Name: merkel cell polyomavirus infection and detection
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00
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Los autores desean agradecer al Dr. Meenhard Herlyn (Instituto de Wistar) y el Dr. M. Celeste Simón (Universidad de Pennsylvania) reactivos y apoyo técnico. También agradecemos a los miembros de nuestros laboratorios de discusión útil. Este trabajo fue apoyado por las donaciones de institutos nacionales de salud (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 y R01CA142723), la beca de apoyo de centro NCI cáncer (NCI P30 CA016520) y el premio Penn CFAR (P30 AI 045008).

Prepucio neonatal humana fueron obtenido del centro de investigación de la enfermedad de la piel de Penn. Fibroblastos humanos adultos fueron obtenidos de piel normal desechada después de la cirugía. Todos los protocolos fueron aprobados por la Universidad de Pennsylvania Junta de revisión institucional.
1. aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos
<ol><li>Utilice un par de tijeras recorte el tejido subcutáneo y grasa de prepucio neonatal humano y cortar la muestra de piel en mitade...

<ol>
	<li>Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).</li><li>Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+integration+of+a+polyomavirus+in+human+Merkel+cell+carcinoma.">Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma.</a> Science. 319, 1096-1100 (2008).</li><li>Lemos, B., Nghiem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+more+deaths+but+still+no+pathway+to+blame.">Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).</li><li>Agelli, M., Clegg, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+primary+Merkel+cell+carcinoma+in+the+United+States.">Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).</li><li>Liu, W., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+infection+and+Merkel+cell+carcinoma.">Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma.</a> Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).</li><li>Harrison, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+Assembly+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Large+T-Antigen+Origin+Binding+Domains+at+the+Viral+Origin.">Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).</li><li>Kwun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimum+Replication+Origin+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Has+a+Unique+Large+T-Antigen+Loading+Architecture+and+Requires+Small+T-Antigen+Expression+for+Optimal+Replication.">The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication.</a> Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).</li><li>Carter, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+overprinting+gene+in+Merkel+cell+polyomavirus+provides+evolutionary+insight+into+the+birth+of+viral+genes.">Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).</li><li>Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+encodes+a+microRNA+with+the+ability+to+autoregulate+viral+gene+expression.">Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression.</a> Virology. 383 (2), 183-187 (2009).</li><li>Theiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Analysis+of+Replicating+Merkel+Cell+Polyomavirus+Genomes+Delineates+the+Viral+Transcription+Program+and+Suggests+a+Role+for+mcv-miR-M1+in+Episomal+Persistence.">A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence.</a> PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycans+and+sialylated+glycans+sequentially+facilitate+Merkel+cell+polyomavirus+infectious+entry.">Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry.</a> PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).</li><li>Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+Tropism+of+BK+and+Merkel+Cell+Polyomaviruses+in+Cell+Culture.">Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture.</a> PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).</li><li>Schowalter, R. M., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Merkel+cell+polyomavirus+minor+capsid+protein.">The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein.</a> PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).</li><li>Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+Merkel+cell+carcinoma.">Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma.</a> Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).</li><li>Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+a+virus-induced+human+cancer.">Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer.</a> Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).</li><li>Hodgson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+Changing+incidence+trends.">Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends.</a> Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).</li><li>Tolstov, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Merkel+cell+polyomavirus+infection+II.+MCV+is+a+common+human+infection+that+can+be+detected+by+conformational+capsid+epitope+immunoassays.">Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays.</a> International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+and+two+previously+unknown+polyomaviruses+are+chronically+shed+from+human+skin.">Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).</li><li>Foulongne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Skin+Microbiota:+High+Diversity+of+DNA+Viruses+Identified+on+the+Human+Skin+by+High+Throughput+Sequencing.">Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing.</a> PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).</li><li>Hopcraft, S. E., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+viruses+and+innate+immunity.">Tumour viruses and innate immunity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+viral+factors+regulating+Merkel+cell+polyomavirus+replication.">Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication.</a> PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).</li><li>Neumann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+and+Particle+Production+by+a+Consensus+Merkel+Cell+Polyomavirus+(MCPyV)+Genome.">Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome.</a> PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).</li><li>Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+DNA+damage+response+factors+localize+to+merkel+cell+polyomavirus+DNA+replication+sites+to+support+efficient+viral+DNA+replication.">Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication.</a> Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+Target+Cells+and+Mechanisms+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection.">Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).</li><li>Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection+of+Animal+Dermal+Fibroblasts.">Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts.</a> Journal of Virology. 92 (4), (2018).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRD4+regulates+Nanog+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).</li><li>Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+higher+gain,+lower+cost,+greater+durability.">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li><li>Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracellular+assembly+of+papillomaviral+vectors.">Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors.</a> Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm</a> (2018)</li></ol>

Los métodos descritos arriba, incluyendo el aislamiento de fibroblastos dérmicos de tejido de la piel humana, preparación de viriones recombinantes de MCPyV, infección de las células cultivadas, coloración inmunofluorescente y un método sensible de peces adaptado de tecnología HCR, que debe permitir a los investigadores a analizar MCPyV infección27. Uno de los pasos más críticos para lograr MCPyV infección in vitro es la producción de preparaciones de virus de alto título. Utilizando...

Polyomavirus de la célula de Merkel (MCPyV) es un virus ADN pequeño, doble hebra que se ha asociado con un cáncer de piel raro pero agresivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. La tasa de mortalidad de MCC, alrededor del 33%, supera la de melanoma3,4. MCPyV tiene un genoma circular de ~ 5 kb1,5 atravesada por una región reguladora no codificante (NCRR) en regiones1codificación de temprano y tarde. El NCRR contiene el origen viral de replicación (Ori) y de bidireccional promotores de transcripción viral6,7. La región temprana codifica proteínas de antígeno de tumor llamadas grandes T (LT), pequeño T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), así como una hay miRNA1,8,9,10. La región tardía codifica las proteínas de la cápside VP1 y VP211,12,13. LT y sT son las proteínas de MCPyV mejor estudiadas y han demostrado para apoyar la replicación de ADN viral y la tumorigénesis inducida por MCPyV5. Integración clonal de MCPyV ADN en el genoma del anfitrión, que se ha observado en hasta un 80% de la MCC, es probablemente un factor causal para tumor virus-positivo de desarrollo14,15.
La incidencia de CCM se ha triplicado en los últimos veinte años16. MCPyV la infección asintomática también es generalizada en la población general de18,17,19. Con el creciente número de diagnósticos MCC y la alta prevalencia de infección por MCPyV, hay una necesidad de mejorar nuestra comprensión del virus y su potencial oncogénico. Sin embargo, muchos aspectos de la biología MCPyV y mecanismos oncogénicos siguen siendo mal entendidos20. Esto es en gran parte porque MCPyV mal se replica en células establecidas líneas11,12,21,,,2223 y, hasta hace poco, la piel las células capaces de soportar MCPyV la infección no había sido descubierto22. Estudio de mecanismos para investigar completamente MCPyV y su interacción con las células huésped se ha visto obstaculizado por la falta de sistema de cultivo de células para propagar el virus5.
Hemos descubierto que fibroblastos dérmicos humanos primarios (HDFs) aislaron de prepucio humano neonatal soporte robusto MCPyV la infección tanto en vitro y ex vivo24. De este estudio, estableció el primer modelo de infección de cultura celular MCPyV24. Basándose en este modelo de sistema, demostró que la inducción de genes de matriz metaloproteinasa (MMP) por la WNT/β-catenina señalización de vía y otros factores de crecimiento estimula la infección MCPyV. Por otra parte, encontramos que el aprobado por la FDA MEK antagonista trametinib impide eficazmente la infección de MCPyV5,25. De estos estudios, también establecimos un conjunto de protocolos para el aislamiento de los fibroblastos dérmicos humanos24,25, preparación MCPyV viriones11,12, realizar la infección MCPyV en fibroblastos dérmicos humanos 24 , detección de MCPyV de proteínas por tinción IF26y 25 . Además, adaptamos la in situ ADN hibridación la reacción en cadena (HCR) tecnología27 para desarrollar una técnica altamente sensible de pescado (HCR-DNA FISH) para la detección de ADN MCPyV en las células infectadas de la piel humana. Estos nuevos métodos serán útiles para estudiar el ciclo infeccioso de MCPyV, así como la respuesta celular a la infección por MCPyV. Las células de depósito de huéspedes naturales que mantienen la infección MCPyV y las células que dan origen a tumores MCC sigue siendo desconocidas. Las técnicas que describimos en este manuscrito podrían aplicarse para examinar varios tipos de células humanas para identificar tanto las células de depósito y el origen de tumores MCC. Nuestros métodos establecidos, tales como pescados de HCR-DNA, también podrían ser empleados en la detección de otros virus ADN de tumor y la caracterización de las interacciones de la célula huésped.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="838">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:185px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">GLUTAMAX I, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td style="width:185px;">R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Collagenase type IV</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dispase II</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">anti-MCPyV LT (CM2B4)</td>
			<td style="width:185px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-136172</td>
			<td>Lot # B2717</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MCV VP1 rabbit</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal serum #10965</td>
			<td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:339px;">Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td>354060</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Benzonase Nuclease</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase</td>
			<td style="width:185px;">EPICENTRE</td>
			<td>E3101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Probe hybridization buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Probe wash buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Amplification buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa 594-labeled hairpins</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td>B4</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R3136</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Buffer PB</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19066</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">blue miniprep spin column</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">T4 ligase</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202T</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagicMark XP</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC5602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

merkel cell polyomavirus infection and detection

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infección puede conducir al carcinoma de la célula de Merkel (MCC), una forma altamente agresiva de cáncer de piel. Estudio de mecanismos para investigar completamente MCPyV molecular biología y mecanismos oncogénicos ha visto obstaculizado por la falta de modelos de cultivo celular adecuado. Aquí, describimos un conjunto de protocolos para realizar y detectar MCPyV la infección de células de piel humana primaria. Los protocolos describen el aislamiento de los fibroblastos dérmicos humanos, preparación de viriones recombinantes de MCPyV y la detección de infección por el virus por tinción de inmunofluorescencia (IF) y in situ hibridación de ADN reacción en cadena (HCR), que es muy sensible fluorescencia en el enfoque de situ del hibridación (pescado). Los protocolos en este documento pueden ser adaptados por los investigadores interesados a identificar otros tipos de células o líneas celulares compatibles con infección MCPyV. El enfoque descrito de pescado también podría adaptarse para detectar bajos niveles de ADN viral presente en la piel humana infectada.

El protocolo descrito en este manuscrito permitieron el aislamiento de una población casi homogénea de HDFs (figura 1). Según lo demostrado por la coloración inmunofluorescente, casi el 100% de los aislados de las células cutáneas humanas usando las condiciones descritas en este protocolo fueron positivamente mancharon para el colágeno, el vimentin y marcadores de fibroblastos dérmicos yo24, pero negativo para el ser humano mar...

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Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Aquí, presentamos un protocolo para infectar fibroblastos dérmicos humanos primarios con MCPyV. El protocolo incluye aislamiento de fibroblastos dérmicos, preparación de viriones MCPyV, infección por el virus, tinción de inmunofluorescencia y fluorescencia hibridación in situ. Este protocolo puede ampliarse para caracterizar las interacciones MCPyV-host y descubrir otros tipos de células infectables por MCPyV.

Poliomavirus de células de Merkel la infección y la detección

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

Presentamos el primer modelo de cultivo celular para la infección por poliomavirus celular de Merkel. El protocolo incluye el aislamiento de los fibroblastos dérmicos, la preparación de la infección por el virus MCPyV, la tinción inmunofluorescente y la hibridación fluorescente in situ. Este protocolo permite estudiar el ciclo infeccioso del MCPyV y las interacciones con las células huésped, evitando al mismo tiempo los artefactos asociados con la sobreexpresión de genes virales.Para empezar, usa un par de tijeras para cortar la grasa y el tejido subcutáneo del prepucio neonatal humano. Corte la muestra de piel en mitades o cuartos. Colocar el tejido en 5 mililitros de 10 miligramos por mililitro desinfado II NPBS, complementado con antibiótico-antimicótico.Incubar a 4 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, usa fórceps de microdisección para separar cuidadosamente la epidermis de las capas dérmicas en una placa de 10 centímetros. Transfiera el tejido dérmico resultante a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 5 mililitros de 2 miligramos por mililitro de colágeno tipo IV en un medio libre de FBS complementado con antibiótico-anitmicótico.Incubar la muestra a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono con temblores periódicos durante cuatro a seis horas, hasta que sólo queden unos pocos agregados de tejido macroscópico. Después de esto, utilice una pipeta de 10 mililitros para pipetear la solución de muestra hacia arriba y hacia abajo vigorosamente 10 veces, liberando células individuales de la dermis. Centrifugar a 180 g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.Placar las células disociadas en medio DMEM suplementado. Por la tarde o por la noche, sembra 6 millones de células 293TT28 en un plato de 10 centímetros que contiene un medio DMEM suplementado. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.A la mañana siguiente, asegúrese de que las células son aproximadamente 50%confluentes, luego transfect las células con 66 microlitros de reactivo de transfección, 12 microgramos de ADN R17B aislado de MCPyV re-ligado, 8,4 microgramos de pMtB de plásmido de expresión ST, y 9,6 microgramos de plásmido de expresión LT pADL. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, cuando las células trans infectadas son casi confluentes, tripas las células y las transfiere a un plato de 15 centímetros para una expansión continua.Cuando ese plato se vuelva casi confluente, transfiera las células a tres nuevos platos de 15 centímetros. Cuando esos nuevos platos se vuelvan casi confluentes, cosecha las células como se describe en el protocolo de texto. Centrifugar a 180 g a temperatura ambiente durante cinco minutos.A continuación, retire el sobrenadante y agregue un volumen celular de magnesio DPBS. Añadir 25 sulfatos micromolares de amonio, seguidos de 0.5%Triton X-100, 0.1%benzonasa, y 0.1% de un DNAse dependiente de ATP. Mezclar bien e incubar a 37 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, enfríe la mezcla sobre hielo durante 15 minutos. A continuación, agregue 0,17 volumen de cloruro de sodio. Mezclar e incubar sobre hielo durante otros 15 minutos.Centrifugar a 12 mil g a 4 grados centígrados durante 10 minutos. Si el sobrenadante no está claro, invierta suavemente el tubo y repita la centrifugación. Después de esto, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.Resuspender el pellet en 1 volumen de DPBS complementado con 0,8 moles de cloruro de sodio. Centrifugar a 12 mil g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Si el sobrenadante no está claro, invierta suavemente el tubo y repita la centrifugación.Combine los dos sobrenadantes y centrifugar de nuevo a 12 mil g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, utilice una pipeta para depositar gradientes de iodixanol en tubos de polialómero de cinco mililitros de paredes delgadas como se describe en el protocolo de texto. Cargue 3 mililitros del sobrenadante que contiene virus clarificado encima del gradiente de yodoxanol preparado.Centrifugar con un rotor SW 55 Ti a 234 mil g y a 16 grados Celsius durante 3,5 horas, asegurándose de reducir la aceleración y la desaceleración. Una vez completada la ultracentrifugación, recoja 12 fracciones en tubos siliconizados. Después de mantener y separar las células, a 10 mililitros de DMEM suplementado y F12 medio al plato.Transfiera la solución celular a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 180 g durante dos minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un medio DMEM y F12 suplementado con una densidad celular entre 20 mil y 40 mil células por mililitro.Luego, semilla 200 o 400 microlitros de la suspensión celular complementados con 1 miligramo por mililitro de colágeno tipo IV en cada pozo de una placa de 24 o 96 pozos, respectivamente. Retire el material de viron MCPyV del congelador Celsius de menos 80 grados y colóquelo sobre hielo para descongelarlo. Agregue 1 mil millones de equivalentes de genoma viral de viriones MCPyV por un microlitro de yodoxanol por cada 2500 a 5000 células que se infecten.Toque suavemente el lado de la placa e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Primero, fija las células en los resbalones de la cubierta con 4%PFA en PBS durante 10 minutos, luego lava los resbalones de la cubierta dos veces con PBS y trátalos con 70% de etanol a cuatro grados Celsius durante la noche para permeabilizar las células. Al día siguiente, reemplace el etanol con el tampón de hidratación de la sonda e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos para pre-hibridación de las muestras.30 minutos antes del final de la incubación previa a la hibridación, diluir las sondas en la solución de hibridación de sondas a una dilución de 1:500 e incubar a 45 grados centígrados. Una vez completadas las incubaciones, pipetee aproximadamente 10 microlitros de la mezcla de sonda diluida en un portaobjetos del microscopio para cada resbalón de cubierta. Coloque cada lado de la celda deslizante de la cubierta hacia abajo en su gota respectiva de mezcla de hibridación.Usando una cantidad liberal de cemento de goma, sellar los bordes y la parte posterior de cada cubierta se deslizan a su diapositiva. Ajuste la corredera en el lado plano de un bloque de calor y caliente a 94 grados Celsius durante tres minutos. Después de esto, transfiera el portaobjetos a una cámara humidificada e incubarlos a 45 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, utilice fórceps para despegar cuidadosamente el cemento de goma. Coloque la cubierta desliza el lado de la celda hacia arriba en los pozos de una placa de 24 pozos y lávelos con tampón de lavado de sonda tres veces a temperatura ambiente. Añadir 200 microlitros de tampón de amplificación a cada pocótetro que contenga un resbalón de cubierta e incubar a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos.Mientras tanto, recose cada una de las dos horquillas de oligonucleótidos etiquetadas reconociendo las sondas en tubos PCR separados calentándolas a 94 grados centígrados durante 90 segundos, y luego enfriándolas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mezclar las horquillas en tampón de amplificación en una dilución de 1:50. A continuación, estirar la película de parafina sobre la cara abierta de una tapa de placa de 12 pozos para hacer una superficie para la reacción de amplificación.Pipeta 50-100 gotas de microlitro de la mezcla de horquillas en la película de parafina para cada resbalón de cubierta. Con fórceps, retire cuidadosamente cada resbalón de la cubierta de la solución de preamplificación y toque el borde hasta una toallita desechable porosa para secar. Coloque cada lado de la celda del resbalón de la cubierta seca hacia abajo en una gota de amplificación.Transfiera la tapa de la placa a una cámara humidificada e incubar durante la noche a temperatura ambiente y en la oscuridad. Al día siguiente, devuelva los recibos de la cubierta a los pozos de la placa de 24 pozos. Añadir 5X SSCT que contenga DAPI a una concentración de 0,5 microgramos por mililitro a cada pozo e incubar a temperatura ambiente durante una hora.Después de esto, lave las muestras dos veces con 5X SSCT a temperatura ambiente. Monte los resbalones de la cubierta lavada en los portaobjetos del microscopio y utilice un microscopio de fluorescencia invertido para analizar las células y la imagen de las muestras. En este estudio, se aísla una población casi homogénea de fibroblastos dérmicos humanos.La tinción inmunofluorescente revela que casi el 100% de las células dérmicas humanas aisladas se tiñen positivamente para marcadores de fibroblastos dérmicos, vimentina y colágeno, pero negativas para el marcador de queratinocitos de preescero humano K14. A continuación, se generan viriones MCPyV y después de visualizar la banda de viriones MCPyV concentrada en el núcleo del gradiente, se recogen 500 fracciones de microlitros y se realiza MCPyV qPCR para identificar las fracciones máximas. Las imágenes manchadas inmunofluorescentes de HDF infectados con MCPyV se muestran aquí, donde las células que son LT positivas, VP1 positivas o LT y VP1 positivas se consideran positivas para la infección por MCPyV.Más del 30% de las células son LT positivas, y más del 10% son VP1 positivas. Los genomas MCPyV replicados en las células infectadas se detectan utilizando tanto el PECE DE ADN HCR como el FISH de ADN inmunofluorescente. Mientras que el FISH DE ADN-HCR revela la localización del ADN MCPyV presente en la fábrica de replicación, los métodos de PECES inmunofluorescentes-HCR-ADN permiten la detección simultánea de ADN MCPyV y la co-localización de proteínas LT en los centros de replicación.Para lograr la mejor eficiencia de infección por virus, es muy importante que el MCPyV se concentre al menos en 2 x 10 a 8o genoma del virus por microlitro ya que el iodoxanol es tóxico para las células. Después de la infección por MCPyV de los fibroblastos dérmicos, se pueden realizar muchos análisis biológicos moleculares, incluyendo inmunofluorescencia, inmunobloqueo, inmunopositivicción y ensayo basado en qPCR. El sistema de infección que hemos descrito hace posible que los investigadores estudien etapas de la infección por MCPyV como el tráfico nuclear y el empaquetado viral.MCPyV es un virus BSL-2, pero poco se sabe sobre su potencial de patología en las cantidades alcanzadas en un entorno de laboratorio. Por lo tanto, los investigadores deben tomar precauciones para evitar la exposición al virus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

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Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

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A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Un ensayo visual para monitorear T6SS mediada por la competencia bacteriana

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Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detección de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Detección ultrasensible de biomarcadores utilizando una impresión Molecular basado Biosensor capacitiva

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...