Name: merkel cell polyomavirus infection and detection
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Meenhard Херлин (Wistar институт) и д-р м. Селеста Симон (Университет штата Пенсильвания) для предоставления реагентов и технической поддержки. Мы также благодарим членов нашей лаборатории для полезной дискуссии. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (НИЗ) гранты (R01CA187718, R01CA148768 и R01CA142723), NCI рака центр поддержки Грант (NCI Р30 CA016520) и Пенн CFAR премии (P30 AI 045008).

Человека новорожденных иммунохимические были получены от Пенн кожи болезни научно-исследовательский центр. Взрослый фибробластов были получены из выброшенных нормальной кожи после операции. Все протоколы были одобрены в университете Пенсильвании институциональных Наблюдательный ?...

<ol>
	<li>Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).</li><li>Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+integration+of+a+polyomavirus+in+human+Merkel+cell+carcinoma.">Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma.</a> Science. 319, 1096-1100 (2008).</li><li>Lemos, B., Nghiem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+more+deaths+but+still+no+pathway+to+blame.">Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).</li><li>Agelli, M., Clegg, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+primary+Merkel+cell+carcinoma+in+the+United+States.">Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).</li><li>Liu, W., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+infection+and+Merkel+cell+carcinoma.">Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma.</a> Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).</li><li>Harrison, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+Assembly+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Large+T-Antigen+Origin+Binding+Domains+at+the+Viral+Origin.">Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).</li><li>Kwun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimum+Replication+Origin+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Has+a+Unique+Large+T-Antigen+Loading+Architecture+and+Requires+Small+T-Antigen+Expression+for+Optimal+Replication.">The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication.</a> Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).</li><li>Carter, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+overprinting+gene+in+Merkel+cell+polyomavirus+provides+evolutionary+insight+into+the+birth+of+viral+genes.">Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).</li><li>Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+encodes+a+microRNA+with+the+ability+to+autoregulate+viral+gene+expression.">Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression.</a> Virology. 383 (2), 183-187 (2009).</li><li>Theiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Analysis+of+Replicating+Merkel+Cell+Polyomavirus+Genomes+Delineates+the+Viral+Transcription+Program+and+Suggests+a+Role+for+mcv-miR-M1+in+Episomal+Persistence.">A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence.</a> PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycans+and+sialylated+glycans+sequentially+facilitate+Merkel+cell+polyomavirus+infectious+entry.">Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry.</a> PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).</li><li>Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+Tropism+of+BK+and+Merkel+Cell+Polyomaviruses+in+Cell+Culture.">Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture.</a> PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).</li><li>Schowalter, R. M., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Merkel+cell+polyomavirus+minor+capsid+protein.">The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein.</a> PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).</li><li>Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+Merkel+cell+carcinoma.">Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma.</a> Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).</li><li>Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+a+virus-induced+human+cancer.">Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer.</a> Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).</li><li>Hodgson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+Changing+incidence+trends.">Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends.</a> Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).</li><li>Tolstov, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Merkel+cell+polyomavirus+infection+II.+MCV+is+a+common+human+infection+that+can+be+detected+by+conformational+capsid+epitope+immunoassays.">Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays.</a> International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+and+two+previously+unknown+polyomaviruses+are+chronically+shed+from+human+skin.">Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).</li><li>Foulongne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Skin+Microbiota:+High+Diversity+of+DNA+Viruses+Identified+on+the+Human+Skin+by+High+Throughput+Sequencing.">Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing.</a> PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).</li><li>Hopcraft, S. E., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+viruses+and+innate+immunity.">Tumour viruses and innate immunity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+viral+factors+regulating+Merkel+cell+polyomavirus+replication.">Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication.</a> PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).</li><li>Neumann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+and+Particle+Production+by+a+Consensus+Merkel+Cell+Polyomavirus+(MCPyV)+Genome.">Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome.</a> PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).</li><li>Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+DNA+damage+response+factors+localize+to+merkel+cell+polyomavirus+DNA+replication+sites+to+support+efficient+viral+DNA+replication.">Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication.</a> Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+Target+Cells+and+Mechanisms+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection.">Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).</li><li>Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection+of+Animal+Dermal+Fibroblasts.">Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts.</a> Journal of Virology. 92 (4), (2018).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRD4+regulates+Nanog+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).</li><li>Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+higher+gain,+lower+cost,+greater+durability.">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li><li>Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracellular+assembly+of+papillomaviral+vectors.">Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors.</a> Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm</a> (2018)</li></ol>

Методы, описанные выше, включая изоляции фибробластов дермы из ткани кожи человека, подготовка рекомбинантных MCPyV вирионов, заражения культивируемых клеток, immunofluorescent окрашивание и чувствительным методом рыбы адаптирован из HCR технологии, которая следует включить исследователей для а...

Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ (MCPyV) является небольшой, двуцепочечной ДНК вируса, которая была связана с редким, но агрессивных кожи рак, Меркель клеток карциномы (MCC)1,2. MCC, около 33%, показатель смертности превышает меланомы3,4. MCPyV имеет циркулярный геном ~ 5 КБ1,5 пополам некодирующих регулирования региона (NCRR) в ранний и поздний кодирования регионах1. NCRR содержит вирусного происхождения репликации (ОРИ) и двунаправленный промоутеров для вирусных транскрипции6,7. Начале региона кодирует опухолевого антигена белки, называемые большой T (LT), небольшой T (ул), 57kT, альтернативные ORF LT (альт), а также ауторегуляторных Мирна1,8,9,10. Конце региона кодирует белки VP1 капсида и VP211,12,13. LT и sT являются наиболее изученных MCPyV белков и продемонстрировали для поддержки репликации вирусных ДНК и MCPyV индуцированной tumorigenesis5. Клоновых интеграция MCPyV ДНК в геном хост, который наблюдается в до 80% КЦС, скорее всего является причинным фактором для развития вируса позитивные опухоли14,15.
Распространенность MCC утроилось за последние двадцать лет16. Бессимптомной инфекции MCPyV также широко распространена в общей численности населения17,18,19. С увеличением числа диагнозов MCC и высокая распространенность инфекции MCPyV существует необходимость улучшить наше понимание вируса и его онкогенные потенциал. Однако многие аспекты MCPyV биологии и онкогенных механизмы остаются плохо понимали20. Это главным образом потому, что MCPyV реплицирует плохо в установленных клеток линии11,12,21,,2223 и, до недавнего времени, поддерживающие MCPyV клеток кожи инфекция не обнаружили22. Механистический исследования полностью расследовать MCPyV и его взаимодействие с клетки хозяина сдерживаются отсутствием системы культуры клеток для размножения вируса5.
Мы обнаружили, что первичный фибробластов дермы (HDFs) изолированы от новорожденных человека плоть поддержки надежных MCPyV инфекции как в пробирке и ex vivo24. Из этого исследования мы создали первый модель инфекции культуры клеток для MCPyV24. Опираясь на эту модель системы, мы показали, что индукция матрицы металлопротеиназы (СПП) генов WNT/β-катенина сигнальный путь и другие факторы роста стимулирует MCPyV инфекции. Кроме того мы обнаружили, что FDA утвержденных MEK антагонист trametinib эффективно подавляет MCPyV инфекции5,25. Из этих исследований мы также создали набор протоколов для изоляции фибробластов дермы24,25, подготовка MCPyV вирионы11,12, выполняя MCPyV инфекции на фибробластов дермы 24 , 25 и детектирования MCPyV белков, если окрашивание26. Кроме того мы адаптированы на месте ДНК гибридизации цепной реакции (HCR) технология27 для разработки высокочувствительных рыбы техника (HCR-ДНК рыбы) для обнаружения MCPyV ДНК в клетках, инфицированных кожи человека. Эти новые методы будет полезным для изучения инфекционных цикл MCPyV, а также клеточного ответа на инфекцию MCPyV. Клетки водохранилище природного хозяина, которые поддерживают MCPyV инфекции и клетки, которые порождают MCC опухоли остаются неизвестными. Изучить различные типы клеток человека для выявления водохранилище клетки и происхождения опухоли MCC могут применяться методы, которые мы опишем в этой рукописи. Наши установленные методы, такие как HCR-ДНК рыбы, также могут быть использованы в обнаружении других ДНК вирусов опухоли и характеристика принимающей ячейки взаимодействий.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="838">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:185px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">GLUTAMAX I, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td style="width:185px;">R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Collagenase type IV</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dispase II</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">anti-MCPyV LT (CM2B4)</td>
			<td style="width:185px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-136172</td>
			<td>Lot # B2717</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MCV VP1 rabbit</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal serum #10965</td>
			<td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:339px;">Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td>354060</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Benzonase Nuclease</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase</td>
			<td style="width:185px;">EPICENTRE</td>
			<td>E3101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Probe hybridization buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Probe wash buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Amplification buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa 594-labeled hairpins</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td>B4</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R3136</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Buffer PB</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19066</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">blue miniprep spin column</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">T4 ligase</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202T</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagicMark XP</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC5602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

merkel cell polyomavirus infection and detection

Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ (MCPyV) инфекция может приводить к Меркель карцинома (MCC), высоко агрессивной формой рака кожи. Механистический исследования полностью MCPyV молекулярной биологии и расследовать онкогенных механизмы сдерживаются отсутствием адекватных клетки культуры моделей. Здесь мы описывают набор протоколов для выполнения и обнаружения инфекции MCPyV клеток первичной человеческой кожи. Протоколы описывают изоляции фибробластов дермы, подготовка рекомбинантных MCPyV вирионов и обнаружения заражения вирусом, immunofluorescent окрашивание (КРП) и на месте ДНК гибридизации цепной реакции (HCR), которая очень чувствительна флуоресценции в situ гибридизация (рыба) подход. Протоколы здесь могут быть адаптированы заинтересованными исследователями для определения других типов клеток и клеточных линий, которые поддерживают MCPyV инфекции. Описанный подход рыбы также могут быть адаптированы для обнаружения низкий уровень вирусной ДНК в зараженных кожи человека.

Протокол, описанный в этой рукописи позволили изоляции почти однородного населения HDFs (рис. 1). Как показали immunofluorescent окрашивание, почти 100% кожных клеток человека изолированы с помощью условий, описанных в настоящем протоколе были положительно витражи...

Watch this Scientific Journal Video about Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection at JoVE.com

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Здесь мы представляем протокол заразить первичного человека фибробластов дермы с MCPyV. Протокол включает изоляции фибробластов дермы, подготовка вирионы MCPyV, вирусной инфекции, иммунофлюоресценции окрашивание и флуоресценции в гибридизации situ. Этот протокол может быть продлено характеризующих MCPyV хост взаимодействий и открывать другие типы клеток заражаемые по MCPyV.

Меркель клеток ПОЛИОМАВИРУСОВ инфекции и обнаружения

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

Мы представили первую модель клеточной культуры для полиомавирусной инфекции Меркель Cell. Протокол включает в себя изоляцию дермальных фибробластов, подготовку вирусной инфекции MCPyV, иммунофлуоресцентное окрашивание и гибридизацию флуоресцентных на месте. Этот протокол позволяет изучать инфекционный цикл MCPyV и взаимодействия с клетками-хозяинами, избегая при этом артефактов, связанных с чрезмерной экспрессией вирусных генов.Для начала используйте ножницы для обрезки жировой и подкожной ткани от неонатальной ткани человека. Разрежьте образец кожи пополам или четвертям. Поместите ткань в 5 миллилитров по 10 миллиграмм на миллилитр дис-основанного II NPBS, дополненного антибиотико-антимикотической.Инкубировать при 4 градусах по Цельсию на ночь. На следующий день используйте миппы микродиссекции, чтобы тщательно отделить эпидермис от кожных слоев в 10-сантиметровой тарелке. Передача полученной дермальной ткани в 15 миллилитровую коническую трубку, содержащую 5 миллилитров по 2 миллиграмма на миллилитр коллагеназы типа IV в FBS-свободной среде, дополненной антибиотико-анитмикотической.Инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа с периодической тряской в течение четырех-шести часов, пока не останется всего несколько макроскопических агрегатов тканей. После этого используйте 10 миллилитровую пипетку для пипетки образца раствора вверх и вниз энергично 10 раз, выпуская одиночные клетки из дермы. Центрифуга при 180 г в течение пяти минут и отбросить супернатант.Плита диссоциированных клеток в дополненной среде DMEM. Во второй половине дня или вечером, семена 6 миллионов 293TT28 клеток в 10 сантиметров блюдо, содержащее дополнительные DMEM среды. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.На следующее утро убедитесь, что клетки примерно на 50% стекут, затем трансфицируют клетки 66 микролитров трансфектного реагента, 12 микрограммов повторно перелифицированной MCPyV изолируют R17B ДНК, 8,4 микрограмма плазмидного pMtB экспрессии ST и 9,6 микрограммов плазмидной плазминной плазмы LT. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа. На следующий день, когда трансфектируемые клетки почти стекут, попробуйте провести биопсию клеток и перенесите их в 15-сантиметровое блюдо для дальнейшего расширения.Когда это блюдо станет почти стеченным, перенесите клетки в три новых 15-сантиметровых блюда. Когда эти новые блюда станут почти стеченными, урожай клеток, как указано в текстовом протоколе. Центрифуга при температуре 180 г при комнатной температуре в течение пяти минут.Затем удалите супернатант и добавьте один объем клеток магния DPBS. Добавьте 25 микромоляных сульфатов аммония, за которыми следуют 0,5%Triton X-100, 0,1% бензоразы и 0,1% АТФ-зависимой ДНКазы. Хорошо перемешать и инкубировать при 37 градусах по Цельсию на ночь.На следующий день, охладить смесь на льду в течение 15 минут. Затем добавьте 0,17 тома хлорида натрия. Смешайте и инкубировать на льду еще 15 минут.Центрифуга при 12 тысячах г при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. Если супернатант не ясен, аккуратно инвертировать трубку и повторить центрифугу. После этого перенесите супернатант в новую трубку.Повторное потребление гранул в 1 томе DPBS дополнено 0,8 родинок хлорида натрия. Центрифуга при 12 тысячах г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Если супернатант не ясен, аккуратно инвертировать трубку и повторить центрифугу.Смешайте два супернатанта и центрифугу снова при 12 тысячах г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем используйте пипетку для депонации градиентов йодиксанаола в тонкостеные пятими миллилитровые полиалломеры, как указано в текстовом протоколе. Загрузите 3 миллилитров очищенного вирусосодержащего супернатанта поверх подготовленного градиента йодиксаноля.Центрифуга с ротором SW 55 Ti при 234 тысячах г и при 16 градусах Цельсия в течение 3,5 часов, убедившись, что ускорение и замедление замедляются. После завершения ультрацентрифугации соберите 12 фракций в силиконовых трубках. После поддержания и отсоединения клеток, на 10 миллилитров дополненных DMEM и F12 среды к блюду.Перенесите клеточный раствор в 15-миллилитровую трубку. Центрифуга при 180 г в течение двух минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки в дополнительной среде DMEM и F12 при плотности клеток от 20 тысяч до 40 тысяч клеток на миллилитр.Затем семя 200 или 400 микролитров клеточной суспензии дополняется 1 миллиграммом на миллилитр коллагеназы типа IV в каждую колодец 24 или 96 пластин, соответственно. Удалите бульон MCPyV viron из морозильной камеры минус 80 градусов по Цельсию и поместите на лед, чтобы оттаять. Добавьте 1 миллиард эквивалентов вирусного генома MCPyV virions на один микролитер йодиксанаола на каждые 2500-5000 инфицированных клеток.Нажмите на сторону пластины осторожно, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа. Во-первых, исправить клетки на крышку скользит с 4%PFA в PBS в течение 10 минут, а затем мыть крышку скользит дважды с PBS и лечить их с 70%ethanol при четырех градусах по Цельсию на ночь, чтобы пронизать клетки. На следующий день замените этанол буфером гидратации зонда и инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 минут, чтобы предварительно гибридизировать образцы.За 30 минут до окончания предмиоцифизации инкубации разбавьте зонды в раствор гибридизации зонда при разбавлении 1:500 и инкубировать при 45 градусах по Цельсию. Когда инкубации завершены, пипетка примерно 10 микролитров разбавленной смеси зонда на слайд микроскопа для каждого покрытия скольжения. Поместите каждую крышку скольжения ячейки сторону вниз на его соответствующие капли гибридизации смеси.Используя либеральное количество резинового цемента, запечатайте края и заднюю часть каждой крышки скольжения к его слайду. Установите слайд на плоской стороне теплового блока и нагрейте их до 94 градусов по Цельсию в течение трех минут. После этого перенесите слайд в увлажненной камере и инкубировать их при 45 градусах по Цельсию в одночасье.На следующий день используйте типсы, чтобы тщательно очистить резиновый цемент. Поместите крышку скользит клеточной стороне вверх в колодцы 24 хорошо пластины и мыть их с зондом мыть буфер три раза при комнатной температуре. Добавьте 200 микролитров буфера усиления к каждой хорошо содержащей крышку скольжения и инкубации при комнатной температуре в течение 30 до 60 минут.Между тем, аннеал каждый из двух помечены олигонуклеотид шпильки признавая зондов в отдельных трубках ПЦР, нагревая их до 94 градусов по Цельсию в течение 90 секунд, а затем охлаждение их до комнатной температуры в течение 30 минут. Смешайте шпильки вместе в буфер усиления при разбавлении 1:50. Далее, растянуть парафин пленку над открытым лицом 12 хорошо крышкой пластины, чтобы сделать поверхность для усиления реакции.Pipette 50-100 капель микролитров смеси шпильки на парафиновой пленке для каждого покрытия скольжения. Используя типсы, аккуратно снимите каждую крышку с раствора предварительной усиления и коснитесь края до пористой одноразовой салфетки, чтобы высохнуть. Поместите каждую высушенную крышку скольжения ячейки вниз на капельку усиления.Перенесите крышку пластины в увлажненные камеры и инкубировать на ночь при комнатной температуре и в темноте. На следующий день, вернуть крышку скользит к колодцам 24 пластины скважины. Добавьте 5X SSCT, содержащий DAPI с концентрацией 0,5 микрограмма на миллилитр к каждой колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа.После этого, мыть образцы дважды с 5X SSCT при комнатной температуре. Намонтируйте вымытую крышку скользит по слайдам микроскопа и используйте перевернутый флуоресцентный микроскоп для анализа клеток и изображения образцов. В этом исследовании, почти однородной популяции человека дермальной фибробластов изолированы.Иммунофлюоресцентное окрашивание показывает, что почти 100% изолированных человеческих дермальных клеток положительно окрашены дермальными фибробластными маркерами, виментином и коллагеном, но отрицательны для маркера кератиноцитов человека К14. ЗАТЕМ генерируются вирионы MCPyV, и после визуализации полосы вирионов MCPyV, сосредоточенных в ядре градиента, собирается 500 фракций микролитров и выполняется MCPyV qPCR для определения пиковых фракций. Иммунофлюоресцентные окрашенные изображения HDFs инфицированных MCPyV показаны здесь, где клетки, которые являются ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМи LT, VP1 положительные, или как LT и VP1 положительные считаются положительными для инфекции MCPyV.Более 30% клеток являются ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМи LT, и более 10% являются положительными VP1. Геномы MCPyV, реплицируемые в инфицированных клетках, обнаруживаются как с помощью HCR-ДНК FISH, так и с помощью 60-х 300-х х 4 х 000 м. В то время как HCR-DNA FISH показывает локализацию ДНК MCPyV, присутствуют на фабрике репликации, методы Immunofluorescent-HCR-DNA FISH позволяют одновременно обнаруживать как ДНК MCPyV, так и со-локализацию белка LT в центрах репликации.Для достижения наилучшей эффективности вирусной инфекции, очень важно, что MCPyV концентрируется, по крайней мере 2 х 10 до 8-го генома вируса на микролитер, так как иодоксанол является токсичным для клеток. После заражения MCPyV кожных фибробластов, многие молекулярные биологические анализы могут быть выполнены, в том числе иммунофторесценции, иммуно-блокирующие, иммунопозитив, и qPCR основе анализа. Инфекционная система, которую мы описали, позволяет исследователям изучать стадии заражения MCPyV, такие как ядерная торговля и вирусная упаковка.MCPyV является вирусом BSL-2, но мало что известно о его потенциале для патологии в количествах, достигнутых в лабораторных условиях. Поэтому исследователи должны принять меры предосторожности, чтобы избежать контакта с вирусом.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Выявление инфекционных Касперского с поля, собранные Комары от Vero Пробирной культуры клеток

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Визуальный анализов для мониторинга T6SS-опосредованной Бактериальные конкурса

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

обнаружение<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Вариант поверхности гликопротеин Переключение с помощью магнитных Активированный сортировки клеток и проточной цитометрии

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Сверхчувствительная обнаружения биомаркеров с помощью молекулярного импринтинга основе емкостной биосенсор

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Обнаружение Инфламмасома активации и Pyroptotic клеточной гибели в мышиных макрофагов, костного мозга, полученных

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...