Name: an induction system for clustered stomata by sugar solution immersion treatment in arabidopsis thaliana seedlings
Uploaded: 2019-02-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants à m. Seiichiro Hasezawa pour son soutien de notre travail. Ce travail a été prise en charge par des subventions de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) KAKENHgrant numéros 17K 19380 18 H 05492, de la Fondation Sumitomo une subvention pour des projets de recherche scientifique fondamentale accorder nombre 160146 et la fondation de Canon à T.H. Ce système expérimental a été développé sous un soutien financier à partir du nombre de pages jsp KAKENHgrant 26891006 à K. A. Nous remercions Robbie Lewis, M.Sc., du groupe Edanz (www.edanzediting.com/ac) pour l’édition d’un projet du manuscrit.

1. préparation de la Solution moyen 3 % contenant du saccharose 1/2 Murashige-Skoog
<ol><li>Ajouter 1,1 g de sels milieu Murashige-Skoog et 15 g de saccharose dans un bécher.</li>
	<li>Ajouter 490 mL d’eau distillée et mélanger bien à l’aide d’une barre de remuer.</li>
	<li>Ajuster le pH de 5,8 à l’aide de KOH.</li>
	<li>Diluer dans 500 mL d’eau distillée et transvaser la solution dans une bouteille moyenne.</li>
	<li>Stérilisez la solution par autoclavage (121 ° C, 20 min). Si ne pas utilisée immé...

<ol>
	<li>Raschke, K., Fellows, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+movement+in+Zea+mays:+shuttle+of+potassium+and+chloride+between+guard+cells+and+subsidiary+cells.">Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells.</a> Planta. 101 (4), 296-316 (1971).</li><li>Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+environmental+responses+of+PATROL1+in+Arabidopsis+subsidiary+cells.">Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells.</a> Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).</li><li>Bergmann, D. C., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development.">Stomatal development.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).</li><li>Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+stomatal+development.">Mechanisms of stomatal development.</a> Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).</li><li>Sakai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+compound+bubblin+induces+stomatal+mispatterning+in+Arabidopsis+by+disrupting+the+intrinsic+polarity+of+stomatal+lineage+cells.">The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells.</a> Development. 144 (3), 499-506 (2017).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+of+plant+stomatal+one-cell-spacing+rule+by+sugar+solution+immersion.">Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion.</a> PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).</li><li>Chen, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+callose+synthase+gene+GSL8+is+required+for+cytokinesis+and+cell+patterning.">The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning.</a> Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).</li><li>Guseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+cell-to-cell+connectivity+and+stomatal+patterning+by+loss-of-function+mutation+in+Arabidopsis+chorus+(glucan+synthase-like+8).">Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8).</a> Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubules+and+fusicoccin+response+in+clustered+stomatal+guard+cells+induced+by+sucrose+solution+immersion.">Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion.</a> Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+solution+induces+clustered+lips.">Sugar solution induces clustered lips.</a> Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).</li><li>Holzinger, A., Buchner, O., L&#252;tz, C., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+formation+of+chloroplast+protrusions+and+stromules+in+mesophyll+cells+of+Arabidopsis+thaliana.">Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana.</a> Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).</li><li>Abe, T., Hashimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microtubule+dynamics+by+expression+of+modified+&#945;-tubulin+protein+causes+right-handed+helical+growth+in+transgenic+Arabidopsis+plants.">Altered microtubule dynamics by expression of modified &#945;-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants.</a> The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).</li><li>Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+plant+cell+surface+dynamics+with+variable-angle+epifluorescence+microscopy.">Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).</li></ol>

Nous avons présenté des protocoles pour l’induction des stomates en cluster dans les semis d’a. thaliana par traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du saccharose. Comme indiqué ici, cette méthode est très simple et ne nécessite aucun compétences spécialisées, mais peut induire efficacement les stomates en cluster. Plus de 45 % des cellules stomatiques sont groupés avec 3 % contenant du saccharose solution moyenne (valeurs moyennes de plus de 20 observations indépendantes)<sup...

La stomie de plante est un organe essentiel pour l’échange de gaz pour la photosynthèse et la transpiration, et déplacement stomatique est réalisé par des changements significatifs dans les cellules de garde par adoption pilotée par l’ion et une sortie d’eau. Au microscope, on peut observer un modèle de distribution espacés de stomates sur les surfaces des feuilles et des tiges. Cette répartition espacée des stomates est considérée pour aider le mouvement stomatique, qui est régi par échange d’ions et l’eau entre les cellules de garde et les voisins des cellules épidermiques1,2. Systèmes d’induction expérimentale de stomates en cluster sont utiles pour étudier l’importance de la distribution espacée de stomates.
Il a été signalé que le regroupement spatial des stomates peut être induit par une modification génétique des gènes principaux pour la différentiation de cellules de garde3,4 ou un traitement avec un composé chimique5. Nous avons également rapporté que traitement d’immersion avec une solution moyenne additionné de sucres y compris le saccharose, glucose, et fructose causé stomatique clustering dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana 6. Réduit de callose dans nouvelles parois séparant les méristémoïdes et les cellules épidermiques a été observée dans l’épiderme de cotylédon imprégnées de saccharose, ce qui suggère que le saccharose solution immersion traitement affecte négativement la paroi cellulaire, ce qui empêche les fuites et action ectopique des produits des gènes clés pour la différenciation des cellules de garde (par exemple les facteurs de transcription) vers adjacentes épidermique cellules6. Un mécanisme similaire a été proposé d’études sur les gsl8/chor des mutants7,8. Notre système expérimental pour l’induction reproductible des stomates en cluster à l’aide de la solution moyenne contenant du saccharose est assez facile et bon marché. Il peut également être utilisé pour étudier les structures intracellulaires comme les organites et le cytosquelette dans les cellules stomatiques cluster lorsqu’il est appliqué à des lignées transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents cette étiquette structures intracellulaires9, 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:685px;" width="686">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:135px;">Sumitomo Bakelite</td>
			<td style="width:168px;">MS-0824R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">Furukawa Denko</td>
			<td style="width:168px;">HPU-50101-PFS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td>Sapphire488-20/O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">510 nm long-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">BA510IF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">524 - 546 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Semrock</td>
			<td style="width:168px;">FF01-535/22-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">530 nm short-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">BA530RIF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">CVI Melles Griot</td>
			<td style="width:168px;">85-YCA-025-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">604 - 644 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Semrock</td>
			<td style="width:168px;">FF01-624/40-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Confocal laser scanning head</td>
			<td style="width:135px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:168px;">CSU10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Confocal laser scanning head</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">FV300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cooled CCD camera</td>
			<td style="width:135px;">Photometrics</td>
			<td style="width:168px;">CoolSNAP HQ2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:168px;">MetaMorph version 7.8.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">FLUOVIEW v5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">Immersion Oil Type-F</td>
			<td>ne = 1.518 (23 degrees)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">IX-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">IX-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:216px;">Murashige and Skoog Plant Salt Mixture</td>
			<td style="width:135px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td style="width:168px;">392-00591</td>
			<td style="width:167px;">Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Objective lens&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35</td>
			<td>NA = 1.35</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Objective lens&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">UPlanAPO 40x / 0.85 NA</td>
			<td>NA = 0.85</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:135px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td style="width:168px;">196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an induction system for clustered stomata by sugar solution immersion treatment in arabidopsis thaliana seedlings

Stomates mouvement intervient dans les échanges gazeux plante, qui est essentiel pour la photosynthèse et la transpiration. Stomates d’ouverture et de fermeture sont réalisées par une augmentation significative et diminuent du volume de cellules de garde, respectivement. Navette de transport des ions et l’eau se produit entre les cellules de garde et de plus grandes cellules épidermiques voisines durant le mouvement stomatique, la distribution espacée des stomates de la plante est considérée comme une distribution optimale de mouvement stomatique. Des systèmes expérimentaux pour perturber le modèle espacé des stomates sont utiles pour examiner l’importance de l’enchaînement d’espacement. Plusieurs gènes clés associées à la distribution de stomates espacée ont été identifiés, et les stomates en cluster peuvent être induites expérimentalement en altérant ces gènes. Alternativement, des stomates en cluster peuvent être également induites par les traitements exogènes sans modification génétique. Dans cet article, nous décrivons un système simple induction pour cluster stomates chez Arabidopsis thaliana plantules par traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du saccharose. Notre méthode est simple et directement applicables aux lignes transgéniques ou mutants. Plus gros chloroplastes sont présentés comme une caractéristique biologique cellulaire des cellules de garde en cluster induite par le saccharose. En outre, une image microscopique confocale représentative des microtubules corticaux est montrée comme un exemple d’observation intracellulaire des cellules de garde en cluster. L’orientation radiale des microtubules corticaux est maintenue dans les cellules de garde en cluster comme des cellules stomatiques espacés dans des conditions de contrôle.

Ici, le protocole pour une simple méthode d’induction de stomates clustering avec contenant du saccharose de la solution moyenne chez les plantules d’a. thaliana a été présenté. Les cellules stomatiques cluster cultivés en solution moyenne contenant du saccharose (Figure 1B) ont des chloroplastes plus grandes que les cellules stomatiques cultivés dans des conditions de contrôle sans sucrose (Figure 1<...

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An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Ce protocole vise à démontrer comment induire des stomates en cluster dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana en traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du sucre et observer des structures intracellulaires tels que les chloroplastes et les microtubules dans les cellules stomatiques en cluster à l’aide de confocal laser microscopie.

Un système d’Induction de stomates groupées par traitement de Immersion de Solution de sucre chez les plantules de Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cette méthode a répondu à une question clé de la biologie du développement végétaux. C’est-à-dire, quelle est l’importance de la distribution spatiale des stomates? Notre système d’induction pour les stomates groupées utilisant la solution de saccharose est assez facile et directement applicable aux lignées transgéniques ou mutantes d’Arabidopsis thaliana.Pour commencer, ajouter 1,1 gramme de sels moyens Murashige-Skoog et 15 grammes de saccharose à un bécher. Ajouter 490 millilitres d’eau distillée au bécher et mélanger avec la barre de remue-ménage. Utilisez de l’hydroxyde de potassium pour ajuster le pH à 5,8.Ensuite, diluer la solution avec 500 millilitres d’eau distillée et transférer la solution diluée dans une bouteille moyenne. Après cela, autoclave la solution. Préparez la solution de stérilisation selon le protocole texte.Ensuite, en travaillant dans des conditions aseptiques, placez environ 50 graines transgéniques d’A.thaliana portant un marqueur fluorescent dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter ensuite un millilitre de 70% d’éthanol au tube et mélanger en inversant le tube cinq fois. Après avoir laissé couler les graines au fond du tube, retirer délicatement l’éthanol à l’aide d’une micropipette.Ajouter un millilitre de solution de stérilisation aux graines et inverser le tube cinq fois pour mélanger. Retirer délicatement la solution de stérilisation des graines à l’aide d’une micropipette. Ajouter ensuite un millilitre d’eau stérile.Ajouter 1,5 millilitres de la solution Murashige-Skoog à chaque puits d’une plaque de puits de 24 puits. Ajouter ensuite deux graines stérilisées à chaque puits. À l’aide de deux couches de parafilm, collez le couvercle à la plaque.Ensuite, transférez la plaque dans une chambre de croissance pour l’incuber pendant 14 jours. Tout d’abord, transférez 30 microlitres de solution Murashige-Skoog de la plaque de puits 24 au centre d’une toboggan en verre. À l’aide de ciseaux disséquants, retirer le cotyledon d’un semis vieux de 14 jours.Flottez le cotyledon avec le côté observation face vers le haut sur la chute de la solution Murashige-Skoog. Préparez le cotyledon selon les méthodes précédemment décrites dans le Journal of Visualized Experiments. Placez le spécimen sur la scène d’un microscope laser confocal.Enfin, utilisez l’éclairage du champ lumineux pour sélectionner les cellules de garde groupées pour l’observation. Dans ce protocole, l’amas stomatal a été induit dans les semis d’A.thaliana. Les cellules de garde groupées cultivées dans le saccharose contenant des chloroplastes plus gros que les cellules de garde cultivées dans des conditions sans saccharose.L’agrandissement des chloroplastes a été confirmé avec un marqueur stroma chloroplaste et des autofluorescents de chlorophylle, suggérant que le traitement de saccharose ait eu comme conséquence l’accumulation de grain d’amidon dans les chloroplastes. En outre, l’observation confocale de la baignoire-6 de GFP a indiqué que les microtubules corticals étaient radialement orientés dans les cellules sucrose-traitées, juste comme dans les cellules de garde saccharose-libres. En fait, nous avons découvert cette méthode par accident.Après la découverte, nous avons examiné la réponse environnementale des stomates groupées. Nous croyons que notre système pourrait aider à examiner l’importance de la distribution des stomates.

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