Name: merkel cell polyomavirus infection and detection
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection at JoVE.com

המחברים רוצה להודות ד ר Meenhard Herlyn (מכון Wistar), ד ר מ. סלסט סימון (אוניברסיטת פנסילבניה) לאספקת ריאגנטים ותמיכה טכנית. אנו מודים גם אנשי מעבדות שלנו לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הלאומית המכונים לבריאות (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 ו- R01CA142723), המענק תמיכה במרכז לסרטן (NCI P30 CA016520) NCI, ופרס וכפר פן (P30 AI 045008).

. אל תדאג neonatal האנושי התקבלו ממרכז המחקר של מחלת העור פן. למבוגרים fibroblasts אנושי, התקבלו שהושלכו עור רגיל לאחר הניתוח. כל הפרוטוקולים אושרו על ידי אוניברסיטת פנסילבניה מוסדיים המנהלים.
1. בידוד של האדם fibroblasts עורי
<ol><li>השתמש זוג מספריים כדי לקצץ את רקמת שומן ו התת-עורית מן הערל?...

<ol>
	<li>Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).</li><li>Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+integration+of+a+polyomavirus+in+human+Merkel+cell+carcinoma.">Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma.</a> Science. 319, 1096-1100 (2008).</li><li>Lemos, B., Nghiem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+more+deaths+but+still+no+pathway+to+blame.">Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).</li><li>Agelli, M., Clegg, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+primary+Merkel+cell+carcinoma+in+the+United+States.">Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).</li><li>Liu, W., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+infection+and+Merkel+cell+carcinoma.">Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma.</a> Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).</li><li>Harrison, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+Assembly+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Large+T-Antigen+Origin+Binding+Domains+at+the+Viral+Origin.">Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).</li><li>Kwun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimum+Replication+Origin+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Has+a+Unique+Large+T-Antigen+Loading+Architecture+and+Requires+Small+T-Antigen+Expression+for+Optimal+Replication.">The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication.</a> Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).</li><li>Carter, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+overprinting+gene+in+Merkel+cell+polyomavirus+provides+evolutionary+insight+into+the+birth+of+viral+genes.">Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).</li><li>Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+encodes+a+microRNA+with+the+ability+to+autoregulate+viral+gene+expression.">Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression.</a> Virology. 383 (2), 183-187 (2009).</li><li>Theiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Analysis+of+Replicating+Merkel+Cell+Polyomavirus+Genomes+Delineates+the+Viral+Transcription+Program+and+Suggests+a+Role+for+mcv-miR-M1+in+Episomal+Persistence.">A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence.</a> PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycans+and+sialylated+glycans+sequentially+facilitate+Merkel+cell+polyomavirus+infectious+entry.">Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry.</a> PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).</li><li>Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+Tropism+of+BK+and+Merkel+Cell+Polyomaviruses+in+Cell+Culture.">Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture.</a> PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).</li><li>Schowalter, R. M., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Merkel+cell+polyomavirus+minor+capsid+protein.">The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein.</a> PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).</li><li>Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+Merkel+cell+carcinoma.">Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma.</a> Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).</li><li>Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+a+virus-induced+human+cancer.">Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer.</a> Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).</li><li>Hodgson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+Changing+incidence+trends.">Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends.</a> Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).</li><li>Tolstov, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Merkel+cell+polyomavirus+infection+II.+MCV+is+a+common+human+infection+that+can+be+detected+by+conformational+capsid+epitope+immunoassays.">Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays.</a> International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+and+two+previously+unknown+polyomaviruses+are+chronically+shed+from+human+skin.">Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).</li><li>Foulongne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Skin+Microbiota:+High+Diversity+of+DNA+Viruses+Identified+on+the+Human+Skin+by+High+Throughput+Sequencing.">Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing.</a> PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).</li><li>Hopcraft, S. E., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+viruses+and+innate+immunity.">Tumour viruses and innate immunity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+viral+factors+regulating+Merkel+cell+polyomavirus+replication.">Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication.</a> PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).</li><li>Neumann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+and+Particle+Production+by+a+Consensus+Merkel+Cell+Polyomavirus+(MCPyV)+Genome.">Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome.</a> PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).</li><li>Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+DNA+damage+response+factors+localize+to+merkel+cell+polyomavirus+DNA+replication+sites+to+support+efficient+viral+DNA+replication.">Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication.</a> Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+Target+Cells+and+Mechanisms+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection.">Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).</li><li>Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection+of+Animal+Dermal+Fibroblasts.">Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts.</a> Journal of Virology. 92 (4), (2018).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRD4+regulates+Nanog+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).</li><li>Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+higher+gain,+lower+cost,+greater+durability.">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li><li>Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracellular+assembly+of+papillomaviral+vectors.">Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors.</a> Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm</a> (2018)</li></ol>

השיטות המתוארות לעיל, לרבות בידוד של עורי fibroblasts מרקמות העור האנושי, הכנת virions MCPyV רקומביננטי, זיהום של תאים בתרבית, צביעת immunofluorescent, שיטה דגים רגישים הותאם מהטכנולוגיה נציבות האו ם לפליטים, אשר צריך לאפשר לחוקרים לנתח זיהום MCPyV27. אחד השלבים הקריטיים ביותר להשגת MCPyV זיהום במבחנה ...

מרקל תא polyomavirus (MCPyV) הוא קטן, כפול גדילי DNA וירוס שויך סרטן העור נדירה אך אגרסיבי, מרקל תא קרצינומה (MCC)1,2. שיעור התמותה של מפקד צוות משימה, בסביבות 33%, חורג של מלנומה3,4. MCPyV יש גנום מעגלית של1,~ 5 kb5 נחצה על ידי אזור תקינה ללא קידוד (NCRR) לתוך מוקדם ולא מאוחר קידוד אזורים1. NCRR מכיל מקור ויראליות שכפול (אורי) ועל היזמים דו-כיווניים עבור שעתוק ויראלי6,7. האזור בתחילת מקודד הגידול אנטיגן חלבונים הנקראים T גדול (LT), T קטן (רח'), 57kT, ORF LT חלופי (ALTO), כמו גם של autoregulatory miRNA1,8,9,10. האזור מאוחר מקודד את החלבונים capsid VP1 ואת VP211,12,13. LT ו- sT החלבונים MCPyV ביותר למד, הוכחו תומכת שכפול ה-DNA ויראלי הנוצרות על-ידי MCPyV tumorigenesis5. שילוב המשובטים MCPyV DNA הגנום המארח, אשר נצפתה עד 80% של MCCs, הוא כנראה גורם סיבתי עבור גידול חיובי וירוס פיתוח14,15.
השכיחות של MCC שילש מעל ה-20 שנה האחרונות16. זיהום MCPyV אסימפטומטיים נפוצה גם האוכלוסייה הכללית17,18,19. עם הגדלת מספר אבחנות MCC, שכיחות גבוהה של זיהום MCPyV, יש צורך לשפר את ההבנה שלנו של הווירוס, פוטנציאל oncogenic שלו. עם זאת, היבטים רבים של ביולוגיה MCPyV ומנגנונים oncogenic נשארים ממעטים להבין20. זאת בעיקר משום MCPyV משכפל לקוי תא הוקמה קווים11,12,21,22,23 , עד לאחרונה, מסוגל לתמוך MCPyV תאי עור זיהום לא היה שהתגלו22. מחקרים מכניסטית לחקור באופן מלא MCPyV והאינטראקציה שלו עם התאים המארחים יש להיות הכבידו על ידי חוסר תא מערכת תרבות להפצת וירוסים5.
גילינו כי ראשי האדם עורי fibroblasts (HDFs) מבודד מן העורלה האנושי neonatal תמיכה איתנה MCPyV זיהום בשני במבחנה ו- ex-vivo24. ממחקר זה, הקמנו המודל זיהום התרבות התא הראשון עבור MCPyV24. בונים על מערכת זו מודל, הראנו תנאי הגיוס של מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP) גנים מאת חגיגת/β-catenin איתות לשביל וגורמים אחרים הצמיחה מגרה זיהום MCPyV. יתר על כן, מצאנו trametinib אנטגוניסט MEK שאושרו על-ידי ה-FDA מעכב ביעילות MCPyV זיהום5,25. ממחקרים אלה, גם הקמנו קבוצה של פרוטוקולים לבידוד fibroblasts עורי אנושי24,25, הכנת MCPyV virions11,12, ביצוע זיהום MCPyV על האדם fibroblasts עורי 24 , 25 וגילוי חלבונים MCPyV אם צביעת26. בנוסף, התאמנו באתרו DNA הכלאה תגובת שרשרת (HCR) טכנולוגיה27 לפתח טכניקה דגים רגישים (דגים HCR-DNA) לגילוי MCPyV DNA בתאים נגועים העור האנושי. שיטות חדשות אלה יהיה מועיל ללימוד מחזור זיהומית של MCPyV, כמו גם התגובה התאית זיהום MCPyV. התאים מאגר טבעי מארח לשמור על זיהום MCPyV והתאים להצמיח גידולים MCC נשאר לא ידוע. טכניקות שנתאר כתב יד זה יכול להיות מיושם לבחון סוגים שונים של תאים אנושיים כדי לזהות גם את המאגר התאים ואת המקור של גידולים MCC. השיטות שלנו הוקמה, כגון דגים HCR-DNA, יכול גם להיות מועסק זיהוי וירוסים גידול אחרים ה-DNA, אפיון אינטראקציות התא המארח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="838">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:185px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">GLUTAMAX I, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td style="width:185px;">R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Collagenase type IV</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dispase II</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">anti-MCPyV LT (CM2B4)</td>
			<td style="width:185px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-136172</td>
			<td>Lot # B2717</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MCV VP1 rabbit</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal serum #10965</td>
			<td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:339px;">Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td>354060</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Benzonase Nuclease</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase</td>
			<td style="width:185px;">EPICENTRE</td>
			<td>E3101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Probe hybridization buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Probe wash buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Amplification buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa 594-labeled hairpins</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td>B4</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R3136</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Buffer PB</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19066</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">blue miniprep spin column</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">T4 ligase</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202T</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagicMark XP</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC5602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

merkel cell polyomavirus infection and detection

מרקל תא polyomavirus (MCPyV) זיהום יכול להוביל מרקל קרצינומה של תאים (MCC), טופס אגרסיבי ביותר של סרטן העור. מחקרים מכניסטית מחקירה מלאה של ביולוגיה מולקולרית MCPyV ומנגנונים oncogenic יש כבר הקשו על ידי חוסר מודלים תרבות תא נאותה. כאן, אנו מתארים את ערכה של פרוטוקולים עבור ביצוע וכן זיהוי זיהום MCPyV של תאי העור האנושי העיקרי. הפרוטוקולים לתאר את ניתוקה של האדם fibroblasts עורי, הכנת virions MCPyV רקומביננטי, וזיהוי להידבקות בווירוס על ידי צביעת (אם) immunofluorescent והן באתרו DNA-הכלאה תגובת שרשרת (HCR), אשר הוא מאוד רגיש קרינה פלואורסצנטית בגישה הכלאה (דגים) באתרו. ניתן להתאים את הפרוטוקולים במסמך זה על ידי חוקרים מעוניין לזהות סוגי תאים או שורות תאים התומכים MCPyV זיהום אחרים. הגישה דגים שתואר יכול להתאים גם לגילוי רמות נמוכות של נגיפי DNAs המצויים בעור האדם הנגוע.

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מותר בידוד של אוכלוסיה הומוגנית כמעט של HDFs (איור 1). כפי שמתואר על ידי צביעת immunofluorescent, כמעט 100% של תאים אנושיים עורי מבודדים באמצעות התנאים המתוארים פרוטוקול זה היו באופן חיובי צבעונית פיברובלסט עורי סמנים, vimentin של קולגן אני<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection at JoVE.com

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להדביק את ראשי פיברובלסט עורי האנושי עם MCPyV. הפרוטוקול כולל בידוד של fibroblasts עורי, הכנה של MCPyV virions, זיהום בנגיף, immunofluorescence מכתים פלורסצנטיות הכלאה באתרו. פרוטוקול זה ניתן להאריך אפיון אינטראקציות MCPyV-מארח, גילוי סוגי תאים אחרים מרישי על-ידי MCPyV.

Polyomavirus מרקל זיהום וזיהוי

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

הצגנו את מודל תרבות התאים הראשון לזיהום פוליווירוס תא מרקל. הפרוטוקול כולל בידוד של פיברובלסטים עוריים, הכנת זיהום בנגיף MCPyV, כתמים immunofluorescent, ואת הפלואורסצנט בהכלאה situ. פרוטוקול זה מאפשר לחקור את מחזור הזיהום MCPyV ואינטראקציות עם תאים מארחים תוך הימנעות חפצים הקשורים ביטוי יתר של גנים ויראליים.כדי להתחיל, להשתמש בזוג מספריים כדי לקצץ את השומן ואת הרקמה התת עורית את העורלה יילודים אנושי. חותכים את דגימת העור ב חצאים או רבעים. מניחים את הרקמה ב 5 מיליליטר של 10 מיליגרם למיליליטר dis-based II NPBS, בתוספת אנטיביוטי אנטימיקוטי.דגירה ב 4 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, השתמש מלקחיים microdissection להפריד בזהירות את האפידרמיס מן השכבות עורי בצלחת 10 ס"מ. העבר את הרקמה העורית וכתוצאה מכך צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של 2 מיליגרם לכל קולגנס מיליליטר סוג IV במדיום ללא FBS בתוספת אנטיביוטי-anitmycotic.הדגירה את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני עם רעידות תקופתיות במשך ארבע עד שש שעות, עד רק כמה אגרגטים רקמה מקרוסקופית להישאר. לאחר מכן, השתמש פיפיטה 10 מיליליטר כדי pipette פתרון המדגם למעלה ולמטה במרץ 10 פעמים, שחרור תאים בודדים מן הדרמיס. צנטריפוגה ב 180 גרם במשך חמש דקות ולהשליך את העל טבעי.לוח את התאים המנותקים במדיום DMEM נוסף. בשעות אחר הצהריים המאוחרות או הערב, זרע 6 מיליון תאים 293TT28 לתוך צלחת 10 ס"מ המכיל מדיום DMEM בתוספת. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.למחרת בבוקר, ודא כי התאים הם כ 50%confluent, ולאחר מכן לצלף את התאים עם 66 microliters של ריאגנט transfection, 12 מיקרוגרם של MCPyV מחדש קשירה לבודד R17B DNA, 8.4 מיקרוגרם של PMtB פלסמיד ביטוי ST, ו 9.6 מיקרוגרם של ביטוי LT פלסמיד pADL. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, כאשר התאים המבוצדים כמעט מתבלבלים, נסה את התאים והעבר אותם לצלחת של 15 ס"מ להמשך התרחבות.כאשר המנה הופכת כמעט confluent, להעביר את התאים לשלוש מנות חדשות 15 ס"מ. כאשר כלים חדשים אלה הופכים כמעט confluent, לקצור את התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צנטריפוגה ב 180 גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.לאחר מכן הסר את העל-טבעי והוסף נפח תא אחד של מגנזיום DPBS. הוסף 25 אמוניום גופרתי מיקרומולארי, ואחריו 0.5% טריטון X-100, 0.1%benzonase, ו 0.1% של DNAse תלוי ATP. מערבבים היטב ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.למחרת, לקרר את התערובת על קרח במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף 0.17 נפח של נתרן כלורי. מערבבים ו דגירה על קרח עוד 15 דקות.צנטריפוגה ב 12,000 גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אם העל-טבעי אינו ברור, הפוך בעדינות את הצינור וחזור על הצנטריפוגה. לאחר מכן, העבר את העל-טבעי לצינור חדש.תן את גלולה ב 1 נפח של DPBS בתוספת 0.8 שומות של נתרן כלורי. צנטריפוגה ב 12,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אם העל-טבעי אינו ברור, הפוך בעדינות את הצינור וחזור על הצנטריפוגה.מערבבים שוב את שני העל-טבעיים והצנטריפוגות ב-12,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה להפקיד שיפוע של יודיקסנול לתוך צינורות פוליאלומר דקים קירות חמישה מיליליטר כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. טען 3 מיליליטר של על-טבעי המכיל וירוסים מובהר על גבי שיפוע יודיקסנול מוכן.צנטריפוגה עם רוטור SW 55 Ti ב 234 אלף גרם וב 16 מעלות צלזיוס במשך 3.5 שעות, הקפדה להגדיר את התאוצה וההאטה להאט. לאחר השלמת האולטרה-צנטריפוגה, אספו 12 שברים בצינורות מסיליקון. לאחר שמירה וניתוק התאים, ב 10 מיליליטר של DMEM בתוספת ו- F12 בינוני לצלחת.העבר את פתרון התא לצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 180 גרם במשך שתי דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים באמצעי DMEM ו- F12 בתוספת בצפיפות תאים שבין 20,000 ל- 40 אלף תאים למיליליטר.לאחר מכן, זרע 200 או 400 microliters של ההשעיה התא בתוספת 1 מיליגרם למיליליטר של קולגן מסוג IV לתוך כל באר של צלחת 24 או 96 היטב, בהתאמה. מוציאים את מניית MCPyV viron מהמקפיא של מינוס 80 מעלות וממקמים על הקרח כדי להפשיר. הוסף 1 מיליארד שווה ערך גנום ויראלי של virions MCPyV לכל מיקרוליטר אחד של יודיקסנול עבור כל 2500 כדי 5000 תאים להיות נגועים.הקש על הצד של הצלחת בעדינות, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ראשית, לתקן את התאים על תלושי כיסוי עם 4% PFA ב PBS במשך 10 דקות, לאחר מכן לשטוף את הכיסוי מחליק פעמיים עם PBS ולטפל בהם עם 70% אתנול בארבע מעלות צלזיוס לילה כדי לחלחל לתאים. למחרת, להחליף את האתנול עם חיץ הידרציה בדיקה דגירה בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות כדי מראש הכלאה הדגימות.30 דקות לפני סוף הדגירה טרום ההכלאה, לדלל את הבדיקות בתת פתרון הכלאה בדיקה ב 1:500 דילול דגירה ב 45 מעלות צלזיוס. כאשר הדגירה הושלמה, פיפטה כ 10 מיקרוליטרים של תערובת בדיקה מדוללת על שקופית מיקרוסקופ עבור כל להחליק כיסוי. מניחים כל צד תא להחליק כיסוי למטה על טיפה בהתאמה של תערובת הכלאה.באמצעות כמות ליברלית של מלט גומי, לאטום את הקצוות ואת הגב של כל כיסוי להחליק לשקופית שלה. הגדר את השקופית בצד השטוח של בלוק חום וחום אותם ל 94 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לאחר מכן, מעבירים את המגלשה לתא לח ודגירה אותם ב 45 מעלות צלזיוס לילה.למחרת, השתמש במקלפים כדי לקלף בזהירות את מלט הגומי. מניחים את הכיסוי מחליק את צד התא לתוך הבאר של צלחת 24 היטב ולשטוף אותם עם חיץ לשטוף בדיקה שלוש פעמים בטמפרטורת החדר. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ הגברה לכל באר המכילה תלוש כיסוי ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות.בינתיים, anneal כל אחד משני סיכות ראש oligonucleotide שכותרתו זיהוי הבדיקות בצינורות PCR נפרדים על ידי חימום אותם 94 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות, ולאחר מכן קירור אותם לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מערבבים את סיכות הראש יחד במאגר הגברה בדילול של 1:50. לאחר מכן, למתוח סרט פרפין על הפנים הפתוחות של מכסה צלחת 12 היטב כדי להפוך משטח לתגובת הגברה.פיפטה 50-100 טיפות מיקרוליטר של תערובת סיכות ראש על סרט הפרפין עבור כל תלוש כיסוי. בעזרת מדפים, הסירו בזהירות כל החלקת כיסוי מתספורת ההגברה מראש וגעו בקצה לנגב חד פעמי נקבובי לייבוש. מניחים כל צד תא להחליק כיסוי מיובש למטה על טיפת הגברה.מעבירים את מכסה הצלחת לתא לח ודגירה לילה בטמפרטורת החדר ובחושך. למחרת, להחזיר את החלקות הכיסוי ל הבאר של צלחת 24 היטב. הוסף 5X SSCT המכיל DAPI בריכוז של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר לכל באר ודגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.לאחר מכן, לשטוף את הדגימות פעמיים עם SSCT 5X בטמפרטורת החדר. הר את הכיסוי השטוף מחליק על שקופיות מיקרוסקופ, ולהשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לנתח את התאים ולדמיין את הדגימות. במחקר זה, אוכלוסייה כמעט הומוגנית של פיברובלסטים עוריים אנושיים מבודדת.כתמים Immunofluorescent מגלה כי כמעט 100% של תאים עוריים אנושיים מבודדים מוכתמים באופן חיובי עבור סמנים פיברובלסט עורי, vimentin, קולגן, אבל שלילי עבור סמן קרטינוציטים העורלה האנושי K14. MCPyV virions נוצרים לאחר מכן ולאחר הדמיה של הלהקה של virions MCPyV מרוכז בליבת ההדרגה, 500 שברי מיקרוליטר נאספים MCPyV qPCR מבוצעת כדי לזהות את שברי השיא. תמונות מוכתמות Immunofluorescent של HDFs נגוע MCPyV מוצגים כאן, שבו תאים כי הם LT חיובי, VP1 חיובי, או גם LT ו VP1 חיובי נחשבים חיוביים עבור זיהום MCPyV.מעל 30% מהתאים הם LT חיוביים, ויותר מ- 10%הם VP1 חיוביים. הגנומים MCPyV משוכפלים בתאים הנגועים מזוהים באמצעות דגים HCR-DNA ודגים Immunofluorescent-HCR-DNA. בעוד הדג HCR-DNA חושף את לוקליזציה של דנ"א MCPyV נוכח במפעל השכפול, שיטות Immunofluorescent-HCR-DNA FISH מאפשרות זיהוי בו זמני של דנ"א MCPyV ו- LT חלבון התאמה אישית במרכזי השכפול.כדי להשיג את היעילות הטובה ביותר של זיהום וירוס, חשוב מאוד כי MCPyV מרוכז לפחות 2 x 10 כדי 8 הגנום וירוס למיקרוליטר מאז יודוקסנול רעיל לתאים. בעקבות זיהום MCPyV של fibroblasts עורי, ניתוחים ביולוגיים מולקולריים רבים יכולים להתבצע, כולל immunofluorescence, חסימת מערכת חיסונית, immunopositivication, ו qPCR מבוססי בדיקה. מערכת הזיהום שתיארנו מאפשרת לחוקרים לחקור שלבים של זיהום MCPyV כמו סחר גרעיני ואריזה ויראלית.MCPyV הוא וירוס BSL-2, אבל מעט ידוע על הפוטנציאל שלה פתולוגיה בכמויות שהושגו בסביבה מעבדה. לכן, החוקרים צריכים לנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע חשיפה לנגיף.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

איתור של<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

זיהוי העדינה של סמנים ביולוגיים באמצעות הטבעה מולקולרית מבוסס ביוסנסור קיבולי

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...