Name: using the protozoan paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infections in zebrafish larvae
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить членов группы Krachler для критических чтении и комментариев на рукопись. Эта работа финансировалась на UT систем STAR award, СИББН и низ (R01AI132354).

<ol>
	<li>Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+to+Salmonella+Typhimurium,+a+model+enteric+pathogen.">Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen.</a> Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).</li><li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells.">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).</li><li>Stones, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+(Danio+rerio)+as+a+Vertebrate+Model+Host+To+Study+Colonization,+Pathogenesis,+and+Transmission+of+Foodborne+Escherichia+coli+O157.">Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Vibrio+cholerae+enterotoxicity+in+a+zebrafish+infection+model.">Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).</li><li>Logan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+can+modulate+host+intestinal+mechanics+to+displace+gut+bacterial+symbionts.">The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).</li><li>Howlader, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+novel+model+for+non-typhoidal+Salmonella+pathogenesis,+transmission+and+vaccine+efficacy.">Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy.</a> Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).</li><li>Troll, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+promote+secretory+cell+determination+in+the+intestinal+epithelium+by+modulating+host+Notch+signaling.">Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling.</a> Development. 145 (4), (2018).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Gut+Motility+Promotes+Competitive+Exclusion+within+a+Model+Intestinal+Microbiota.">Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota.</a> PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).</li><li>Rendueles, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+zebrafish+model+of+oro-intestinal+pathogen+colonization+reveals+a+key+role+for+adhesion+in+protection+by+probiotic+bacteria.">A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria.</a> PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).</li><li>Varas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+induces+cloacitis-like+symptomsin+zebrafish+larvae.">Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae.</a> Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).</li><li>Runft, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+natural+host+model+for+Vibrio+cholerae+colonization+and+transmission.">Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).</li><li>Meier, R., Wiessner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+algae-free+Paramecium+bursaria+with+symbiotic+Chlorella+sp.+Isolated+from+green+paramecia:+I.+Effect+of+the+incubation+period.">Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period.</a> European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).</li><li>Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phagotrophy+in+the+mixotrophic+ciliate+Paramecium+bursaria+using+GFP-expressing+yeast+cells.">Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells.</a> FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliate+Paramecium+is+a+natural+reservoir+of+Legionella+pneumophila.">Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila.</a> Scientific Reports. 6, 24322 (2016).</li><li>Bragg, A. N., Hulpieu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+of+Demonstrating+Acidity+of+Food+Vacuoles+in+Paramecium.">A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium.</a> Science. 61 (1580), 392 (1925).</li><li>Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prey+capture+by+larval+zebrafish:+evidence+for+fine+axial+motor+control.">Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control.</a> Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).</li><li>Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+guided+gradation+of+prey+capture+movements+in+larval+zebrafish.">Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish.</a> Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).</li><li>Megraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+Helicobacter+pylori:+faecal-oral+versus+oral-oral+route.">Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).</li><li>Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+enteropathogenic+and+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+pathogenesis.">A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).</li><li>Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prey+capture+behavior+evoked+by+simple+visual+stimuli+in+larval+zebrafish.">Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).</li><li>Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+prey+capture+in+larval+zebrafish+is+controlled+by+identified+reticulospinal+neurons+downstream+of+the+tectum.">Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).</li><li>Westphal, R. E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+locomotor+maneuvers,+and+improving+sensory+capabilities,+give+rise+to+the+flexible+homing+strikes+of+juvenile+zebrafish.">Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Основной протокол, описанные здесь был оптимизирован для патогенных кишечной палочкии был успешно адаптирован для других бактериальных видов, включая Salmonella enterica и Vibrio cholerae. Для некоторых видов, которые не заселять кишечник данио рерио, после погружения Ванна, включая некоторые штаммы Salmonella enterica и некоторых анаэробов пищевого заражения как описано здесь может использоваться для успешного создания колонизации. По сравнению с microgavage, который также используется для создания высокой бактериальной бремя в личиночной кишечного тракта, пищевого заражения является технически менее сложной и требует менее специализированного оборудования. Однако критические параметры должны быть оптимизированы для бактериальных видов и штаммов, которые будут использоваться. Такие факторы включают плотности бактериальных и Парамеции для этапа совместного культуры бактерий Парамеции: если бактериальная чисел в пределах paramecia являются низкими, это может быть улучшено путем увеличения бактериальной плотности на шаге Сопредседатель культуры. Некоторые виды бактерий может привести к повреждению Парамеции хост, и это должно оцениваться по микроскопии.
Еще одним важным фактором в этот протокол является захват хищных рыбок данио. Хищными ставка как описано здесь основан на предположении, что каждый захват добычу забастовку результаты в пищу один Парамеции. Высокая плотность paramecia за рыба используются в протоколе для обеспечения высоких хищными. Однако захвата добычи зависит от плотности paramecia в системе, и в очень разбавленных Парамеции культур, хищными тарифы могут быть как низко как paramecia 13 – 15 за час21,22. Ограничение заключается в том, что жертвами захвата ставки также сильно зависит от условий освещения и в темноте, захват ставки 80% ниже, чем в условиях освещенности21 и это должно приниматься во внимание при настройке экспериментов. Если воздействия раз жертвой должны быть расширен для оптимизации колонизации, рассмотрение должно отдаваться вторичного воздействия бактерий через фекалии. В условиях, описанных выше – 2 h добычу воздействия – это воздействие является незначительным, поскольку время прохода кишки бактерий является более чем 1 час и концентрация бактерий в транспортное средство намного выше, чем в фекалиях. Однако если время экспозиции добычу значительно увеличивается, это может стать существенным фактором.
Соответствующие элементы должны быть включены в этот протокол, включая колонизации данио рерио после кормления с paramecia, содержащие непатогенные E. coli MG1655. Если несколько бактериальных штаммов сравниваются для их способность колонизировать узел данио рерио, важно проверить ли их полураспада в пределах paramecia сопоставимы. Бактериальные мутации, в том числе ущерба целостности клеточной стенки или кислоты зондирования, может скомпрометировать бактериальных стабильности в paramecia. В таких случаях данио рерио кормления должен корректироваться для учета различий в дозировке.
Протокол, описанные здесь может использоваться для изучения бактериальной колонизации и его последствий, в том числе изображений бактериальной колонизации данио рерио, как описано выше, а также определения кое за данио рерио из ткани огневки3, или расследования, связанные с инфекцией заболеваемости и смертности. В идеале для бактериальных визуализации, должны использоваться бактериальных штаммов, выражая флуоресцентных белков, таких как mCherry или красный флуоресцирующий белок (ППП). Это позволит визуализации растущего бактериальных популяций. Если бактериальный штамм не генетически шансов справиться с возникающими или по другим причинам, исключается использование флуоресцентных белков, бактерии могут быть запятнано с Люминесцентную краску, такие как FM 4-64FX, до их культуры совместно с paramecia. При использовании протокола описаны здесь, Сопредседатель культуры с paramecia не уменьшить яркость краски и окрашенных бактерии в кишечнике данио рерио хорошо видны. Однако краска будет разбавлен со временем произойдет значительное распространение бактериальной в узле данио рерио. В любом случае красный люминесцентные бактерии являются предпочтительнее над Грин люминесцентные бактерий, поскольку аутофлюоресценция ткани может быть выше в зеленом чем красного канала.
Было установлено, что этот протокол может быть адаптирован для аэробных и микроаэрофильных бактерий видов. Это может быть возможным адаптировать его для кормления споры и грибковых видов, хотя это по-прежнему быть проверены экспериментально.

Данио рерио доля морфологически и функционально сохранены функции с млекопитающих, в том числе гранулоцитарного линий (например, нейтрофилов), моноцитов/макрофагов как клетки, Толл подобные рецепторы, провоспалительных цитокинов и противомикробные пептиды1 . Кишечного тракта в zebrafish полностью разработана в 6 дней поста оплодотворение (dpf) и показывает морфологических и функциональных сохранения с млекопитающих желудочно-кишечного тракта, например сохранены регуляцию в эпителиальных клетках кишечника 2. это делает данио рерио отличную модель для кишечного микробного колонизации и патогенеза. Широкий спектр кишечными микробами была изучена в zebrafish модели, включая энтерогеморрагические Escherichia coli3, холерный вибрион4,5, Salmonella enterica6, Данио рерио микробиоты7,8и роль пробиотиков кишечного иммунитета9. Явное преимущество в zebrafish модель является, что он является колонизировали многие микробы не нарушая эндогенного микрофлору, которая позволяет расследования микробной поведения в контексте смешанных микробных популяций3, 6. в настоящее время, большинство моделей данио рерио желудочно-кишечного тракта колонизации и болезней полагаются на администрации микробов путем погружения Ванна, где данио рерио инкубируют в бактериальных подвеска на определенное время10. Однако это делает его трудно определить точную дозу бактерий осуществляется и приводит к ограниченным колонизации с некоторых микробов, особенно с непатогенные бактерии. Кроме того бактериальный подвеска администрируется рыбы через пероральная затравка11, но это технически сложной и ограничивается старшего возраста личинок и взрослых рыб.
Этот протокол описывает использование одноклеточных простейших Парамеции туфелька в качестве транспортного средства для доставки пищевых микробов желудочно-кишечного тракта у рыбок данио личинок. Paramecia легко и дешево поддерживать и способны кормления на широкий спектр микробов, в том числе водорослей, грибков и бактерий, которые они усвоить через мерцательного устные паз12,,1314. После интернализации, бактерии проводятся в вакуолей, который в конечном итоге подкислять и содержание деградировавших течение времени нескольких часов15. Личинок данио рерио захватить paramecia в качестве естественной добычей вскоре после вылупления, около dpf 3 – 4, в зависимости от температуры16и принимать их с высокой эффективностью. Процесс захвата добычи занимает в среднем 1,2 s от обнаружения захватить17, и захватили paramecia быстро перевариваются в zebrafish Передняя кишка, таким образом, что внутреннюю жизнеспособные бактерии попадают в желудочно-кишечном тракте3. В результате paramecia может использоваться как быстрый и простой метод для доставки высокого и последовательного дозу бактерий в желудочно-кишечного тракта у рыбок данио. Поставленный бактерии могут быть преобразованы либо выразить флуоресцентного белка, такие как mCherry, как описано здесь, или, в случае генетически неразрешимыми бактерии, они могут быть предварительно окрашенные с Люминесцентную краску, чтобы позволить визуализации в рамках желудочно-кишечного тракта.
Этот протокол описывает пищевого доставки энтеропатогенные E. coli (энтерогеморрагические E. coli [ЭГКП] и сторонником инвазивной кишечной палочки [AIEC]) и Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Патогенной кишечной палочки и S. typhimurium передаваемых через фекально оральным механизмом передачи18,19и может быть приобретенных через загрязненные продукты питания, таких как мясо, овощи и молочные продукты. С помощью P. туфелька как транспортное средство, E. coli и S. typhimurium успешно колонизировать данио рерио личинок в течение 30 – 60 минут совместного инкубации с Парамеции транспортного средства. Достигнутые бактериальных бремя является достаточно прочным, чтобы визуализировать колонизации и определить бремя покрытия гомогенатах ткани.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Paramecium caudatum, live</td>
			<td style="width:133px;">Carolina</td>
			<td style="width:123px;">131554</td>
			<td style="width:411px;">no not store growing cultures below room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">0.4% Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T8154-20ML</td>
			<td>liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td>276855-100ML</td>
			<td>store in a solvent safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Escherichia coli, MG1655</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">ATCC 700926</td>
			<td>can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FM 4-64FX stain</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">F34653</td>
			<td>aliquot and store frozen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8775-4X25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">LB Broth</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">L3397-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">87128-25G</td>
			<td>toxic, irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">hemocytometer or cell counter</td>
			<td style="width:133px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:133px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">table-top centrifuge</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">microwave</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">rotator wheel</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">heated shaking incubator</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">aquatics facilities</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">breeding tanks</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the protozoan paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infections in zebrafish larvae

За счет их прозрачности, отслеживаемости генетических и простота обслуживания данио рерио (Danio рерио) стали широко использоваться позвоночных моделью для инфекционных заболеваний. Личинок данио рерио естественно добычу на одноклеточных простейших Парамеции туфелька. Этот протокол описывает использование P. туфелька в качестве инструмента для пищевого заражения в личиночной данио рерио. P. туфелька интернализировать широкий спектр бактерий и бактериальной клетки остаются жизнеспособными на несколько часов. Данио рерио затем охотятся на P. туфелька, бактериальной нагрузки выпущен в Передняя кишка после переваривания Парамеции транспортного средства, и бактерии колонизации кишечного тракта. Протокол включает в себя подробное описание paramecia обслуживания, Загрузка с бактериями, определение бактериальной деградации и дозы, а также инфекции данио рерио кормления с paramecia. Преимущество использования этого метода пищевого заражения является что тесно имитирует режим инфекции наблюдаются в болезни человека, приводит к более надежной колонизации, по сравнению с погружения протоколов и позволяет изучение широкого спектра возбудителей. Пищевого заражения в zebrafish модель может использоваться для изучения экспрессии генов бактерий внутри хоста, хост возбудитель взаимодействия и клейма патогенности, включая бактериальные бремя, локализации, распространения и заболеваемости.

Парамеции туфелька легко усваивает широкий спектр бактерий в хранения вакуоли. Внутриклеточных бактериальных плотность зависит от плотности бактерий и paramecia в сотрудничестве культуры, а также бактериальных видов, используемых. Со временем вакуоли подкислять и вытекает бактериальная деградации. Скорость деградации должен быть индивидуально определены для всех штаммов, используемых. Для патогенных кишечной палочки, первоначальный бактериальных плотность составляет 790 бактерий /Парамециии бактерии являются деградация с периодом полураспада примерно 2.3 h (рис. 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig1.jpg"> Рисунок 1: определение бактериальной half-life в paramecia. (A) после 2 h совместно инкубации с инфекционными E. coli, P. туфелька был промывают и переведен в среде без бактерий. В назначенное время точках, числа жизнеспособных E. coli клетки были определены путем разбавления покрытий на выборочной агар. Результаты являются средством ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM; n = 3). (B) типичный образ Парамеции проведения интернализации бактерий, с ярким полем (Bi), флуоресцентный бактерий (ВП) и объединить каналы (Biii). Шкалы бар = 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Кроме того данио рерио, пренебрегая ставки, то есть скорость, с которой у рыбок данио интернализировать загружен бактерии paramecia после совместного инкубации, был изучен. Данио рерио личинок начинают охотиться и захватить живой добычей от 5 dpf20, хотя было установлено, что, когда возникает при 30 ° C, ускорения развития личинок и животных отображения хищными поведение от 4 dpf. Пренебрегая сопровождается характеристика поражает поведение20 (рисунок 2A), и определение хищными ставки основывается на предположении, что каждый удар приводит к интернализации один Парамеции, хотя это можно рассматривать лишь приближение (см. обсуждение). Основываясь на здесь описано наблюдений наживаться данио рерио личинки, скорость поглощения paramecia является примерно 1,539 за h (рис. 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig2.jpg"> Рисунок 2: определение хищными ставки данио рерио. (A) изображений с хищными видеозапись, данио рерио личинки (5 dpf) наживаться на paramecia, ношение флуоресцентные бактерий. Время в [секунд]. Стрелка указывает основной оси движения во время поражать. (B) количественную оценку темпов хищными (paramecia потребление в час), основанный на n = 10 видео, принятых за время экспозиции полный 2 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
После интернализации paramecia данио рерио эффективно снижает добычу в Передняя кишка, выпуская инфекционных бактерий в пищеварительной системе. Как описано здесь, paramecia деградации продолжается быстро и бесплатно бактерии могут быть обнаружены в желудочно-кишечном тракте в течение 30 минут наживаться. Свободной от бактерий, а затем перейти от Передняя кишка средне - и задней кишки, где они обнаруживаются примерно 1-2 ч после начала хищными (рис. 3). Бактериальные сохраняемости в кишечнике зависит от видов и доза, но колеблется от нескольких h до нескольких дней в случае E. coli и S. enterica. S. enterica локализуется преимущественно в кишечной mucosae, с некоторыми эпителиальных вторжения (рис. 3D), привело к проникновению нейтрофилов в эпителии (рис. 3 c).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig3.jpg"> Рисунок 3: Колонизация данио рерио с бактериями. Данио рерио на 5 dpf были оставил неинфицированных (A) или колонизировали с mCherry, выражая E. coli (B) или (C) S. enterica. Инфекция может быть эксперименты в дикого типа (A и B) рыбы или трансгенных линий (например, линии тг (MPO::EGFP) я114 , выражая Зеленый флуоресцентный нейтрофилов, показано на (C). Ректальное отверстие отмечена стрелкой. (D) увеличение кишечных секции из состава Гора встраиваемых личинки инфицированных с Salmonella enterica инфекции. (Ди) синий = Hoechst, маркировка ядер, фиолетовый (дии) = Фаллоидин маркировка F-актина, красный (Diii) = сальмонеллы, слияние (Div). Шкалы бар = 5 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58949/58949mov1.jpg"> Фильм 1: видео кадры захвата добычей. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/PreyCapture.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Данио рерио (Danio рерио) становятся широко используется позвоночных животных модель микробная колонизация и патогенеза. Этот протокол описывает использование простейших Парамеции туфелька в качестве инструмента для пищевого инфекции данио рерио личинки. P. туфелька легко усваивает бактерий и получить принятые личиночной данио рерио через естественное поведение хищными.

Использование в качестве средства для пищевыми инфекциями в Zebrafish личинки Протозойные Парамеции туфелька

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии о динамике колонизации и инфекции микроорганизмами в желудочно-кишечном тракте. Основными преимуществами этого метода является то, что он является более репрезентативным пищевых инфекций в организме человека и что он уменьшает потенциальные повреждения тканей у рыб по сравнению с устные gavage. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как мытье шаги могут быть трудно выполнить из-за очень пестрый характер парамеции.Из живой растущей культуры добавьте один миллилитр культуры парамеция и один миллилитр культуры электронной палочки MG1655 в десятимильной ткани культуры колбы, содержащей восемь миллилитров E3 среды. Слегка закружить колбу, прежде чем поместить его на 22 градусов по Цельсию проходит один миллилитр совместной культуры в новые десять миллилитров ткани культуры колбу, содержащую девять миллилитров свежих E3 среды, дополненный 108 колонии формирования единиц на миллилитр электронной палочки MG1655, каждые две недели. Чтобы определить бактериальный полуинсия в парамеции рассчитывать количество парамеции от оптической плотности 600 бактерий парамеции совместно культуры и добавить 50 микролитр aliquot супернатанта к новой 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки каждый час в течение шести часов.Добавьте 950 микролитров одного процента неионных сурфактантов в PBS в трубки. И вынизывают парамецию в каждом образце с одной минутой вихря, а затем сделать один из десяти разбавления каждого образца в стерильных PBS. И пластины 100 микролитров каждого разбавления на селективные пластины в течение 16 часов инкубации при 37 градусов по Цельсию.На следующий день, рассчитывать только изолированные и различные отдельные колонии, чтобы определить количество бактериальных колоний на пластине. И определить пластину с разбавлением, которое дает 30-300 колоний-образующих единиц. За день до заражения, собирать один объем бактерий из оптической плотности 600 культуры на лечение центрифугации.И повторно приостановить гранулы в один миллилитр E3 среды на трубку. Далее добавьте один микролитер соответствующего бактериального пятна к каждой бактериальной суспензии. И защитить трубки фото отбеливания с фольгой.Перед инкубацией образцов бактерий с окончанием вращения в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть бактерии два раза в большом объеме E3 среды, чтобы удалить избыток красителя. И повторно приостановить гранулы в один миллилитр свежей E3 среды на трубку.Затем добавьте один миллилитр бактериальной суспензии к каждой из двух колб свежей парамеции на состояние в течение двух часов инкубации при комнатной температуре. Потяните содержимое обеих колб в состоянии в отдельные 50 миллилитров конических труб. И гранулировать образцы центрифугой.Используя стерилогическую пипетку, замените примерно десять миллилитров супернатанта E3 в каждой трубке десятью миллилитров свежей среды E3 для 3 омывает центрифугированием. После последней стирки удалите около десяти миллилитров супернатантов E3, заботясь о том, чтобы не нарушить гранулы, и повторно приостанавливайте гранулы в оставшихся десяти миллилитров E3 среды. Передача 500 микролитров каждой подвески в отдельные 1,5 миллилитр микроценрифуги труб и гранулы парамеции центрифугации.Отбросьте 400 микролитров супернатантов и добавьте 20 микролитров 36,5-процентного раствора формальдегида к оставшимся 100 микролитерам парамеции с нежной пипетки. После пяти минут при комнатной температуре, измерить фактический общий объем в каждой трубке по пипетке, прежде чем считать количество мертвых парамеции на миллилитр. Для пищевой инфекции зебры, разбавить образцы парамеции в два раза десять до пяти парамеции на миллилитр средней концентрации E3.И добавить 3 миллилитров каждой культуры парамеции к одному колодец из 6 хорошо пластины в состоянии. Затем перенесите десять обезболиированных зебры в каждую колодец в минимальном объеме жидкости. И инкубировать со-культуры в течение двух часов при 30 градусах по Цельсию в дневном инкубаторе в условиях дневного света.Чтобы определить скорость добычи, просмотрите кормление зебры под стерео микроскопом, приобретая видеозапись захвата добычи. Захват добычи характеризуется ударом зебры к добыче. Каждый удар оценивается как одно событие захвата добычи.В конце инкубации, мыть зебры в 5 различных скважин, содержащих 3 миллилитров свежей E3 среды дополняется 100 миллиграммов на литр трикаина на скважину. И вставлять каждый зебры в 3 миллилитров 1 процент низкорастух агарозы в черный welled шесть пластины хорошо. Когда все рыбы были встроены, поместите пластину под стерео микроскопом и использовать обрезанный гель загрузки отзыв, чтобы убедиться, что головы находятся слева и хвосты находятся справа в каждом поле просмотра.Подождите 5 минут для агарозы установить, а затем наложить встроенные рыбы со свежим E3 среды дополняется трикаин, и изображение зебры на флуоресцентный микроскоп для оценки прогресса бактериальных инфекций. Для патогенной электронной палочки, начальная бактериальная плотность составляет 790 бактерий на парамеция, и бактерии деградируют в вакуолах каждого атома парамеция с половиной жизни около 2,3 часа. Добыча сопровождается характерным поразительным поведением, а определение скорости добычи основано на предположении, что каждый удар приводит к интернализации 1 парамеция.После переваривания, свободные бактерии перемещаются от foregut к середине и задней кишки, где они обнаруживаются примерно через 1 до 2 часов после начала охоты. S-enterica, например, локализуется в основном в кишечных слизистых оболочках с некоторым эпителиальным вторжением, ведущим к проникновению нейтрофилов в эпителий. Не забывайте, что работа с определенными типами бактерий может быть чрезвычайно опасным, и что меры предосторожности, такие как ношение надлежащего средства индивидуальной защиты всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Использование люциферазы в Изображение Бактериальные инфекции у мышей

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Неинвазивная визуализация диссеминированный кандидоз в Личинки данио рерио

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Послушный млекопитающих инфекции сотовый с Протозойные грунтовка бактерии

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Комплексное 4D визуализация<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Инфекции у мышей

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

Данио рерио в качестве модели для оценки тератогенных потенциал Нитрит

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Человеческие Культуры плацентарной и децидуальной Орган по изучению инфекций на материнской плода интерфейс

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Использование данио рерио модели человеческого вируса гриппа А инфекций экрана противовирусных препаратов и характеризации иммунных клеток-хозяев ответов

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...