Name: an induction system for clustered stomata by sugar solution immersion treatment in arabidopsis thaliana seedlings
Uploaded: 2019-02-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings at JoVE.com

Nós estamos gratos ao Prof Seiichiro Hasezawa pelo seu apoio gentil do nosso trabalho. Este trabalho foi financiado por doações da sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHgrant números 17 19380 K e 18 H 05492, da Fundação de Sumitomo para um subsídio para projetos de pesquisa de ciência básica conceder número 160146 e a Fundação da Canon a T.H. Este sistema experimental foi desenvolvido sob um apoio financeiro do número JSPS KAKENHgrant 26891006 para K. A. Agradecemos a Robbie Lewis, MSc, do grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto do manuscrito.

1. preparação da solução médio de 1/2 Murashige-Skoog 3% sacarose, contendo
<ol><li>Adicione 1,1 g de sais médios Murashige-Skoog e 15 g de sacarose para um copo.</li>
	<li>Adicione 490 mL de água destilada e misture bem, usando uma barra de agitação.</li>
	<li>Ajuste o pH a 5.8 usando KOH.</li>
	<li>Diluir para 500 mL com água destilada e transferir a solução para um frasco médio.</li>
	<li>Esterilize a solução por autoclave (121 ° C, 20 min). Se não usado imediatamente, esta solução pode ser mantid...

<ol>
	<li>Raschke, K., Fellows, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+movement+in+Zea+mays:+shuttle+of+potassium+and+chloride+between+guard+cells+and+subsidiary+cells.">Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells.</a> Planta. 101 (4), 296-316 (1971).</li><li>Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+environmental+responses+of+PATROL1+in+Arabidopsis+subsidiary+cells.">Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells.</a> Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).</li><li>Bergmann, D. C., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development.">Stomatal development.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).</li><li>Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+stomatal+development.">Mechanisms of stomatal development.</a> Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).</li><li>Sakai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+compound+bubblin+induces+stomatal+mispatterning+in+Arabidopsis+by+disrupting+the+intrinsic+polarity+of+stomatal+lineage+cells.">The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells.</a> Development. 144 (3), 499-506 (2017).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+of+plant+stomatal+one-cell-spacing+rule+by+sugar+solution+immersion.">Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion.</a> PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).</li><li>Chen, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+callose+synthase+gene+GSL8+is+required+for+cytokinesis+and+cell+patterning.">The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning.</a> Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).</li><li>Guseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+cell-to-cell+connectivity+and+stomatal+patterning+by+loss-of-function+mutation+in+Arabidopsis+chorus+(glucan+synthase-like+8).">Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8).</a> Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubules+and+fusicoccin+response+in+clustered+stomatal+guard+cells+induced+by+sucrose+solution+immersion.">Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion.</a> Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).</li><li>Akita, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+solution+induces+clustered+lips.">Sugar solution induces clustered lips.</a> Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).</li><li>Holzinger, A., Buchner, O., L&#252;tz, C., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+formation+of+chloroplast+protrusions+and+stromules+in+mesophyll+cells+of+Arabidopsis+thaliana.">Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana.</a> Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).</li><li>Abe, T., Hashimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microtubule+dynamics+by+expression+of+modified+&#945;-tubulin+protein+causes+right-handed+helical+growth+in+transgenic+Arabidopsis+plants.">Altered microtubule dynamics by expression of modified &#945;-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants.</a> The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).</li><li>Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+plant+cell+surface+dynamics+with+variable-angle+epifluorescence+microscopy.">Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).</li></ol>

Nós apresentamos protocolos para indução dos estomas em cluster em mudas da . thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo sacarose. Como mostrado aqui, esse método é muito simples e não requer nenhuma habilidade especializada mas eficiente pode induzir estomas em cluster. Mais de 45% das células guarda estão agrupadas com 3% de sacarose, contendo solução média (valores médios de mais de 20 observações independentes)6. Além disso, este sistema ex...

O estoma de planta é um órgão essencial para a troca de gás para a fotossíntese e a transpiração e movimento estomático é realizado por mudanças significativas nas células de guarda a íon-driven captação e liberação de água. Sob um microscópio, podemos observar um padrão de distribuição espaçada de estômatos nas superfícies das folhas e caules. Esta distribuição espaçada de estomas é considerada para ajudar o movimento estomático, que é regulamentado pela troca de íons e água entre as células guarda e vizinhos células epidérmicas1,2. Sistemas de indução experimental de estomas em cluster são úteis para investigar a importância da distribuição espaçada dos estomas.
Tem sido relatado que a aglomeração espacial dos estomas pode ser induzida por modificação genética de genes-chave de3,de diferenciação celular guarda4 ou o tratamento com um composto químico5. Também informamos que tratamento de imersão com uma solução meio suplementado com açúcares, incluindo a sacarose, glicose, e frutose causou clusters estomática em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana 6. Callose reduzida em novas paredes celulares separando meristemoids e células epidérmicas foi observada na epiderme cotilédone tratados com sacarose, sugerindo que o tratamento de imersão de solução de sacarose afeta negativamente a parede celular, que impede o escapamento e ação ectópica de produtos do gene chave para diferenciação de célula guarda (por exemplo, fatores de transcrição) em direção ao lado epidérmica células6. Um mecanismo semelhante foi sugerido de estudos sobre gsl8/chor mutantes7,8. Nosso sistema experimental para indução pode ser reproduzido dos estomas em cluster usando sacarose, contendo solução média é bastante fácil e barato. Também pode ser usada para investigar as estruturas intracelulares como organelas e o citoesqueleto nas células guarda em cluster quando aplicado às linhas transgênicas expressando marcadores fluorescentes que rótulo estruturas intracelulares9, 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:685px;" width="686">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:135px;">Sumitomo Bakelite</td>
			<td style="width:168px;">MS-0824R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">Furukawa Denko</td>
			<td style="width:168px;">HPU-50101-PFS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td>Sapphire488-20/O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">510 nm long-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">BA510IF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">524 - 546 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Semrock</td>
			<td style="width:168px;">FF01-535/22-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">530 nm short-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">BA530RIF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:135px;">CVI Melles Griot</td>
			<td style="width:168px;">85-YCA-025-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">604 - 644 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:135px;">Semrock</td>
			<td style="width:168px;">FF01-624/40-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Confocal laser scanning head</td>
			<td style="width:135px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:168px;">CSU10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Confocal laser scanning head</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">FV300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cooled CCD camera</td>
			<td style="width:135px;">Photometrics</td>
			<td style="width:168px;">CoolSNAP HQ2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:168px;">MetaMorph version 7.8.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">FLUOVIEW v5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">Immersion Oil Type-F</td>
			<td>ne = 1.518 (23 degrees)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">IX-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">IX-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:216px;">Murashige and Skoog Plant Salt Mixture</td>
			<td style="width:135px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td style="width:168px;">392-00591</td>
			<td style="width:167px;">Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Objective lens&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35</td>
			<td>NA = 1.35</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Objective lens&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:168px;">UPlanAPO 40x / 0.85 NA</td>
			<td>NA = 0.85</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:135px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td style="width:168px;">196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an induction system for clustered stomata by sugar solution immersion treatment in arabidopsis thaliana seedlings

Movimento estomático Medeia troca gasosa planta, que é essencial para a fotossíntese e transpiração. Estomática de abertura e fechamento são realizados por um significativo aumento e diminuição do volume das células de guarda, respectivamente. Porque o transporte de transporte de íons e água ocorre entre as células guarda e células epidérmicas vizinhas maiores durante o movimento estomático, espaçada distribuição dos estômatos da planta é considerada uma distribuição ideal para o movimento estomático. Sistemas experimentais para perturbar o espaçamento padrão dos estomas são úteis para examinar o significado do padrão de espaçamento. Foram identificados vários genes chaves associados à distribuição estomática espaçada, e estômatos em cluster podem ser induzidos experimentalmente, alterando estes genes. Alternativamente, estomas em cluster podem ser também induzidas por tratamentos exógenos sem modificação genética. Neste artigo, descrevemos um sistema simples de indução para estomas clusterizados em plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo sacarose. Nosso método é fácil e diretamente aplicável às linhas transgénicas ou mutantes. Cloroplastos maiores são apresentados como uma célula biológica marca registrada de induzida em sacarose clusterizadas células guarda. Além disso, uma imagem microscópica confocal representativa de microtúbulos corticais é mostrada como um exemplo de observação intracelular de células de guarda em cluster. A orientação radial de microtúbulos corticais é mantida nas células de guarda em cluster como em células de guarda espaçadas em controlar as condições.

Aqui, foi apresentado o protocolo para um método simples de induzir estomática clusters com sacarose, contendo solução média em mudas da . thaliana . As células de guarda em cluster cultivadas em solução média contendo sacarose (Figura 1B) possuem cloroplastos maiores que guarda cultivados em condições de controle isento de sacarose (Figura 1A). O alargamento dos cloroplastos ...

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An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

O objetivo do presente protocolo é demonstrar como induzir estomas clusterizadas em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo açúcar e como observar estruturas intracelulares como cloroplastos e microtúbulos nas células guarda clusterizados usando confocal laser microscopia.

Um sistema de indução de estomas agrupado por tratamento de imersão de solução de açúcar em plântulas de Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Este método respondeu a uma questão-chave da biologia do desenvolvimento vegetal. Ou seja, qual é a importância da distribuição espacial de stomata? Nosso sistema de indução para stomata agrupada usando solução de sacarose é bastante fácil e diretamente aplicável a linhas transgênicas ou mutantes de Arabidopsis thaliana.Para começar, adicione 1,1 gramas de sais médios Murashige-Skoog e 15 gramas de sacarose a um béquer. Adicione 490 mililitros de água destilada ao béquer e misture com a barra de mexida. Use hidróxido de potássio para ajustar o pH para 5,8.Em seguida, dilua a solução com 500 mililitros de água destilada e transfira a solução diluída para uma garrafa média. Depois disso, autoclave a solução. Prepare a solução de esterilização de acordo com o protocolo de texto.Em seguida, trabalhando sob condições assépticas, coloque cerca de 50 sementes transgênicas de A.thaliana carregando um marcador fluorescente em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um mililitro de 70% de etanol ao tubo e misture invertendo o tubo cinco vezes. Depois de permitir que as sementes afundem no fundo do tubo, remova suavemente o etanol com uma micropipette.Adicione um mililitro de solução de esterilização às sementes e inverta o tubo cinco vezes para misturar. Remova suavemente a solução de esterilização das sementes com uma micropipette. Em seguida, adicione um mililitro de água estéril.Adicione 1,5 mililitros da solução Murashige-Skoog a cada poço de uma placa de 24 poços. Em seguida, adicione duas sementes esterilizadas a cada poço. Usando duas camadas de parafilm, fita a tampa na placa.Em seguida, transfira a placa para uma câmara de crescimento para incubar por 14 dias. Primeiro, transfira 30 microliters da solução Murashige-Skoog da placa de 24 poços para o centro de um escorregador de vidro. Usando uma tesoura dissecando, remova o cotilledon de uma muda de 14 dias.Flutue o cotyledon com o lado de observação voltado para a queda da solução Murashige-Skoog. Prepare o cotyledon de acordo com os métodos descritos anteriormente no Journal of Visualized Experiments. Coloque o espécime no estágio de um microscópio laser confocal.Finalmente, use iluminação de campo brilhante para selecionar células de guarda agrupadas para observação. Neste protocolo, o agrupamento estomatal foi induzido em mudas de A.thaliana. As células de guarda agrupadas cultivadas na sacarose contendo meio com cloroplastos maiores do que células de guarda cultivadas em condições livres de sacarose.O alargamento dos cloroplastos foi confirmado com um marcador de estroma cloroplasto e autofluorescentes de clorofila, sugerindo que o tratamento da sacarose resultou no acúmulo de grãos de amido nos cloroplastos. Além disso, a observação confocal da banheira GFP-6 revelou que os microtúbulos corticais eram radialmente orientados nas células tratadas com sacarose, assim como nas células de proteção livre de sacarose. Na verdade, descobrimos esse método por acidente.Após o achado, examinamos a resposta ambiental de stomata agrupada. Acreditamos que nosso sistema poderia ajudar a examinar o significado da distribuição de stomata.

Research

JoVE Journal

Environment

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