Name: an induction system for clustered stomata by sugar solution immersion treatment in arabidopsis thaliana seedlings
Uploaded: 2019-02-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings at JoVE.com

Siamo grati a Prof. ssa Seiichiro Hasezawa per il suo gentile sostegno del nostro lavoro. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHgrant numeri 17K 19380 e 18 H 05492, dalla Fondazione per una sovvenzione per progetti di ricerca di scienza base Sumitomo concede numero 160146 e la Canon Foundation di T.H. Questo sistema sperimentale è stato sviluppato sotto un sostegno finanziario dal numero di pagine JSP KAKENHgrant 26891006 a K. A. Ringraziamo Robbie Lewis, MSc, dal gruppo di Esposito (www.edanzediting.com/ac) per la modifica di una brutta copia del manoscritto.

1. preparazione della soluzione medio 3% contenenti saccarosio Murashige 1/2-Skoog
<ol><li>Aggiungere 1,1 g di sali medi Murashige-Skoog e 15 g di saccarosio in un becher.</li>
	<li>Aggiungere 490 mL di acqua distillata e miscelare bene utilizzando una barra per l'agitazione.</li>
	<li>Regolare il pH a 5,8 utilizzando KOH.</li>
	<li>Diluire a 500 mL con acqua distillata e trasferire la soluzione in una bottiglia di media.</li>
	<li>Sterilizzare la soluzione in autoclave (121 ° C, 20 min). Se non utilizzato immediatame...

<ol>
	<li>Raschke, K., Fellows, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+movement+in+Zea+mays:+shuttle+of+potassium+and+chloride+between+guard+cells+and+subsidiary+cells.">Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells.</a> Planta. 101 (4), 296-316 (1971).</li><li>Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+environmental+responses+of+PATROL1+in+Arabidopsis+subsidiary+cells.">Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells.</a> Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).</li><li>Bergmann, D. C., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development.">Stomatal development.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).</li><li>Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+stomatal+development.">Mechanisms of stomatal development.</a> Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).</li><li>Sakai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+compound+bubblin+induces+stomatal+mispatterning+in+Arabidopsis+by+disrupting+the+intrinsic+polarity+of+stomatal+lineage+cells.">The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells.</a> Development. 144 (3), 499-506 (2017).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+of+plant+stomatal+one-cell-spacing+rule+by+sugar+solution+immersion.">Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion.</a> PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).</li><li>Chen, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+callose+synthase+gene+GSL8+is+required+for+cytokinesis+and+cell+patterning.">The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning.</a> Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).</li><li>Guseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+cell-to-cell+connectivity+and+stomatal+patterning+by+loss-of-function+mutation+in+Arabidopsis+chorus+(glucan+synthase-like+8).">Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8).</a> Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubules+and+fusicoccin+response+in+clustered+stomatal+guard+cells+induced+by+sucrose+solution+immersion.">Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion.</a> Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+solution+induces+clustered+lips.">Sugar solution induces clustered lips.</a> Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).</li><li>Holzinger, A., Buchner, O., L&#252;tz, C., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+formation+of+chloroplast+protrusions+and+stromules+in+mesophyll+cells+of+Arabidopsis+thaliana.">Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana.</a> Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).</li><li>Abe, T., Hashimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microtubule+dynamics+by+expression+of+modified+&#945;-tubulin+protein+causes+right-handed+helical+growth+in+transgenic+Arabidopsis+plants.">Altered microtubule dynamics by expression of modified &#945;-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants.</a> The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).</li><li>Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+plant+cell+surface+dynamics+with+variable-angle+epifluorescence+microscopy.">Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).</li></ol>

Abbiamo presentato protocolli per l'induzione di stomi cluster in a. thaliana piantine dal trattamento ad immersione con una soluzione Media contenente saccarosio. Come mostrato qui, questo metodo è molto semplice e non richiede nessuna abilità specializzata ma efficiente può indurre gli stomi cluster. Oltre il 45% delle cellule di guardia sono raggruppati con 3% saccarosio-contenente soluzione medio (valori medi di più di 20 osservazioni indipendenti)6. Inoltre, questo sistema sperim...

Lo stoma di pianta è un organo essenziale per lo scambio di gas per la fotosintesi e traspirazione, e movimento stomatica è compiuto dai cambiamenti significativi nelle cellule di guardia attraverso l'assorbimento dello ione-driven e rilascio di acqua. Sotto un microscopio, possiamo osservare un modello di distribuzione distanziati di stomi sulle superfici delle foglie e steli. Questa distribuzione distanziata di stomi è considerata per aiutare il movimento stomatica, che è regolata da scambio di acqua e ioni tra cellule di guardia e vicine cellule epidermiche1,2. Sistemi ad induzione sperimentale per cluster stomi sono utili per indagare l'importanza della distribuzione distanziata di stomi.
È stato segnalato che spatial clustering di stomi può essere indotta da modificazioni genetiche di geni chiave per la differenziazione delle cellule di guardia3,4 o il trattamento con un composto chimico5. Abbiamo anche riferito che il trattamento ad immersione con una soluzione media completati con zuccheri tra cui saccarosio, glucosio, e fruttosio causato stomatica clustering in cotiledoni di Arabidopsis thaliana piantine6. Callosio ridotta in nuove pareti cellulari che separa meristemoids e cellule epidermiche è stata osservata nell'epidermide saccarosio-trattati cotiledone, suggerendo che il saccarosio soluzione immersione trattamento colpisce negativamente la parete cellulare, che impedisce la fuoriuscita e azione ectopica dei prodotti del gene chiave per la differenziazione delle cellule di guardia (ad es. fattori di trascrizione) verso adiacente epidermica cellule6. Un meccanismo simile è stato suggerito da studi sulla gsl8/chor mutanti7,8. Il nostro sistema sperimentale per induzione riproducibile di stomi cluster utilizzando soluzione Media contenente saccarosio è abbastanza facile ed economico. Può anche essere utilizzato per indagare le strutture intracellulari come organelli e il citoscheletro nelle cellule di guardia del cluster quando applicato a linee transgeniche che esprimono marcatori fluorescenti che etichetta strutture intracellulari9, 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:685px;" width="686">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:135px;">Sumitomo Bakelite</td>
			<td style="width:168px;">MS-0824R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">Furukawa Denko</td>
			<td style="width:168px;">HPU-50101-PFS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td>Sapphire488-20/O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">510 nm long-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">BA510IF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">524 - 546 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Semrock</td>
			<td style="width:168px;">FF01-535/22-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">530 nm short-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">BA530RIF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">CVI Melles Griot</td>
			<td style="width:168px;">85-YCA-025-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">604 - 644 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Semrock</td>
			<td style="width:168px;">FF01-624/40-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Confocal laser scanning head</td>
			<td style="width:135px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:168px;">CSU10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Confocal laser scanning head</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">FV300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cooled CCD camera</td>
			<td style="width:135px;">Photometrics</td>
			<td style="width:168px;">CoolSNAP HQ2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:168px;">MetaMorph version 7.8.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">FLUOVIEW v5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">Immersion Oil Type-F</td>
			<td>ne = 1.518 (23 degrees)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">IX-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">IX-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:216px;">Murashige and Skoog Plant Salt Mixture</td>
			<td style="width:135px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td style="width:168px;">392-00591</td>
			<td style="width:167px;">Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Objective lens&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35</td>
			<td>NA = 1.35</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Objective lens&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">UPlanAPO 40x / 0.85 NA</td>
			<td>NA = 0.85</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:135px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td style="width:168px;">196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an induction system for clustered stomata by sugar solution immersion treatment in arabidopsis thaliana seedlings

Stomatica movimento media lo scambio di gas della pianta, che è essenziale per la fotosintesi e traspirazione. Apertura e di chiusura stomatica sono compiute da un significativo aumento e diminuzione nel volume delle cellule di guardia, rispettivamente. Perché il servizio di trasporto di ioni e acqua avviene tra cellule di guardia e cellule epidermiche vicine più grandi durante il movimento stomatica, la distribuzione distanziata di stomi pianta è considerata una distribuzione ottimale per il movimento stomatica. Sistemi sperimentali per perturbare il modello distanziato di stomi sono utili per esaminare il significato del pattern spaziatura. Sono stati identificati diversi geni chiave associate alla distribuzione stomatica distanziata e stomi cluster possono essere sperimentalmente indotta alterando questi geni. In alternativa, gli stomi cluster possono essere anche indotta da trattamenti esogeni senza modificazione genetica. In questo articolo, descriviamo un sistema di induzione semplice per cluster stomi nei semenzali di Arabidopsis thaliana dal trattamento ad immersione con una soluzione Media contenente saccarosio. Il nostro metodo è facile ed è direttamente applicabile alle linee transgeniche o mutante. Più grandi dei cloroplasti sono presentati come un marchio di garanzia biologico delle cellule delle cellule di guardia cluster indotta da saccarosio. Inoltre, un'immagine al microscopio confocale rappresentativa dei microtubuli corticali è indicata come un esempio dell'osservazione intracellulare delle cellule di guardia in cluster. L'orientamento radiale dei microtubuli corticali è mantenuto in cluster cellule di guardia come nelle cellule di guardia distanziate in condizioni di controllo.

Qui, è stato presentato il protocollo per un semplice metodo di induzione stomatica clustering con soluzione Media contenente saccarosio nei semenzali di a. thaliana . Le cellule di guardia cluster coltivate in soluzione Media contenente saccarosio (Figura 1B) hanno più grandi cloroplasti di guardia le cellule coltivate in condizioni di controllo privo di saccarosio (Figura 1A). L'alla...

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An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

L'obiettivo del presente protocollo è illustrare come indurre cluster stomi nei cotiledoni di Arabidopsis thaliana piantine dal trattamento ad immersione con una soluzione di media contenenti zucchero e come osservare strutture intracellulari quali cloroplasti e microtubuli nelle cellule di guardia in cluster utilizzando confocale microscopia laser.

Un sistema di induzione per cluster stomi da trattamento di immersione di soluzione di zucchero nei semenzali di Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Questo metodo ha risposto a una domanda chiave sulla biologia dello sviluppo vegetale. Cioè, qual è l'importanza della distribuzione spaziale degli stomi? Il nostro sistema di induzione per stomi raggruppati che utilizzano soluzione di saccarosio è abbastanza semplice e direttamente applicabile alle linee transgeniche o mutanti della arabidopsis thaliana.Per iniziare, aggiungere 1,1 grammi di sali medi Di Murashige-Skoog e 15 grammi di saccarosio a un becher. Aggiungere 490 millilitri di acqua distillata al becher e mescolare con la barra di agitazione. Utilizzare idrossido di potassio per regolare il pH a 5,8.Quindi diluire la soluzione con 500 millilitri di acqua distillata e trasferire la soluzione diluita in una bottiglia media. Dopo questo, autoclave la soluzione. Preparare la soluzione di sterilizzazione secondo il protocollo di testo.Quindi, lavorando in condizioni asettiche, posizionare circa 50 semi transgenici di A.thaliana che trasportano un marcatore fluorescente in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere quindi un millilitro di 70% di etanolo al tubo e mescolare invertendo il tubo cinque volte. Dopo aver permesso ai semi di affondare sul fondo del tubo, rimuovere delicatamente l'etanolo con una micropipetta.Aggiungere un millilitro di soluzione di sterilizzazione ai semi e invertire il tubo cinque volte per mescolare. Rimuovere delicatamente la soluzione di sterilizzazione dai semi con una micropipetta. Quindi aggiungere un millilitro di acqua sterile.Aggiungere 1,5 millilitri della soluzione Murashige-Skoog ad ogni pozzo di una piastra da 24 poggiagli. Quindi aggiungere due semi sterilizzati ad ogni pozzo. Utilizzando due strati di parafilm, rastreliare il coperchio sulla piastra.Quindi, trasferire il piatto in una camera di crescita per incubare per 14 giorni. In primo luogo, trasferire 30 microlitri della soluzione Murashige-Skoog dalla piastra del pozzo 24 al centro di uno scivolo di vetro. Usando le forbici sezionanti, rimuovere la cotiledone da una piantina vecchia di 14 giorni.Galleggiare il cotiledone con il lato di osservazione rivolto verso l'alto sulla goccia della soluzione Murashige-Skoog. Preparare il cotiledone secondo i metodi precedentemente descritti nel Journal of Visualized Experiments. Impostare il campione sul palco di un microscopio laser confocale.Infine, utilizzare l'illuminazione del campo luminoso per selezionare le celle di guardia raggruppate per l'osservazione. In questo protocollo, il clustering stomatale è stato indotto nelle piantine A.thaliana. Le cellule di guardia raggruppate coltivate nel saccarosio contenenti mezzo con cloroplasti più grandi rispetto alle cellule di guardia coltivate in condizioni di esorose.L'ingrandimento dei cloroplasti è stato confermato con un marcatore stroma cloroplasto e autofluorescenti alla clorofilla, suggerendo che il trattamento con saccarosio ha portato all'accumulo di cereali da amido nei cloroplasti. Inoltre, l'osservazione confocale della vasca-6 della GFP ha rivelato che i microtubuli corticali erano orientati radialmente nelle cellule trattate con saccarosio, proprio come nelle cellule di guardia senza saccarosio. In realtà abbiamo scoperto questo metodo per caso.Dopo la scoperta, abbiamo esaminato la risposta ambientale degli stomi raggruppati. Riteniamo che il nostro sistema potrebbe contribuire ad esaminare l'importanza della distribuzione degli stomi.

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