização bacteriana de zebrafish como descrito acima, bem como determinando CFU por zebrafish de tecido homogeneizado3, ou investigando a mortalidade e a morbidade associada a infecção. Idealmente, para visualização de bactérias, cepas bacterianas expressando proteínas fluorescentes, tais como mCherry ou proteína fluorescente vermelha (RFP) devem ser usadas. Isto permitirá a visualização do crescimento das populações bacterianas. Se a estirpe bacteriana não é geneticamente tractable ou o uso da expressão da proteína fluorescente é impedido por outras razões, bactérias podem ser coradas com um corante fluorescente, como FM 4-64FX, antes da cultura co com protozoários. Ao usar o protocolo descrito aqui, não diminui o brilho da tintura co-cultura com protozoários e bactérias coradas são claramente visíveis no intestino zebrafish. No entanto, a tintura será diluída ao longo do tempo deve ocorrer de significativa proliferação bacteriana dentro do host de zebrafish. Em ambos os casos, vermelho fluorescente bactérias são preferíveis sobre bactérias fluorescentes-verde, desde autofluorescência de tecido pode ser mais elevada no verde do que no canal vermelho.
Verificou-se que o presente protocolo pode ser adaptado para aeróbios e microaerofílicas espécies bacterianas. Pode ser possível adaptá-lo para a alimentação de esporos e espécies de fungos, embora isto continua a ser testada experimentalmente.

Compartilhamento de zebrafish morfologicamente e funcionalmente conservada características com mamíferos, incluindo linhagens granulocíticos (por exemplo, os neutrófilos), monócitos/macrófagos-células, receptores Toll-like, citocinas pró-inflamatórias e peptídeos antimicrobianos1 . O trato intestinal no zebrafish é totalmente desenvolvido em 6 dias pós fertilização (dpf) e mostra a conservação morfológica e funcional com o trato gastrointestinal dos mamíferos, tais como Regulamento transcriptional conservado em células epiteliais intestinais 2. isso faz com que um excelente modelo para a colonização microbiana intestinal e patogênese zebrafish. Uma ampla gama de bactérias entéricas tem sido estudada no modelo zebrafish, incluindo enterohemorrhagic Escherichia coli3, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, o zebrafish microbiota7,8e o papel dos probióticos na imunidade intestinal9. Uma vantagem distinta do zebrafish modelo é que ele é colonizado por muitos micróbios sem interromper a microbiota endógena, que permite a investigação de comportamento microbiano no contexto de populações microbianas mistas3, 6. atualmente, a maioria dos modelos de zebrafish de colonização gastrointestinal e doença dependem da administração de micróbios por imersão de banho, onde o zebrafish são incubadas em uma suspensão bacteriana para uma quantidade específica de tempo10. No entanto, isso torna difícil determinar a dose exata de bactérias administradas e leva à colonização limitada com alguns micróbios, particularmente com bactérias não-patogênicas. Alternativamente, uma suspensão bacteriana é administrada a pescar através de de gavagem oral11, mas isso é tecnicamente desafiador e limitado a larvas mais velhas e adultos.
Este protocolo descreve o uso do unicelulares protozoários Paramecium caudatum como um veículo para entrega de origem alimentar de micróbios para o trato gastrointestinal de larvas de peixe-zebra. Paramécios são fácil e barato para manter e são capazes de alimentando-se de uma grande variedade de micróbios, incluindo algas, fungos e bactérias, que eles interiorizar através de um sulco oral ciliadas12,13,14. Uma vez internalizados, bactérias realizam-se em vacúolos, que eventualmente acidificar e conteúdo são degradados ao longo de um período de tempo de várias horas15. Zebrafish larval capturar protozoários como presas naturais logo após a eclosão, cerca dpf de 3 – 4, dependendo da temperatura de16e levá-los com alta eficiência. O processo de captura de presas leva em média 1.2 s da detecção de capturar17e paramécios capturados são digeridos rapidamente no zebrafish foregut, tal que interiorizado bactérias viáveis são liberadas para o trato intestinal3. Como resultado, os paramécios podem ser usados como um método rápido e fácil para entregar uma dose alta e consistente de bactérias no trato gastrointestinal de zebrafish. As bactérias entregues também podem ser transformadas para expressar uma proteína fluorescente, tais como mCherry, conforme descrito aqui, ou, no caso de bactérias geneticamente intratáveis, podem ser pre-manchadas com uma tintura fluorescente para permitir a visualização dentro do trato gastrointestinal.
Este protocolo descreve a entrega de origem alimentar de enteropatogênica Escherichia coli (enterohemorrhagic Escherichia coli [EHEC] e aderente invasiva Escherichia coli [AIEC]) e o SSP de Salmonella enterica Typhimurium. Tanto a patogenicidade de e. coli e S. typhimurium são transmitidas através da rota fecal-oral18,19e podem ser adquirida através de contaminados alimentos como carne, legumes e laticínios. Usando p. caudatum como um veículo, e. coli e S. typhimurium colonizam com sucesso as larvas de zebrafish dentro de 30 a 60 min de incubação co com o veículo paramécio. A carga bacteriana alcançada é robusta o suficiente para visualizar a colonização e determinar a carga por chapeamento do tecido homogenates.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Paramecium caudatum, live</td>
			<td style="width:133px;">Carolina</td>
			<td style="width:123px;">131554</td>
			<td style="width:411px;">no not store growing cultures below room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">0.4% Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T8154-20ML</td>
			<td>liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td>276855-100ML</td>
			<td>store in a solvent safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Escherichia coli, MG1655</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">ATCC 700926</td>
			<td>can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FM 4-64FX stain</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">F34653</td>
			<td>aliquot and store frozen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8775-4X25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">LB Broth</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">L3397-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">87128-25G</td>
			<td>toxic, irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">hemocytometer or cell counter</td>
			<td style="width:133px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:133px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">table-top centrifuge</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">microwave</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">rotator wheel</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">heated shaking incubator</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">aquatics facilities</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">breeding tanks</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the protozoan paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infections in zebrafish larvae

Devido a sua transparência, rastreabilidade genética e facilidade de manutenção, peixe-zebra (Danio rerio) tornaram-se um modelo de vertebrados utilizado para doenças infecciosas. Zebrafish larval naturalmente predar os unicelulares protozoários Paramecium caudatum. Este protocolo descreve o uso de p. caudatum como um veículo para a infecção de origem alimentar em zebrafish larval. P. caudatum internalizar uma vasta gama de bactérias e células bacterianas permanecem viáveis durante várias horas. Zebrafish então predar p. caudatum, a carga bacteriana é lançada no foregut após digestão do veículo paramécio e as bactérias colonizam o trato intestinal. O protocolo inclui uma descrição detalhada da manutenção de paramécios, carregando com bactérias, determinação da degradação bacteriana e dose, assim como a infecção de zebrafish, alimentando com protozoários. A vantagem deste método de infecção de origem alimentar é que estreitamente imita o modo de infecção observada na doença humana, leva à colonização mais robusta em relação aos protocolos de imersão e permite o estudo de uma ampla gama de patógenos. Infecção de origem alimentar no zebrafish modelo pode ser usada para investigar a expressão de gene bacteriano dentro do hospedeiro, interações patógeno-hospedeiro e características de patogenicidade, incluindo a morbilidade, a localização, a difusão e a carga bacteriana.

Paramecium caudatum prontamente internaliza uma vasta gama de bactérias em vacúolos de armazenamento. A densidade bacteriana intracelular depende da densidade de bactérias e protozoários em cultura co, bem como as espécies bacterianas utilizadas. Ao longo do tempo, os vacúolos acidificam e degradação bacteriana ensues. A taxa de degradação tem de ser individualmente determinado para todas as estirpes utilizadas. Para patogênicas de Escherichia coli, a densidade bacteriana inicial é 790 bactérias /paramécioe bactérias são degradados com uma meia-vida de aproximadamente 2,3 h (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig1.jpg"> Figura 1: determinação do Half-Life bacteriana em paramécios. (A) seguir 2 h de incubação co com infecciosas e. coli, p. caudatum foi lavado e transferido para meio sem bactérias. Nos pontos de tempo indicado, números de viável Escherichia coli células foram determinadas pelo chapeamento de diluição em ágar seletivo. Os resultados são meios ± erro padrão da média (SEM; n = 3). (B) imagem típica do paramécio carregando internalizada bactérias, com campo claro (Bi), bactérias fluorescentes (Bii) e fundiu-se canais (Biii). Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Além disso, o zebrafish rapinando taxa, ou seja, a taxa na qual zebrafish internalizar paramécios carregados de bactérias após incubação co, foi estudada. Zebrafish larval começam a caçar e capturar presas vivas de 5 dpf20, embora se verificou que, quando levantou a 30 ° C, o desenvolvimento larval é acelerado e animais Exibir comportamento predando de dpf 4. Rapinando é acompanhada por uma característica marcante do comportamento20 (Figura 2A), e a determinação da taxa predando baseia-se no pressuposto de que cada golpe leva à interiorização de um paramécio, embora isso só pode ser considerado um aproximação (ver discussão). Baseado em observações descritas neste documento de rapinar zebrafish larvas, a taxa de absorção de paramécios é aproximadamente 1.539 por h (Figura 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig2.jpg"> Figura 2: determinação da taxa predando zebrafish. (A) imagens de um vídeo predando, mostrando um zebrafish larvas (5 dpf) predando paramécios carregando bactérias fluorescentes. Tempo em [segundos]. A seta indica o principal eixo de circulação durante a greve. (B) a quantificação da taxa predando (ingestão de protozoários por hora), com base em n = 10 vídeos tomadas ao longo do tempo de exposição completa 2 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Após internalização dos protozoários, o zebrafish eficientemente degrada a rapina do foregut, liberando bactérias infecciosas no sistema digestivo. Conforme descrito neste documento, a degradação de paramécios procede rapidamente, e bactérias gratuito podem ser detectadas no trato intestinal dentro de 30 minutos de rapinar. Livre de bactérias, em seguida, mover-se do foregut para o intestino médio e posterior, onde eles são detectados cerca de 1 – 2 h após o início da pinça (Figura 3). Persistência bacteriana no intestino depende da espécie e dose, mas varia de h vários para vários dias no caso de e. coli e S. typhi. S. typhi localiza-se principalmente na mucosa intestinal, com alguma invasão epitelial (Figura 3D), levando à infiltração de neutrófilos no epitélio (Figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig3.jpg"> Figura 3: colonização de zebrafish com bactérias. Zebrafish no dpf 5 foram deixados não infectado (A) ou colonizados com mCherry expressando (B) e. coli ou (C) S. enterica. Experimentos de infecção podem ser realizados em linhas transgénicas ou tipo selvagem (A e B) peixe (por exemplo, a linha Tg (MPO::EGFP) eu114 expressando verdes fluorescentes neutrófilos mostrados em (C). A abertura retal é marcada por uma flecha. (D) maior ampliação da seção intestinal de toda a montagem incorporadas larvas infectadas com infecção por Salmonella typhi . Azul (Di) = Hoechst marcando núcleos, roxo (Dii) = faloidina marcando F-Actina, vermelho (Diii) = Salmonella, mesclagem (Div). Barra de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58949/58949mov1.jpg"> Filme 1: imagens de vídeo de captura presas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/PreyCapture.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

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Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Peixe-zebra (Danio rerio) estão se tornando vertebrado modelo animal utilizado para colonização microbiana e patogénese. Este protocolo descreve o uso do protozoário Paramecium caudatum como um veículo para a infecção de origem alimentar em larvas de peixe-zebra. P. caudatum prontamente internaliza as bactérias e obter retomadas por larval zebrafish através de comportamento predando natural.

Usando o protozoário Paramecium caudatum como um veículo para infecções de origem alimentar em larvas de Zebrafish

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da microbiologia sobre a dinâmica da colonização e infecção por microrganismos no trato gastrointestinal. As principais vantagens dessa técnica são que ela é mais representativa de infecções transmitidas por alimentos em humanos e que reduz danos potenciais nos tecidos em peixes em comparação com o gavage oral. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de lavagem podem ser difíceis de executar devido à natureza altamente motil da paramecia.De uma cultura viva em crescimento, adicione um mililitro de cultura paramecium e um mililitro de uma cultura e-coli MG1655 a um frasco de cultura de tecido de dez mililitros contendo oito mililitros de meio E3. Gire levemente o frasco antes de colocá-lo a 22 graus Celsius, deslizando um mililitro da co-cultura em um novo frasco de cultura de tecido de dez mililitros contendo nove mililitros de médio E3 fresco, complementado com 108 unidades formadoras de colônias por mililitro de e-coli MG1655, a cada duas semanas. Para determinar a meia-vida bacteriana dentro de um paramecium, conte o número de paramécia de uma densidade óptica de 600 bactérias paramécia co-cultura e adicione uma alíquota de 50 microliter aliquot de supernascer a um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro a cada hora durante seis horas.Adicione 950 microliters de um por cento de surfactante não iônico em PBS aos tubos. E lise a paramécia em cada amostra com um minuto de vórtice, em seguida, faça uma em cada dez diluições de cada amostra em PBS estéril. E placa 100 microliters de cada diluição em placas seletivas para uma incubação de 16 horas a 37 graus Celsius.No dia seguinte, conte apenas as colônias individuais isoladas e distintas para determinar o número de colônias bacterianas na placa. E identificar uma placa com uma diluição que rende 30-300 unidades formadoras de colônias. Na véspera da infecção, colete um volume de bactérias de uma densidade óptica de 600 cultura por tratamento por centrifugação.E suspenda as pelotas em um mililitro de E3 médio por tubo. Em seguida, adicione um microliter de uma mancha bacteriana apropriada a cada suspensão bacteriana. E proteja os tubos de branqueamento fotográfico com papel alumínio.Antes de incubar as amostras de bactérias com rotação final por 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, lave as bactérias duas vezes em um grande volume de meio E3 para remover o excesso de corante. E suspenda as pelotas em um mililitro de e3 médio fresco por tubo.Em seguida, adicione um mililitro de suspensão bacteriana a cada um dos dois frascos de paramecia fresca por condição para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente. Puxe o conteúdo de ambos os frascos por condição em tubos cônicos individuais de 50 mililitros. E pelotar as amostras por centrifugação.Usando uma pipeta estéril, substitua aproximadamente dez mililitros do supernatante E3 em cada tubo por dez mililitros de meio E3 fresco para 3 lavagens por centrifugação. Após a última lavagem, remova aproximadamente dez mililitros dos supernacantes E3, tomando cuidado para não interromper as pelotas, e suspenda as pelotas nos dez mililitros restantes do meio E3. Transfira 500 microliters de cada suspensão para tubos individuais de microcenrifus de 1,5 mililitro e pelota a paramecia por centrifugação.Descarte 400 microliters dos supernantes, e adicione 20 microliters de 36,5% de solução de formaldeído aos 100 microliters restantes de paramécia com tubulação suave. Após cinco minutos em temperatura ambiente, meça o volume total real em cada tubo por pipeta antes de contar o número de paramecia morta por mililitro. Para infecção transmitida por alimentos do peixe-zebra, diluir as amostras de paramecia para duas vezes dez a cinco paramecia por mililitro de concentração média E3.E adicione 3 mililitros de cada cultura paramécia a um poço de 6 placas de poço por condição. Em seguida, transfira dez zebrafish anestesiados para cada poço em um volume mínimo de líquido. E incubar as co-culturas por duas horas a 30 graus Celsius em uma incubadora diurna sob condições de luz do dia.Para determinar a taxa de presas, visualize o peixe-zebra alimentado sob um microscópio estéreo enquanto adquire imagens de vídeo da captura da presa. A captura de presas é caracterizada pelo golpe de um zebrafish em direção à presa. Estima-se que cada ataque seja um evento de captura de presas.No final da incubação, lave o zebrafish em 5 poços diferentes contendo 3 mililitros de e3 médios frescos complementados com 100 miligramas por litro de tricaine por poço. E incorporar cada zebrafish em 3 mililitros de 1% de baixa derretimento surgiu em uma placa de seis poços de poço preto. Quando todos os peixes tiverem sido incorporados, coloque a placa sob um microscópio estéreo e use uma ponta de carregamento de gel cortado para ter certeza de que as cabeças estão à esquerda e as caudas estão à direita em cada campo de observação.Aguarde por 5 minutos para que a agarose se estaque, em seguida, sobreponha o peixe embutido com meio E3 fresco complementado com tricaine, e imagem o peixe-zebra em um microscópio fluorescente para avaliar o progresso das infecções bacterianas. Para e-coli patogênico, a densidade bacteriana inicial é de 790 bactérias por paramecium, e as bactérias são degradadas dentro das vacuoles de cada átomo cortado de paramecium com uma meia-vida de aproximadamente 2,3 horas. A presa é acompanhada por um comportamento marcante característico, e a determinação da taxa de presas baseia-se no pressuposto que cada ataque leva à internalização de 1 paramécio.Após a digestão, as bactérias livres se movem do foregut para o intestino médio e posterior, onde são detectadas aproximadamente 1 a 2 horas após o início da caça. S-enterica, por exemplo, localiza principalmente na mucosa intestinal com alguma invasão epitelial levando à infiltração de neutrófilos no epitélio. Não se esqueça que trabalhar com certos tipos de bactérias pode ser extremamente perigoso, e que precauções como usar o equipamento de proteção individual adequado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

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