Name: an induction system for clustered stomata by sugar solution immersion treatment in arabidopsis thaliana seedlings
Uploaded: 2019-02-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings at JoVE.com

Wir sind dankbar, Prof. Seiichiro Hasezawa für seine freundliche Unterstützung unserer Arbeit. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Japan Society unterstützt, für die Promotion of Science (JSPS) KAKENHgrant 17K 19380 Zahlen und 18 H 05492, der Sumitomo-Foundation für einen Zuschuss für grundlegende Wissenschaft Forschungsprojekte, Anzahl 160146 und die Canon Foundation t.h gewähren. Dieses experimentelle System wurde unter eine finanzielle Unterstützung von der JSPS KAKENHgrant Nummer 26891006, K. A. entwickelt. Wir bedanken uns bei Robbie Lewis, MSc, aus Edanz Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs des Manuskripts.

1. Vorbereitung von 3 % Saccharose-haltige 1/2 Murashige-Skoog mittlere Lösung
<ol><li>Hinzu kommt ein Becherglas 1,1 g Murashige Skoog mittlere Salze und 15 g Saccharose.</li>
	<li>490 mL destilliertem Wasser und mischen Sie gut mit einer rühren.</li>
	<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 5,8 mit KOH.</li>
	<li>Bis 500 mL mit destilliertem Wasser verdünnen und die Lösung in eine mittlere Flasche übertragen.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Lösung durch Autoklavieren (121 ° C, 20 min). Wenn nicht sofort verwendet, kan...

<ol>
	<li>Raschke, K., Fellows, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+movement+in+Zea+mays:+shuttle+of+potassium+and+chloride+between+guard+cells+and+subsidiary+cells.">Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells.</a> Planta. 101 (4), 296-316 (1971).</li><li>Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+environmental+responses+of+PATROL1+in+Arabidopsis+subsidiary+cells.">Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells.</a> Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).</li><li>Bergmann, D. C., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development.">Stomatal development.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).</li><li>Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+stomatal+development.">Mechanisms of stomatal development.</a> Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).</li><li>Sakai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+compound+bubblin+induces+stomatal+mispatterning+in+Arabidopsis+by+disrupting+the+intrinsic+polarity+of+stomatal+lineage+cells.">The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells.</a> Development. 144 (3), 499-506 (2017).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+of+plant+stomatal+one-cell-spacing+rule+by+sugar+solution+immersion.">Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion.</a> PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).</li><li>Chen, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+callose+synthase+gene+GSL8+is+required+for+cytokinesis+and+cell+patterning.">The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning.</a> Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).</li><li>Guseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+cell-to-cell+connectivity+and+stomatal+patterning+by+loss-of-function+mutation+in+Arabidopsis+chorus+(glucan+synthase-like+8).">Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8).</a> Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubules+and+fusicoccin+response+in+clustered+stomatal+guard+cells+induced+by+sucrose+solution+immersion.">Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion.</a> Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+solution+induces+clustered+lips.">Sugar solution induces clustered lips.</a> Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).</li><li>Holzinger, A., Buchner, O., L&#252;tz, C., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+formation+of+chloroplast+protrusions+and+stromules+in+mesophyll+cells+of+Arabidopsis+thaliana.">Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana.</a> Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).</li><li>Abe, T., Hashimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microtubule+dynamics+by+expression+of+modified+&#945;-tubulin+protein+causes+right-handed+helical+growth+in+transgenic+Arabidopsis+plants.">Altered microtubule dynamics by expression of modified &#945;-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants.</a> The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).</li><li>Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+plant+cell+surface+dynamics+with+variable-angle+epifluorescence+microscopy.">Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).</li></ol>

Wir haben Protokolle für die Induktion von gruppierten Spaltöffnungen in A. Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer Saccharose-haltige Mittel Lösung vorgelegt. Wie hier gezeigt, diese Methode ist sehr einfach und erfordert keine spezielle Fähigkeit aber effizient gruppierte Spaltöffnungen induzieren kann. Mehr als 45 % der Schließzellen sind mit 3 % Saccharose-haltige Cluster mittlere Lösung (Mittelwerte von mehr als 20 unabhängige Beobachtungen)6. Darüber hinaus ...

Die Pflanze Stoma ist ein wesentliches Organ für Gasaustausch für Photosynthese und Transpiration und Stomata Bewegung wird durch Veränderungen im Schließzellen durch Ionen-gesteuerte Aufnahme und Abgabe von Wasser erreicht. Unter dem Mikroskop können wir beobachten, ein Abstand Verteilungsmuster von Spaltöffnungen auf der Oberfläche der Blätter und Stängel. Dieser Abstand Verteilung der Spaltöffnungen wird als Stomata Bewegung helfen, die von Wasser und Ionen-Austausch zwischen den Schließzellen und den angrenzenden Epidermiszellen1,2geregelt ist. Experimentellen Induktion Systeme für gruppierte Spaltöffnungen eignen sich für die Untersuchung der Bedeutung der Abstand Verteilung der Spaltöffnungen.
Es wurde berichtet, dass räumliche Bündelung von Spaltöffnungen durch gentechnische Veränderung von Schlüsselgene für Guard Zelle Differenzierung3,4 oder Behandlung mit einer chemischen Verbindung5induziert werden kann. Wir haben auch berichtet, dass Immersion Behandlung mit einer mittleren Lösung mit Zucker Saccharose, Glukose, einschließlich ergänzt und Fruktose verursacht Stomata clustering in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge6. Reduzierte Kallose in neue Zellwänden, die Trennung von Meristemoids und Epidermiszellen beobachtet in der Saccharose behandelt Keimblattes Epidermis, was darauf hindeutet, dass Saccharose Lösung eintauchen Behandlung wirkt sich negativ auf die Zellwand, die verhindert das Auslaufen und ektopische Wirkung der Schlüssel-Genprodukte für Guard-Zell-Differenzierung (z. B. Transkriptionsfaktoren) gegenüber angrenzenden epidermalen Zellen6. Ein ähnlicher Mechanismus wurde von Studien über die gsl8/Chor Mutanten7,8vorgeschlagen. Unsere Experimentiersystem für reproduzierbare Induktion von gruppierten Spaltöffnungen mit Saccharose-haltige Mittel Lösung ist ganz einfach und billig. Es kann auch verwendet werden, zu untersuchen, intrazelluläre Strukturen wie Organellen und dem Zytoskelett in die gruppierten Schließzellen bei transgenen Linien mit dem Ausdruck fluoreszierenden Marker, dass Label intrazellulären Strukturen9, 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:685px;" width="686">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:135px;">Sumitomo Bakelite</td>
			<td style="width:168px;">MS-0824R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">Furukawa Denko</td>
			<td style="width:168px;">HPU-50101-PFS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td>Sapphire488-20/O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">510 nm long-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">BA510IF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">524 - 546 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Semrock</td>
			<td style="width:168px;">FF01-535/22-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">530 nm short-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">BA530RIF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">CVI Melles Griot</td>
			<td style="width:168px;">85-YCA-025-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">604 - 644 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Semrock</td>
			<td style="width:168px;">FF01-624/40-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Confocal laser scanning head</td>
			<td style="width:135px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:168px;">CSU10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Confocal laser scanning head</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">FV300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cooled CCD camera</td>
			<td style="width:135px;">Photometrics</td>
			<td style="width:168px;">CoolSNAP HQ2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:168px;">MetaMorph version 7.8.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">FLUOVIEW v5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">Immersion Oil Type-F</td>
			<td>ne = 1.518 (23 degrees)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">IX-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">IX-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:216px;">Murashige and Skoog Plant Salt Mixture</td>
			<td style="width:135px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td style="width:168px;">392-00591</td>
			<td style="width:167px;">Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Objective lens&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35</td>
			<td>NA = 1.35</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Objective lens&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">UPlanAPO 40x / 0.85 NA</td>
			<td>NA = 0.85</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:135px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td style="width:168px;">196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an induction system for clustered stomata by sugar solution immersion treatment in arabidopsis thaliana seedlings

Stomata Bewegung vermittelt Gasaustausch Pflanze, die für die Photosynthese und Transpiration ist. Stomata öffnen und Schließen erfolgt durch eine deutliche Steigerung und Abnahme bzw. Guard Zellvolumen. Da shuttle-Transport von Ionen und Wasser während der Stomata Bewegung zwischen Schließzellen und größeren benachbarten Epidermiszellen erfolgt, gilt die Abstand Verteilung der Pflanze Spaltöffnungen eine optimale Verteilung für die Stomata Bewegung. Experimentelle Systeme für sind der Abstand Musters der Spaltöffnungen sind nützlich, um den Abstand Muster Bedeutung zu prüfen. Mehrere wichtige Gene verbunden mit dem Abstand Stomata Vertrieb wurden identifiziert und gruppierte Spaltöffnungen experimentell durch die Veränderung dieser Gene induziert werden können. Gruppierte Spaltöffnungen können alternativ auch durch exogene Behandlungen ohne gentechnische Veränderung induziert werden. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Induktionssystem für gruppierte Spaltöffnungen in Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer Saccharose-haltige Mittel Lösung. Unsere Methode ist einfach und unmittelbar zu transgenen oder mutierten Linien. Größere Chloroplasten werden als biologische Zelle Markenzeichen der Saccharose-induzierte gruppierten Schließzellen vorgestellt. Darüber hinaus ist ein repräsentatives konfokale mikroskopische Bild der kortikalen Mikrotubuli der intrazellulären Beobachtung von gruppierten Schließzellen exemplarisch dargestellt. Die radiale Ausrichtung der kortikalen Mikrotubuli wird in gruppierten Schließzellen wie angeordneten Schließzellen in Kontrolle Bedingungen beibehalten.

Hier wurde das Protokoll für eine einfache Methode der Induktion Stomata clustering mit Saccharose-haltige Mittel Lösung in A. Thaliana Sämlinge vorgestellt. Die gruppierten Schließzellen in Saccharose-haltige Mittel Lösung (Abbildung 1B) angebaut haben größere Chloroplasten als Schließzellen in Saccharose free Control Bedingungen (Abb. 1A) angebaut. Die Erweiterung der Chloropla...

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An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Das Ziel dieses Protokolls ist zu zeigen, wie induzieren gruppierte Spaltöffnungen in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer zuckerhaltigen Lösung für mittlere und intrazelluläre Strukturen wie Chloroplasten beobachten und Mikrotubuli in der gruppierten Schließzellen mit konfokale laser-Mikroskopie.

Ein Ansaugsystem für gruppierte Spaltöffnungen durch Zucker Lösung eintauchen Behandlung in Arabidopsis Thaliana Sämlinge

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Diese Methode hat eine Schlüsselfrage der Pflanzenentwicklungsbiologie beantwortet. Das heißt, welche Bedeutung hat die räumliche Verteilung von Stomata? Unser Induktionssystem für geclusterte Stomata mit Saccharoselösung ist ziemlich einfach und direkt auf transgene oder mutierte Linien von Arabidopsis thaliana anwendbar.Zunächst 1,1 Gramm Murashige-Skoog-Mittelsalze und 15 Gramm Saccharose zu einem Becher geben. 490 Milliliter destilliertes Wasser in den Becher geben und mit der Rührstange vermischen. Verwenden Sie Kaliumhydroxid, um den pH-Wert auf 5,8 einzustellen.Anschließend die Lösung mit 500 Milliliter n. Wasser verdünnen und die verdünnte Lösung in eine mittlere Flasche geben. Danach autoklavieren Sie die Lösung. Bereiten Sie die Sterilisationslösung entsprechend dem Textprotokoll vor.Dann, unter aseptischen Bedingungen arbeiten, legen Sie etwa 50 transgene A.thaliana Samen mit einem fluoreszierenden Marker in eine 1,5 Milliliter-Röhre. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter 70% Ethanol in die Röhre und mischen, indem Sie das Rohr fünfmal invertieren. Nachdem Sie die Samen auf den Boden der Röhre sinken lassen, entfernen Sie das Ethanol vorsichtig mit einer Mikropipette.Fügen Sie den Samen einen Milliliter Sterilisationslösung hinzu und kehren Sie die Röhre fünfmal um, um sie zu mischen. Entfernen Sie die Sterilisationslösung vorsichtig mit einer Mikropipette aus den Samen. Dann fügen Sie einen Milliliter steriles Wasser hinzu.1,5 Milliliter der Murashige-Skoog-Lösung zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzufügen. Dann fügen Sie zwei sterilisierte Samen zu jedem Brunnen. Mit zwei Schichten Parafilm, band den Deckel auf die Platte.Als nächstes übertragen Sie die Platte in eine Wachstumskammer, um sie für 14 Tage zu inkubieren. Zuerst übertragen Sie 30 Mikroliter Murashige-Skoog-Lösung von der 24 Well-Platte in die Mitte einer Glasrutsche. Entfernen Sie das Cotyledon mit einer Sezschere von einem 14 Tage alten Sämling.Schwimmen Sie das Kotyledon mit der Beobachtungsseite nach oben auf den Tropfen der Murashige-Skoog-Lösung. Bereiten Sie das Kotyledon gemäß den zuvor im Journal of Visualized Experiments beschriebenen Methoden vor. Stellen Sie die Probe auf die Stufe eines konfokalen Lasermikroskops.Verwenden Sie schließlich die helle Feldbeleuchtung, um gruppierte Schutzzellen für die Beobachtung auszuwählen. In diesem Protokoll wurde stomatale Clusterbildung bei A.thaliana Sämlingen induziert. Die in der Saccharose angebauten Wachzellen mit größeren Chloroplasten als Schutzzellen, die unter saccharosefreien Bedingungen angebaut werden.Die Vergrößerung der Chloroplasten wurde mit einem Chloroplasten-Stroma-Marker und Chlorophyll-Autofluoreszenzen bestätigt, was darauf hindeutet, dass die Saccharosebehandlung zu einer Stärkekornansammlung in den Chloroplasten führte. Zusätzlich ergab die konfokale Beobachtung der GFP-Wanne-6, dass die kortikalen Mikrotubuli in den saccharosebehandelten Zellen radial ausgerichtet waren, genau wie in den saccharosefreien Schutzzellen. Eigentlich haben wir diese Methode zufällig entdeckt.Nach dem Fund untersuchten wir die Umweltreaktion von clustered stomata. Wir glauben, dass unser System helfen könnte, die Bedeutung der Stomata-Verteilung zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Environment

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

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