Name: merkel cell polyomavirus infection and detection
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection at JoVE.com

De auteurs bedank Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Instituut) en Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) voor het verstrekken van reagentia en technische ondersteuning. Wij danken ook de leden van onze laboratoria voor nuttige discussie. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies (R01CA187718, R01CA148768 en R01CA142723), de NCI Cancer Center ondersteuning subsidie (NCI P30 CA016520) en de Penn BVERRE award (P30 AI 045008).

Menselijke neonatale foreskins werden verkregen uit Penn huid ziekte Research Center. Volwassen menselijke fibroblasten werden verkregen uit afgedankte normale huid na de operatie. Alle protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Pennsylvania institutionele Review Board.
1. isolatie van menselijke dermale fibroblasten
<ol><li>Gebruik een paar van schaar te knippen uit vet en onderhuids weefsel van de menselijke neonatale voorhuid en het monster van de huid in helften of kwarten g...

<ol>
	<li>Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).</li><li>Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+integration+of+a+polyomavirus+in+human+Merkel+cell+carcinoma.">Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma.</a> Science. 319, 1096-1100 (2008).</li><li>Lemos, B., Nghiem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+more+deaths+but+still+no+pathway+to+blame.">Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).</li><li>Agelli, M., Clegg, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+primary+Merkel+cell+carcinoma+in+the+United+States.">Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).</li><li>Liu, W., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+infection+and+Merkel+cell+carcinoma.">Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma.</a> Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).</li><li>Harrison, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+Assembly+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Large+T-Antigen+Origin+Binding+Domains+at+the+Viral+Origin.">Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).</li><li>Kwun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimum+Replication+Origin+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Has+a+Unique+Large+T-Antigen+Loading+Architecture+and+Requires+Small+T-Antigen+Expression+for+Optimal+Replication.">The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication.</a> Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).</li><li>Carter, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+overprinting+gene+in+Merkel+cell+polyomavirus+provides+evolutionary+insight+into+the+birth+of+viral+genes.">Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).</li><li>Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+encodes+a+microRNA+with+the+ability+to+autoregulate+viral+gene+expression.">Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression.</a> Virology. 383 (2), 183-187 (2009).</li><li>Theiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Analysis+of+Replicating+Merkel+Cell+Polyomavirus+Genomes+Delineates+the+Viral+Transcription+Program+and+Suggests+a+Role+for+mcv-miR-M1+in+Episomal+Persistence.">A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence.</a> PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycans+and+sialylated+glycans+sequentially+facilitate+Merkel+cell+polyomavirus+infectious+entry.">Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry.</a> PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).</li><li>Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+Tropism+of+BK+and+Merkel+Cell+Polyomaviruses+in+Cell+Culture.">Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture.</a> PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).</li><li>Schowalter, R. M., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Merkel+cell+polyomavirus+minor+capsid+protein.">The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein.</a> PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).</li><li>Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+Merkel+cell+carcinoma.">Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma.</a> Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).</li><li>Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+a+virus-induced+human+cancer.">Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer.</a> Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).</li><li>Hodgson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+Changing+incidence+trends.">Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends.</a> Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).</li><li>Tolstov, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Merkel+cell+polyomavirus+infection+II.+MCV+is+a+common+human+infection+that+can+be+detected+by+conformational+capsid+epitope+immunoassays.">Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays.</a> International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+and+two+previously+unknown+polyomaviruses+are+chronically+shed+from+human+skin.">Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).</li><li>Foulongne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Skin+Microbiota:+High+Diversity+of+DNA+Viruses+Identified+on+the+Human+Skin+by+High+Throughput+Sequencing.">Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing.</a> PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).</li><li>Hopcraft, S. E., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+viruses+and+innate+immunity.">Tumour viruses and innate immunity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+viral+factors+regulating+Merkel+cell+polyomavirus+replication.">Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication.</a> PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).</li><li>Neumann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+and+Particle+Production+by+a+Consensus+Merkel+Cell+Polyomavirus+(MCPyV)+Genome.">Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome.</a> PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).</li><li>Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+DNA+damage+response+factors+localize+to+merkel+cell+polyomavirus+DNA+replication+sites+to+support+efficient+viral+DNA+replication.">Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication.</a> Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+Target+Cells+and+Mechanisms+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection.">Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).</li><li>Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection+of+Animal+Dermal+Fibroblasts.">Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts.</a> Journal of Virology. 92 (4), (2018).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRD4+regulates+Nanog+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).</li><li>Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+higher+gain,+lower+cost,+greater+durability.">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li><li>Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracellular+assembly+of+papillomaviral+vectors.">Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors.</a> Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm</a> (2018)</li></ol>

De methoden die hierboven beschreven, met inbegrip van isolatie van dermale fibroblasten van menselijke huidweefsel, voorbereiding van recombinante MCPyV virionen, infectie van gekweekte cellen, immunefluorescentie kleuring en een gevoelige vis methode aangepast van HCR technologie, die onderzoekers te analyseren MCPyV infectie27in staat moeten stellen. Een van de meest kritische stappen tot de verwezenlijking van de in vitro MCPyV-infectie is de productie van hoge-titer virion preparaten. Met beh...

Merkel cel polyomavirus (MCPyV) is een kleine, double-stranded DNA-virus dat is gekoppeld aan een zeldzame maar agressief huidkanker, Merkel cel carcinoom (MCC)1,2. Het sterftecijfer van MCC, ongeveer 33% hoger dan die van melanoom3,4. MCPyV heeft een circulaire genoom van ~ 5 kb1,5 doorsneden door een niet-coderende regelgevende regio (NCRR) in het vroeg en laat codering gebieden1. De NCRR bevat de virale oorsprong van replicatie (Ori) en bidirectionele promotoren voor virale transcriptie6,7. De vroege regio codeert tumor antigeen proteïnen genaamd grote T (LT), kleine T (sT), 57kT, alternatieve LT ORF (ALTO), evenals een autoregulatory miRNA1,8,9,10. De late regio codeert de Eiwitmantel eiwitten VP1 en VP211,12,13. LT sT de best bestudeerde MCPyV eiwitten en zijn ter ondersteuning van de virale DNA replicatie en MCPyV-geïnduceerde tumorvorming5is gebleken. Klonen integratie van MCPyV DNA in het genoom van de host, die tot 80% van MCCs oedeem is waargenomen, is waarschijnlijk een oorzakelijke factor voor virus-positieve tumor ontwikkeling14,15.
De incidentie van MCC heeft verdrievoudigd in de afgelopen twintig jaar16. Asymptomatische infectie van de MCPyV is ook wijdverbreid in de algemene bevolking17,18,19. Met het toenemende aantal MCC diagnoses en de hoge prevalentie van MCPyV infectie is er behoefte aan een betere ons begrip van het virus en zijn potentieel oncogene. Toch blijven veel aspecten van MCPyV biologie en oncogene mechanismen slecht begrepen20. Dit is vooral omdat MCPyV gerepliceerd slecht in gevestigde cel lijnen11,12,21,22,23 en, tot voor kort huidcellen beeldschermresolutie ondersteunen MCPyV infectie had niet ontdekt22. Mechanistisch onderzoek te onderzoeken volledig MCPyV en zijn interactie met de gastheer cellen hebben belemmerd door een gebrek aan celcultuur voor vermeerdering van het virus-5.
We ontdekten dat de primaire menselijke dermale fibroblasten (HDFs) geïsoleerd van neonatale menselijke voorhuid ondersteuning robuuste MCPyV infectie beide in vitro en ex vivo24. Uit deze studie vastgesteld we het eerste model van het infectie van de cultuur van de cel voor MCPyV24. Voortbouwend op dit modelsysteem, toonden we dat de inductie van matrix metalloproteinase (MMP) genen door de WNT/β-catenine signalering traject en andere factoren die de groei MCPyV infectie stimuleert. Bovendien, we vonden dat de FDA-goedgekeurde MEK antagonist trametinib effectief MCPyV infectie5,25 remt. Uit deze studies vastgesteld wij een verzameling protocollen voor het isoleren van de menselijke dermale fibroblasten24,25, voorbereiding MCPyV virionen11,12, MCPyV infectie wilt uitvoeren op menselijke dermale fibroblasten 24 , 25 en detectie MCPyV eiwitten door als kleuring26. Bovendien, aangepast we de in situ DNA hybridisatie kettingreactie (HCR) technologie27 voor de ontwikkeling van een hooggevoelige vis techniek (HCR-DNA vis) voor het opsporen van MCPyV DNA in besmette menselijke huidcellen. Deze nieuwe methoden zijn nuttig voor het bestuderen van de besmettelijke cyclus van MCPyV, alsmede de cellulaire respons op MCPyV infectie. De natuurlijke gastheer reservoir cellen die MCPyV infecties te handhaven en de cellen die aanleiding tot MCC tumoren geven blijven onbekend. De technieken die we in dit manuscript beschrijven kon worden toegepast om te onderzoeken van de verschillende soorten menselijke cellen zowel de cellen van het reservoir worden geïdentificeerd en de oorsprong van MCC tumoren. Onze gevestigde methoden, zoals het Hoge Commissariaat voor vluchtelingen-DNA vis, kunnen ook worden gebruikt in de opsporing van andere DNA tumor virussen en de karakterisatie van gastheer cel interacties.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="838">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:185px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">GLUTAMAX I, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td style="width:185px;">R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Collagenase type IV</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dispase II</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">anti-MCPyV LT (CM2B4)</td>
			<td style="width:185px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-136172</td>
			<td>Lot # B2717</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MCV VP1 rabbit</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal serum #10965</td>
			<td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:339px;">Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td>354060</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Benzonase Nuclease</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase</td>
			<td style="width:185px;">EPICENTRE</td>
			<td>E3101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Probe hybridization buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Probe wash buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Amplification buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa 594-labeled hairpins</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td>B4</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R3136</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Buffer PB</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19066</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">blue miniprep spin column</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">T4 ligase</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202T</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagicMark XP</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC5602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

merkel cell polyomavirus infection and detection

Merkel cel polyomavirus (MCPyV) infectie kan leiden tot Merkel cel carcinoom (MCC), een zeer agressieve vorm van huidkanker. Mechanistisch onderzoek te onderzoeken volledig MCPyV moleculaire biologie en oncogene mechanismen hebben belemmerd door een gebrek aan voldoende cel cultuur modellen. Hier beschrijven we een aantal protocollen voor het uitvoeren en het opsporen van MCPyV infectie van primaire menselijke huidcellen. De protocollen beschrijven het isolement van menselijke dermale fibroblasten, voorbereiding van recombinante MCPyV virionen, en detectie van virusinfectie door zowel immunefluorescentie (IF) kleuring en in situ DNA-hybridisatie kettingreactie (HCR), dat een uiterst gevoelige is fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) benadering. De protocollen hierin kunnen worden aangepast door interesse onderzoekers om andere soorten cellen of cellijnen die ondersteuning bieden voor MCPyV infectie te identificeren. De beschreven aanpak van de vis kan ook worden aangepast voor het opsporen van lage niveaus van virale Ani aanwezig in de besmette menselijke huid.

Het protocol beschreven in dit manuscript toegestaan isolatie van een bijna homogene populatie van HDFs (Figuur 1). Zoals aangetoond door immunefluorescentie kleuring, bijna 100% van de menselijke huid cellen geïsoleerd met behulp van de in dit protocol beschreven omstandigheden positief waren gekleurd voor dermale fibroblast markeringen, vimentin en collageen ik24, maar negatief voor menselijke voorhuid Keratinocyt marker K14 (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection at JoVE.com

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Hier presenteren we een protocol om te infecteren primaire menselijke dermale fibroblast met MCPyV. Het protocol bevat Isolatievan dermale fibroblasten, voorbereiding van MCPyV virionen, virusbesmetting, immunofluorescentie kleuring en fluorescentie in situ hybridisatie. Dit protocol kan worden uitgebreid voor het karakteriseren van MCPyV-gastheer interacties en het ontdekken van andere celtypes ze door MCPyV.

Merkel cel Polyomavirus infectie en detectie

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

We presenteerden het eerste celkweekmodel voor Merkel Cell Polyomavirus infectie. Het protocol omvat isolatie van de huidfibroblasten, voorbereiding van de MCPyV-virusinfectie, immunofluorescente kleuring en de fluorescerende in situ-hybridisatie. Dit protocol maakt het mogelijk om de MCPyV infectieuze cyclus en interacties met gastheercellen te bestuderen, terwijl artefacten in verband met overexpressie van virale genen worden vermeden.Om te beginnen, gebruik maken van een schaar om het vet en onderhuids weefsel trim off van de menselijke neonatale voorhuid. Snijd het huidmonster in tweeën of kwartjes. Plaats het weefsel in 5 milliliter van 10 milligram per milliliter dis-based II NPBS, aangevuld met antibiotica-antimycotische.Incubeer op 4 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, gebruik microdissection forceps om zorgvuldig te scheiden van de opperhuid van de huidlagen in een 10 centimeter schotel. Breng het resulterende huidweefsel over naar een 15 milliliter conische buis met 5 milliliter van 2 milligram per milliliter collagenase type IV in FBS-vrij medium aangevuld met antibioticum-anitmycoticum.Incubeer het monster bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide met periodiek schudden gedurende vier tot zes uur, totdat slechts een paar macroscopische weefselaggregaten overblijven. Gebruik hierna een pipet van 10 milliliter om de monsteroplossing 10 keer krachtig op en neer te pipetten, waardoor enkele cellen uit de dermis vrijkomen. Centrifuge vijf minuten op 180 g en gooi de supernatant weg.Plaat de gescheiden cellen in aangevuld DMEM medium. In de late namiddag of avond, zaad 6 miljoen 293TT28 cellen in een 10 centimeter schotel met aangevuld DMEM medium. Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.De volgende ochtend, zorg ervoor dat de cellen zijn ongeveer 50%confluent, dan transfect de cellen met 66 microliter van transfection reagens, 12 microgram van re-ligated MCPyV isolaat R17B DNA, 8,4 microgram st expressie plasmid pMtB, en 9,6 microgram van LT expressie plasmid pADL. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. De volgende dag, wanneer de doorgeïnfecteerde cellen bijna samenvloeiend zijn, trypsinize de cellen en breng ze naar een 15 centimeter schotel voor verdere uitbreiding.Wanneer dat gerecht bijna confluent wordt, breng de cellen in drie nieuwe schotels van 15 centimeter over. Wanneer die nieuwe gerechten bijna vloeiend worden, oogst je de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Centrifuge vijf minuten bij kamertemperatuur bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens de supernatant en voeg een celvolume DPBS magnesium toe. Voeg 25 micromolar ammoniumsulfaat toe, gevolgd door 0,5%Triton X-100, 0,1% benzonase en 0,1% van een ATP-afhankelijke DNAse. Meng goed en incubeer op 37 graden Celsius 's nachts.De volgende dag koel je het mengsel 15 minuten op ijs. Voeg vervolgens 0,17 volume natriumchloride toe. Meng en broed nog 15 minuten op het ijs.Centrifuge op 12 duizend g bij 4 graden Celsius gedurende 10 minuten. Als de supernatant niet duidelijk is, kan u de buis voorzichtig omkeren en de centrifugatie herhalen. Breng hierna de supernatant over naar een nieuwe buis.Resuspend de pellet in 1 volume van DPBS aangevuld met 0,8 moedervlekken natriumchloride. Centrifuge op 12 duizend g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Als de supernatant niet duidelijk is, kan u de buis voorzichtig omkeren en de centrifugatie herhalen.Combineer de twee supernatants en centrifuge weer op 12 duizend g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gebruik vervolgens een pipet om gradiënten van iodixanol te deponeren in dunwandige vijf milliliter polyallomerenbuizen zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad 3 milliliter van het geklaarde virushoudende supernatant bovenop het voorbereide iodixanolgradiënt.Centrifuge met een SW 55 Ti rotor op 234 duizend g en bij 16 graden Celsius gedurende 3,5 uur, ervoor te zorgen dat de versnelling en vertraging te vertragen. Nadat de ultracentrifugatie is voltooid, verzamel 12 fracties in siliconen buizen. Na het onderhouden en losmaken van de cellen, op 10 milliliter van aangevulde DMEM en F12 medium aan de schotel.Breng de celoplossing over naar een buis van 15 milliliter. Centrifuge op 180 g gedurende twee minuten. Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in het aanvullende DMEM- en F12-medium met een celdichtheid tussen 20 duizend en 40 duizend cellen per milliliter.Dan, zaad 200 of 400 microliter van de cel suspensie aangevuld met 1 milligram per milliliter collagenase type IV in elke put van een 24 of 96 put plaat, respectievelijk. Haal de MCPyV viron voorraad uit de min 80 graden Celsius vriezer en plaats op ijs te ontdooien. Voeg 1 miljard virale genoomequivalenten van MCPyV virions per microliter iodixanol toe voor elke 2500 tot 5000 cellen die moeten worden geïnfecteerd.Tik voorzichtig op de zijkant van de plaat en broed op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Bevestig eerst de cellen op afdekbonen met 4%PFA in PBS gedurende 10 minuten, was vervolgens de afdekkingslips twee keer met PBS en behandel ze met 70% ethanol bij vier graden Celsius 's nachts om de cellen te doorgronden. De volgende dag, vervang de ethanol met sonde hydratatie buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten om pre-hybridiseren van de monsters.30 minuten voor het einde van de pre-hybridisatie incubatie, verdun de sondes in sonde hybridisatie oplossing bij een 1:500 verdunning en incubeer bij 45 graden Celsius. Wanneer de incubaties zijn voltooid, pipet ongeveer 10 microliter van de verdunde sonde mengsel op een microscoop schuif voor elke cover slip. Plaats elke cover slip cell kant naar beneden op de respectieve druppel van hybridisatie mix.Met behulp van een liberale hoeveelheid rubbercement, verzegelen de randen en achterkant van elke cover slip naar de dia. Stel de glijbaan op de vlakke kant van een warmteblok en verwarm ze op 94 graden Celsius gedurende drie minuten. Breng hierna de glijbaan over naar een bevochtigde kamer en broed ze 's nachts uit bij 45 graden Celsius.De volgende dag, gebruik tangen om zorgvuldig schil weg het rubbercement. Plaats het deksel glijdt cel kant omhoog in de putten van een 24 put plaat en was ze met sonde wassen buffer drie keer op kamertemperatuur. Voeg 200 microliter versterkingsbuffer toe aan elke put met een afdeksel en incubbate bij kamertemperatuur gedurende 30 tot 60 minuten.Ondertussen, anneal elk van de twee gelabeld oligonucleotide haarspeldbochten herkennen van de sondes in aparte PCR buizen door ze te verwarmen tot 94 graden Celsius voor 90 seconden, en vervolgens koelen ze naar kamertemperatuur voor 30 minuten. Meng de haarspelden door elkaar in de versterkingsbuffer bij een verdunning van 1:50. Vervolgens strek paraffine film over de open aanzijde van een 12 put plaat deksel om een oppervlak te maken voor de versterking reactie.Pipette 50-100 microliter druppels van het haarspeldmengsel op de paraffinefilm voor elke cover slip. Verwijder met behulp van tangen voorzichtig elke afdeksel uit de pre-versterkingsoplossing en raak de rand aan op een poreus wegwerpdoekje om te drogen. Plaats elke gedroogde cover slip cel kant naar beneden op een versterking druppel.Breng het plaatdeksel in een bevochtigde kamer en broed 's nachts bij kamertemperatuur en in het donker uit. De volgende dag, terug de cover glijdt naar de putten van de 24 goed plaat. Voeg 5X SSCT met DAPI met een concentratie van 0,5 microgram per milliliter toe aan elke put en broed een uur lang bij kamertemperatuur in.Daarna was je de monsters twee keer met 5X SSCT bij kamertemperatuur. Monteer de gewassen cover glijdt op microscoop dia's, en gebruik een omgekeerde fluorescentie microscoop om de cellen te analyseren en beeld van de monsters. In deze studie wordt een bijna homogene populatie van menselijke huidfibroblasten geïsoleerd.Immunofluorescente kleuring blijkt dat bijna 100% van de geïsoleerde menselijke huidcellen positief zijn gekleurd voor huidfibroblasten markers, vimentine, en collageen, maar negatief voor menselijke voorhuid keratinocyte marker K14. MCPyV virions worden vervolgens gegenereerd en na het visualiseren van de band van MCPyV virions geconcentreerd in de kern van het verloop, 500 microliter breuken worden verzameld en MCPyV qPCR wordt uitgevoerd om de piekfracties te identificeren. Immunofluorescente gekleurde beelden van HDFs besmet met MCPyV worden hier getoond, waar cellen die LT-positief, VP1-positief of zowel LT- als VP1-positief zijn, als positief worden beschouwd voor MCPyV-infectie.Meer dan 30% van de cellen zijn LT-positief, en meer dan 10% zijn VP1 positief. De MCPyV genomen gerepliceerd in de geïnfecteerde cellen worden gedetecteerd met behulp van zowel de HCR-DNA FISH en Immunofluorescent-HCR-DNA FISH. Terwijl de HCR-DNA FISH de lokalisatie van MCPyV DNA in de replicatiefabriek onthult, maken de Immunofluorescent-HCR-DNA FISH-methoden gelijktijdige detectie mogelijk van zowel MCPyV DNA als LT-eiwit co-lokalisatie in de replicatiecentra.Om de beste virusinfectie efficiëntie te bereiken, is het zeer belangrijk dat MCPyV is geconcentreerd op ten minste 2 x 10 tot 8e virus genoom per microliter, omdat iodoxanol giftig is voor de cellen. Na MCPyV-infectie van de huidfibroblasten kunnen veel moleculaire biologische analyses worden uitgevoerd, waaronder immunofluorescentie, immunoblocking, immunopositivicatie en op qPCR gebaseerde test. Het infectiesysteem dat we hebben beschreven maakt het mogelijk voor onderzoekers om stadia van MCPyV-infectie te bestuderen, zoals nucleaire handel en virale verpakkingen.MCPyV is een BSL-2 virus, maar er is weinig bekend over het potentieel voor pathologie in de bedragen die in een laboratoriumomgeving worden bereikt. Daarom moeten onderzoekers voorzorgsmaatregelen nemen om blootstelling aan het virus te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Een Visual Assay om T6SS-gemedieerde Bacteriële Concurrentie Monitor

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

detectie van<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Ultrasensitive detectie van Biomarkers met behulp van een moleculaire Imprinting gebaseerd capacitieve Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...