Name: merkel cell polyomavirus infection and detection
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) og Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) for at give reagenser og teknisk support. Vi takker også medlemmerne af vores laboratorier for nyttig diskussion. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud (R01CA187718, R01CA148768 og R01CA142723), NCI Cancer Center støtte Grant (NCI P30 CA016520) og Penn CFAR award (P30 AI 045008).

Menneskelige neonatal foreskins blev indhentet fra Penn hud sygdom Research Center. Voksne humane fibroblaster blev indhentet fra kasserede normal hud efter operationen. Alle protokollerne godkendtes ved University of Pennsylvania institutionelle Review Board.
1. isolering af human dermal fibroblaster
<ol><li>Bruge et par saks til at trimme off fedt og subkutant væv fra menneskelige neonatal forhuden og skære hudprøve i halve eller kvarte.</li>
	<li>Inkuber væv i 5 mL 10 mg/mL dispase II...

<ol>
	<li>Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).</li><li>Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+integration+of+a+polyomavirus+in+human+Merkel+cell+carcinoma.">Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma.</a> Science. 319, 1096-1100 (2008).</li><li>Lemos, B., Nghiem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+more+deaths+but+still+no+pathway+to+blame.">Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).</li><li>Agelli, M., Clegg, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+primary+Merkel+cell+carcinoma+in+the+United+States.">Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).</li><li>Liu, W., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+infection+and+Merkel+cell+carcinoma.">Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma.</a> Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).</li><li>Harrison, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+Assembly+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Large+T-Antigen+Origin+Binding+Domains+at+the+Viral+Origin.">Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).</li><li>Kwun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimum+Replication+Origin+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Has+a+Unique+Large+T-Antigen+Loading+Architecture+and+Requires+Small+T-Antigen+Expression+for+Optimal+Replication.">The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication.</a> Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).</li><li>Carter, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+overprinting+gene+in+Merkel+cell+polyomavirus+provides+evolutionary+insight+into+the+birth+of+viral+genes.">Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).</li><li>Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+encodes+a+microRNA+with+the+ability+to+autoregulate+viral+gene+expression.">Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression.</a> Virology. 383 (2), 183-187 (2009).</li><li>Theiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Analysis+of+Replicating+Merkel+Cell+Polyomavirus+Genomes+Delineates+the+Viral+Transcription+Program+and+Suggests+a+Role+for+mcv-miR-M1+in+Episomal+Persistence.">A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence.</a> PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycans+and+sialylated+glycans+sequentially+facilitate+Merkel+cell+polyomavirus+infectious+entry.">Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry.</a> PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).</li><li>Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+Tropism+of+BK+and+Merkel+Cell+Polyomaviruses+in+Cell+Culture.">Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture.</a> PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).</li><li>Schowalter, R. M., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Merkel+cell+polyomavirus+minor+capsid+protein.">The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein.</a> PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).</li><li>Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+Merkel+cell+carcinoma.">Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma.</a> Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).</li><li>Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+a+virus-induced+human+cancer.">Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer.</a> Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).</li><li>Hodgson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+Changing+incidence+trends.">Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends.</a> Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).</li><li>Tolstov, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Merkel+cell+polyomavirus+infection+II.+MCV+is+a+common+human+infection+that+can+be+detected+by+conformational+capsid+epitope+immunoassays.">Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays.</a> International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+and+two+previously+unknown+polyomaviruses+are+chronically+shed+from+human+skin.">Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).</li><li>Foulongne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Skin+Microbiota:+High+Diversity+of+DNA+Viruses+Identified+on+the+Human+Skin+by+High+Throughput+Sequencing.">Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing.</a> PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).</li><li>Hopcraft, S. E., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+viruses+and+innate+immunity.">Tumour viruses and innate immunity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+viral+factors+regulating+Merkel+cell+polyomavirus+replication.">Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication.</a> PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).</li><li>Neumann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+and+Particle+Production+by+a+Consensus+Merkel+Cell+Polyomavirus+(MCPyV)+Genome.">Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome.</a> PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).</li><li>Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+DNA+damage+response+factors+localize+to+merkel+cell+polyomavirus+DNA+replication+sites+to+support+efficient+viral+DNA+replication.">Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication.</a> Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+Target+Cells+and+Mechanisms+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection.">Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).</li><li>Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection+of+Animal+Dermal+Fibroblasts.">Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts.</a> Journal of Virology. 92 (4), (2018).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRD4+regulates+Nanog+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).</li><li>Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+higher+gain,+lower+cost,+greater+durability.">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li><li>Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracellular+assembly+of+papillomaviral+vectors.">Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors.</a> Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm</a> (2018)</li></ol>

De metoder, der er beskrevet ovenfor, herunder isolering af dermal fibroblaster fra huden væv, forberedelse af rekombinante MCPyV virioner, infektion af dyrkede celler, immunfluorescent farvning og en følsomme fisk metode tilpasset fra UNHCR teknologi, som skal give forskerne til at analysere MCPyV infektion27. Et af de mest afgørende skridt til at opnå MCPyV infektion in vitro-er produktion af high-titer virion præparater. Ved hjælp af protokollen til forberedelse af rekombinante MCPyV viri...

Merkel celle polyomavirus (MCPyV) er en lille, dobbelt-strenget DNA-virus, der har været forbundet med en sjælden men aggressiv hudkræft, Merkel celle karcinom (MCC)1,2. Dødeligheden af MCC, omkring 33%, overstiger værdien af melanom3,4. MCPyV har en cirkulær genom ~ 5 kb1,5 gennemskæres af en ikke-kodende regulerende region (NCRR) ind tidligt og sent kodende regioner1. NCRR indeholder replikation (Ori) og tovejs initiativtagere til viral transskription6,7viral oprindelse. Den tidlige region koder tumor antigen proteiner kaldet store T (LT), lille T (sT), 57kT, alternativ LT ORF (ALTO) samt en autoregulatory miRNA1,8,9,10. Den sene region koder kapsid proteiner VP1 og VP211,12,13. LT og sT er de bedst undersøgte proteiner, MCPyV og har været vist for viral DNA replikation og MCPyV-induceret tumordannelse5. Klonede integration af MCPyV DNA i vært genom, som er blevet observeret i op til 80% af MCC'er, er sandsynligvis en kausal faktor for virus-positiv tumor udvikling14,15.
Forekomsten af MCC er tredoblet over de sidste tyve år16. Asymptomatisk MCPyV-infektion er også udbredt i den almindelige befolkning17,18,19. Med det stigende antal MCC diagnoser og den høje prævalens af MCPyV infektion er der behov for at forbedre vores forståelse af virus og dens mutationer potentiale. Men mange aspekter af MCPyV biologi og muterede mekanismer fortsat dårligt forstået20. Dette er hovedsageligt fordi MCPyV replikater dårligt i etablerede celle linjer11,12,21,22,23 , og indtil for nylig, hud celler i stand til at støtte MCPyV infektion var ikke blevet opdaget22. Mekanistiske undersøgelser fuldt ud undersøge MCPyV og dens samspil med værtsceller har været hæmmet af en mangel på celle kultur system for formerings virus5.
Vi opdagede, at primære human dermal fibroblaster (HDFs) isoleret fra neonatal menneskelige forhuden støtte robust MCPyV infektion både in vitro- og ex vivo24. Fra denne undersøgelse etableret vi den første celle kultur infektion model for MCPyV24. Med udgangspunkt i denne modelsystem, viste vi at induktion af matrix metalloproteinase (MMP) gener af WNT/β-catenin signalering pathway og andre vækstfaktorer stimulerer MCPyV infektion. Desuden fandt vi, at FDA-godkendt MEK antagonist trametinib effektivt hæmmer MCPyV infektion5,25. Fra disse undersøgelser etableret vi også et sæt protokoller til isolering af human dermal fibroblaster24,25, forberede MCPyV virioner11,12, udføre MCPyV infektion af human dermal fibroblaster 24 , 25 og afsløre MCPyV proteiner af hvis farvning26. Derudover tilpasset vi den in situ DNA hybridisering kædereaktion (UNHCR) teknologi27 for at udvikle en meget følsomme fisk teknik (HCR-DNA fisk) til påvisning af MCPyV DNA i inficeret menneskers hudceller. Disse nye metoder vil være nyttige for at studere den smitsomme cyklus af MCPyV samt den cellulære reaktion på MCPyV infektion. De naturlige vært reservoir celler, der opretholder MCPyV infektion og de celler, der giver anledning til MCC tumorer forbliver ukendt. De teknikker, vi beskriver i dette manuskript kunne anvendes til at undersøge forskellige typer af humane celler til at identificere både reservoir-cellerne og oprindelsen af MCC tumorer. Vores etablerede metoder, som UNHCR-DNA fisk, kunne også være ansat i påvisning af andre DNA tumor vira og karakterisering af vært celle interaktioner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="838">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:185px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">GLUTAMAX I, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td style="width:185px;">R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Collagenase type IV</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dispase II</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">anti-MCPyV LT (CM2B4)</td>
			<td style="width:185px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-136172</td>
			<td>Lot # B2717</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MCV VP1 rabbit</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal serum #10965</td>
			<td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:339px;">Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td>354060</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Benzonase Nuclease</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase</td>
			<td style="width:185px;">EPICENTRE</td>
			<td>E3101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Probe hybridization buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Probe wash buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Amplification buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa 594-labeled hairpins</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td>B4</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R3136</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Buffer PB</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19066</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">blue miniprep spin column</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">T4 ligase</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202T</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagicMark XP</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC5602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

merkel cell polyomavirus infection and detection

Merkel celle polyomavirus (MCPyV) infektion kan føre til Merkel karcinom (MCC), en meget aggressiv form for hudkræft. Mekanistiske undersøgelser fuldt ud undersøge MCPyV Molekylærbiologi og muterede mekanismer har været hæmmet af en mangel på tilstrækkelige celle kultur modeller. Her, beskriver vi et sæt af protokoller for udførelse og afsløre MCPyV infektion af primære menneskelige hudceller. Protokollerne beskrive isolation af human dermal fibroblaster, forberedelse af rekombinante MCPyV virioner og påvisning af virusinfektion af både immunfluorescent (IF) farvning og in situ DNA-hybridisering kædereaktion (UNHCR), som er et meget følsomt Fluorescens i situ hybridisering (FISH) tilgang. Protokoller heri kan tilpasses af interesserede forskere til at identificere andre celletyper eller cellelinjer, der understøtter MCPyV infektion. Metoden beskrevet fisk kan også tilpasses til påvisning af lave niveauer af viral DNAs stede i den inficerede menneskelige hud.

Den protokol, der er beskrevet i dette manuskript tilladt isolation af en næsten homogen population af HDFs (figur 1). Som det fremgår af immunfluorescent farvning, farvet næsten 100% dermal menneskeceller isoleret ved brug af de i denne protokol beskrevne betingelser var positivt for dermal fibroblast markører, vimentin og kollagen jeg24, men negative for menneskelige forhuden keratinocytter markør K14 (figur...

Watch this Scientific Journal Video about Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection at JoVE.com

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Vi præsenterer her, en protokol for at inficere primære human dermal fibroblast med MCPyV. Protokollen omfatter isolering af dermal fibroblaster, udarbejdelse af MCPyV virioner, virusinfektion, immunofluorescens farvning og fluorescens i situ hybridisering. Denne protokol kan udvides til kendetegner MCPyV-værtssammenspil og opdage andre inficerbare celletyper ved MCPyV.

Merkel celle Polyomavirus infektion og påvisning

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

Vi præsenterede den første cellekulturmodel for Merkel Cell Polyomavirus infektion. Protokollen omfatter isolering af dermal fibroblaster, forberedelse af MCPyV virusinfektion, immunfluorescerende farvning, og fluorescerende in situ hybridisering. Denne protokol gør det muligt at studere MCPyV infektiøs cyklus og interaktioner med værtsceller og samtidig undgå artefakter forbundet med over-ekspression af virale gener.Til at begynde, bruge en saks til at trimme fedt og subkutane væv ud af den menneskelige neonatal forhuden. Skær hudprøven i halve eller kvarte. Placer vævet i 5 milliliter 10 milligram per milliliter dis-baserede II NPBS, suppleret med antibiotika-antimykotisk.Inkubere ved 4 grader Celsius natten over. Den næste dag, bruge microdissection kraftafslag til omhyggeligt at adskille epidermis fra dermal lag i en 10 centimeter skål. Det resulterende dermale væv overføres til et 15 milliliter konisk rør indeholdende 5 milliliter 2 mg pr. milliliterlagnosetype IV i FBS-frit medium suppleret med antibiotikummetmykotisk.Inkuber prøven ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid med periodisk omrystning i fire til seks timer, indtil blot et par makroskopiske væv aggregater tilbage. Derefter skal du bruge en 10 milliliterpipette til at pipette prøveopløsningen op og ned kraftigt 10 gange, hvilket frigiver enkelte celler fra dermis. Centrifuge ved 180 g i fem minutter og kassér supernatanten.Plade de dissocierede celler i suppleret DMEM medium. I den sene eftermiddag eller aften, frø 6 millioner 293TT28 celler i en 10 centimeter skål, der indeholder suppleret DMEM medium. Inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Den næste morgen, sikre, at cellerne er omkring 50% sammenløb, derefter transfect cellerne med 66 mikroliter transfektion reagens, 12 mikrogram re-ligated MCPyV isolere R17B DNA, 8,4 mikrogram ST udtryk plasmid pMtB, og 9,6 mikrogram LT udtryk plasmidpADL. Inkuber cellerne natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Den følgende dag, når de transficerede celler er næsten sammenløb, trypsinize cellerne og overføre dem til en 15 centimeter skål for fortsat ekspansion.Når denne parabol bliver næsten sammenløbet, overføre cellerne i tre nye 15 centimeter retter. Når disse nye retter bliver næsten sammenløb, høste cellerne som skitseret i tekstprotokollen. Centrifuge ved 180 g ved stuetemperatur i fem minutter.Fjern derefter supernatanten og tilsæt en cellevolumen af DPBS magnesium. Der tilsættes 25 mikromolar ammoniumsulfat efterfulgt af 0,5 % Triton X-100, 0,1 %benzonase og 0,1 % af en ATP-afhængig DNAse. Bland godt og inkubere ved 37 grader Celsius natten over.Den næste dag, afkøles blandingen på is i 15 minutter. Dernæst tilsættes 0,17 volumen af natriumchlorid. Bland og inkubere på is i yderligere 15 minutter.Centrifuge ved 12 tusind g ved 4 grader Celsius i 10 minutter. Hvis supernatanten ikke er klar, skal røret vendes forsigtigt om og centrifugeres. Derefter overføres supernatanten til et nyt rør.Opsalt pellet i 1 volumen af DPBS suppleret med 0,8 modermærker af natriumchlorid. Centrifuge ved 12 tusind g ved fire grader Celsius i 10 minutter. Hvis supernatanten ikke er klar, skal røret vendes forsigtigt om og centrifugeres.Kombiner de to supernatanter og centrifuge igen ved 12 tusind g ved fire grader Celsius i 10 minutter. Brug derefter en pipette til at deponere gradienter af iodixanol i tyndvæggede fem milliliter polyallomerrør som beskrevet i tekstprotokollen. Der indlæses 3 milliliter af det afklarede virusholdige supernatant oven på den forberedte iodixanolgradient.Centrifuge med en SW 55 Ti rotor på 234 tusind g og ved 16 grader Celsius i 3,5 timer, og sørg for at indstille acceleration og deceleration til langsom. Efter ultracentrifugering er færdig, indsamles 12 fraktioner i silikonede rør. Efter vedligeholdelse og afmontere cellerne, ved 10 milliliter suppleret DMEM og F12 medium til fadet.Celleopløsningen overføres til et 15 milliliterrør. Centrifuge ved 180 g i to minutter. Kassér supernatanten og re-suspendere cellerne i suppleret DMEM og F12 medium ved en celletæthed mellem 20 tusind og 40 tusind celler pr milliliter.Derefter, frø 200 eller 400 mikroliter af cellen suspension suppleret med 1 milligram per milliliter af kollagen type IV i hver brønd af en 24 eller 96 godt plade, henholdsvis. Fjern MCPyV viron bestanden fra minus 80 grader Celsius fryser og sted på is til at tø. Tilføj 1 milliard viral genom ækvivalenter af MCPyV virioner pr en mikroliter af iodixanol for hver 2500 til 5000 celler, der skal inficeres.Bank forsigtigt på siden af pladen, og inkuber ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid. Først fastgør cellerne på dækslider med 4% PFA i PBS i 10 minutter, vask derefter dækslet to gange med PBS og behandle dem med 70% ethanol ved fire grader Celsius natten over for at gennemtrænge cellerne. Den næste dag, erstatte ethanol med sonde hydrering buffer og inkubere ved stuetemperatur i 60 minutter for at for hybridisere prøverne.30 minutter før afslutningen af præ-hybridisering inkubation, fortyndes sonder i sonde hybridisering opløsning ved en 1:500 fortynding og inkubere ved 45 grader Celsius. Når inkubationerne er færdige, pipetteres ca. 10 mikroliter af den fortyndede sondeblanding på et mikroskopdias for hver dækselseddel. Placer hver dækselcelleside ned på dens respektive dråbe hybridiseringsblanding.Ved hjælp af en liberal mængde gummi cement, forsegle kanterne og bagsiden af hvert dæksel glide til sin slide. Indstil dias på den flade side af en varmeblok og varme dem til 94 grader Celsius i tre minutter. Derefter overføres diaset til et befugtet kammer og inkuberes dem ved 45 grader Celsius natten over.Den næste dag, skal du bruge kraftbefæstet til omhyggeligt at skrælle væk gummi cement. Placer dækslet glider cellesiden op i brøndene på en 24 brøndplade, og vask dem med sondevaskebuffer tre gange ved stuetemperatur. Der tilsættes 200 mikroliter forstærkningsbuffer til hver brønd, der indeholder en dækselseddel, og inkuberes ved stuetemperatur i 30 til 60 minutter.I mellemtiden, anneal hver af de to mærket oligonukleotid hårnåle genkende sonder i separate PCR rør ved at opvarme dem til 94 grader Celsius i 90 sekunder, og derefter afkøle dem til stuetemperatur i 30 minutter. Hårnålene blandes sammen i forstærkningsbuffer ved en fortynding på 1:50. Dernæst strække paraffin film over den åbne flade af en 12 godt plade låg til at gøre en overflade for forstærkning reaktion.Pipette 50-100 mikroliterdråber af hårnålesen blandingen på paraffinfilmen for hver dækselseddel. Brug snævle, forsigtigt fjerne hvert dæksel slip fra forforstærkning løsning og røre kanten til en porøs engangsservietter til tørre. Placer hver tørret dækselcelleside ned på en forstærkningsdråbe.Pladelåget overføres til et befugtet kammer og inkuberes natten over ved stuetemperatur og i mørke. Den næste dag, returnere dækslet glider til brøndene af de 24 brøndplade. Der tilsættes 5X SSCT, der indeholder DAPI, ved en koncentration på 0,5 mikrogram pr. milliliter til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i en time.Derefter vaskes prøverne to gange med 5X SSCT ved stuetemperatur. Monter det vaskede dæksel på mikroskopdias, og brug et omvendt fluorescensmikroskop til at analysere cellerne og afbilde prøverne. I denne undersøgelse, en næsten homogen befolkning af humane dermal fibroblaster er isoleret.Immunfluorescerende farvning afslører, at næsten 100% af de isolerede menneskelige dermalceller er positivt plettet for dermal fibroblast markører, vimentin, og kollagen, men negativ for human forhuden keratinocyte markør K14. MCPyV virioner genereres derefter, og efter visualisering af båndet af MCPyV virioner koncentreret i kernen af gradienten indsamles 500 mikroliterfraktioner, og MCPyV qPCR udføres for at identificere de maksimale fraktioner. Immunofluorescerende farvede billeder af HDF'er inficeret med MCPyV vises her, hvor celler, der er LT positive, VP1 positive, eller både LT og VP1 positive anses for at være positive for MCPyV-infektion.Over 30% af cellerne er LT positive, og mere end 10% er VP1 positive. De MCPyV-genomer, der replikeres i de inficerede celler, påvises ved hjælp af både HCR-DNA FISH og Immunofluorescerende-HCR-DNA FISH. Mens HCR-DNA FISH afslører lokalisering af MCPyV DNA til stede i replikation fabrikken, immunofluorescerende-HCR-DNA FISH metoder tillader samtidig påvisning af både MCPyV DNA og LT protein co-lokalisering på replikation centre.For at opnå den bedste virusinfektion effektivitet, Er det meget vigtigt, at MCPyV er koncentreret til mindst 2 x 10 til 8th virus genom pr microliter, da iodoxanol er giftigt for cellerne. Efter MCPyV infektion af dermal fibroblaster, mange molekylære biologiske analyser kan udføres, herunder immunfluorescens, immun-blokering, immunopositivication, og qPCR-baserede assay. Infektionen system, som vi har beskrevet gør det muligt for forskere at studere stadier af MCPyV infektion som nuklear handel og viral emballage.MCPyV er en BSL-2 virus, men lidt er kendt om dens potentiale for patologi i de mængder, der opnås i et laboratorium indstilling. Derfor bør forskerne tage forholdsregler for at undgå at blive udsat for virus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encellede Analyse af Bacillus subtilis Biofilm Brug fluorescensmikroskopi og Flowcytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

En Visual analysen til overvågning T6SS-medieret bakteriel konkurrence

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning af fluorescerende Nanopartikel Interaktioner med Primary Immune cellesubpopulationer ved flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

påvisning af<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant overfladeglycoprotein Skift af magnetisk cellesortering og flowcytometri

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay til påvisning af Antigen-specifikke T-celle cytolytisk funktion ved hjælp af en Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Ultrasensitive påvisning af biomarkører ved hjælp af en molekylær prægning baseret kapacitiv Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Påvisning af Inflammasome aktivering og Pyroptotic celledød i Murine knoglemarv-afledte makrofager

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...