Name: analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

الكتاب أشكر جميع أعضاء المختبر براكمان، في الماضي والحاضر، للمناقشات المثمرة وتساعد في تطوير الأساليب التي عرضت في هذا المقال. هذا المشروع قد تلقي تمويلاً من "مجلس البحوث الأوروبية" ضمن الاتحاد الأوروبي "البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) N ° 235649 وفي هولندا منظمة من العلمية البحوث (جمعية البحث العلمي الهولندية) تحت درجة N برنامج صدى 711.012.008.

كانت تعالج جميع الكواشف الإشعاعية والإجراءات وفقا لجامعة أوترخت المحلية الإشعاع القواعد والأنظمة.
1-نبض تشيس
<ol><li>
نبض تشيس للخلايا ملتصقة ملاحظة: وحدات التخزين نظراً لهنا تستند إلى 60 مم خلية ثقافة الأطباق. 35 ملم أو أطباق 100 مم، ضرب وحدات التخزين قبل 1/2 أو 2، على ال...

<ol>
	<li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER.">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li><li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+Questions+(with+their+Answers)+on+ER-Associated+Degradation.">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li><li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System:+The+Calnexin+Binding+Cycle.">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide.">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067 (2017).</li><li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li><li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein.">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li><li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function.">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).</li><li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro.">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li><li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis.">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li><li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin.">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li><li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Hsp47,+Grp78,+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones.">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li><li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain.">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e.">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li><li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport.">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li></ol>

أساليب مطاردة نبض كانت ضرورية لتطوير فهم العلماء من البروتين قابلة للطي في خلايا سليمة. في حين أننا حاولنا أن توفر طريقة عامة قدر الإمكان، هذا النهج ينطوي على إمكانية للاختلافات لا حدود لها تقريبا لدراسة مختلف العمليات التي تحدث خلال قابلة للطي، النقل، والحياة للبروتينات داخل الخلية.
<p...

طي البروتينات البسيطة نسبيا حتى ينطوي على العديد من الإنزيمات المختلفة قابلة للطي ومرافقين الجزيئية، والتعديلات التساهمية1. إعادة تشكيل كاملة لهذه العمليات في المختبر مستحيل عمليا، نظراً للعدد الهائل من المكونات المختلفة المعنية. ولذلك مرغوب فيه للغاية، دراسة البروتين قابلة للطي في فيفو، في الخلايا الحية. تقنيات تشيس نبض المشعة إثبات أداة قوية لدراسة التوليف، قابلة للطي، والنقل، وتحلل البروتينات في بيئتهم الطبيعية.
التمثيل الغذائي وسم البروتينات خلال نبضة قصيرة مع 35S المسمى الميثيونين/سيستين، متبوعاً بعملية مطاردة في غياب تسمية المشعة، يتيح تتبع محددة من سكان بروتينات المركبة حديثا في أوسع الوسط الخلوية. ثم البروتينات المستهدفة يمكن أن تكون معزولة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن وتحليلها عن طريق الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أو تقنيات أخرى. للعديد من البروتينات، ورحلتهم عبر الخلية تتميز بتعديلات مرئية في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. على سبيل المثال، غالباً ما يترافق نقل البروتينات الغليكوزيلاتي من هيولى (ER) إلى مجمع غولجي بإدخال تعديلات على جليكانس ن مرتبطة أو إضافة ربط س جليكانس2،3. هذه التعديلات يؤدي إلى زيادات كبيرة في الكتلة الجزيئية الواضحة، التي يمكن رؤية التغييرات التنقل في صفحة الحزب الديمقراطي الصربي. يمكن أيضا علامة النضج بالانقسامات proteolytic، مثل الانقسام وإشارة-الببتيد أو إزالة برو-الببتيدات، أسفر عن تغييرات في الكتلة الجزيئية الواضحة التي يمكن اتباعها بسهولة على جل الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة4. النشاط الإشعاعي بمزايا كبيرة على تقنيات قابلة للمقارنة مثل مطاردات سيكلوهيكسيميدي، حيث تمنع تخليق البروتين الرواية، كما العلاجات أطول سامة للخلايا، ولا تستبعد غالبية البروتينات كبار السن، الحالة المستقرة من التحليل، وبعض البروتينات بإنصاف أيام. مقارنة البروتينات تحت كل نونريدوسينج والحد من الظروف يسمح تحليل ثنائي كبريتيد تشكيل السندات، خطوة هامة في طي العديد من البروتينات الافرازية4،،من56، 7.
هنا يصف لنا طريقة عامة لتحليل طي البروتين والنقل في خلايا سليمة، باستخدام نهج مطاردة نبض مشعة. بينما نحن وتهدف إلى توفير الأسلوب مفصلة قدر الإمكان، البروتوكول تتمتع بإمكانيات لا حدود لها تقريبا للقدرة على التكيف وسوف تسمح الأمثل لدراسة البروتينات المحددة كل قارئ.
البروتوكولين تشيس نبض البديلة، تقدم للخلايا ملتصقة (الخطوة 1، 1 من البروتوكول المعروضة هنا) وآخر لتعليق الخلايا (الخطوة 1، 2 من البروتوكول المعروضة هنا). الشروط المقدمة هنا تكفي لتصور بروتين أعربت مع المستويات المتوسطة إلى العليا التعبير. إذا كان القارئ يعمل مع البروتينات أعرب سيئة أو مختلف الظروف بوستريتمينت، مثل إيمونوبريسيبيتيشنز متعددة، من الضروري زيادة حجم صحن أو الخلية عدد مناسب.
لوقف نبض تشيس، مطاردة العينات المأخوذة في كل مرة نقطة الجميع مأخوذة من أنبوب واحد من الخلايا. خطوات الغسيل بعد أن يتم حذف النبض؛ بدلاً من ذلك، كذلك إدماج 35S هو منع إضعاف مع فائض عالية من الميثيونين غير مسمى وسيستين.
استخدام البروتوكولات المقدمة المشعة 35S المسمى سيستين والميثيونين لمتابعة عمليات طي البروتين الخلوي. ينبغي إجراء جميع العمليات مع الكواشف الإشعاعية باستخدام تدابير الحماية المناسبة للتقليل إلى أدنى حد من أي تعرض للمشغل والبيئة للإشعاع المشعة وأداؤها في أحد مختبرات معينة. كالنبض-المطاردة وسم تقنية غير فعالة نسبيا في الأوقات نبض قصيرة (< 15 دقيقة)، وأقل من 1% مبلغ بداية النشاط الإشعاعي الذي أدرج في البروتينات المركبة حديثا. بعد إثراء البروتين المستهدفة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن، العينة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحتوي على أقل من 0.05 في المائة مبلغ بداية النشاط الإشعاعي.
على الرغم من أن استقرت الميثيونين 35S وسيستين وسم ميكس، سوف يحدث بعض التحلل، مما أسفر عن المركبات المشعة المتطايرة،. حماية الباحث والجهاز، ينبغي اتخاذ بعض الاحتياطات. الباحث دائماً أن تمتثل لقواعد السلامة الإشعاعية المحلية وقد ارتداء فحم التمريض القناع، إلى جانب معطف مختبر وقفازات (مزدوجة). يجب فتح قنينة الأسهم مع 35S الميثيونين وسيستين دائماً في غطاء دخان، أو تحت نقطة تطلعات محلية. بقع التلوث المختبرات المعروفة بأجهزة الطرد المركزي والماصات وأحواض المياه، وحاضنات والهزازات. يتم تقليل التلوث من هذه المناطق باستخدام ماصة نصائح مع عامل تصفية فحم، أنابيب ميكروسينتريفوجي ختم إيجابية (انظر الجدول للمواد)، وحوض الفحم الاسفنجيات في المياه والحمامات، الفحم تصفية ورقات ملتصقاً بأطباق نبض--تشيس، الفحم من الحرس في نظام الشفط، وإخضاع الأطباق التي تحتوي على الحبوب الفحم في الحاضنات وحاويات التخزين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td style="width:301px;">glacial acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28956475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carestream Biomax MR films</td>
			<td style="width:71px;">Kodak</td>
			<td>Z350370-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell-culture media</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:301px;">Normal cell culture media for specific cell-lines used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell-culture media, no methionine/cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;">Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1872047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Charcoal filtered pipette tips</td>
			<td style="width:71px;">Molecular bioproducts</td>
			<td>5069B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal vacu-guard</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>112,553</td>
			<td style="width:301px;">for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEG772014MC</td>
			<td style="width:301px;">Other size batches of label are available depending on useage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel-drying equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grade 3 chromatography paper</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">3003-917</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>24020117</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes delicate task wipes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>MX0490&#160;</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methionine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>M5308</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minigel casting/running equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5368</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protein-A Sepharose fastflow beads</td>
			<td style="width:71px;">GE health-care</td>
			<td style="width:119px;">17-5280-04</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base (Tris)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon IP Biomolecular imager</td>
			<td style="width:71px;">Amersham</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Nalgene</td>
			<td>5970-0320PK</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase

وصف تشيس نبض المشعة أداة قوية لدراسة نضوج كونفورماشونال، والنقل إلى مواقعها الخلوية الوظيفية، وتدهور البروتينات المستهدفة في الخلايا الحية. باستخدام أوقات قصيرة (نبض) راديولابيلينج (< 30 دقيقة) ورقابة مشددة من تشيس مرات، من الممكن تسمية سوى جزء صغير من تجمع مجموع البروتين واتبع الطي به. عندما جنبا إلى جنب مع نونريدوسينج/خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وإيمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة (تكيف محددة)، يمكن دراسة الطي العمليات بقدر كبير من التفصيل. وقد استخدم هذا النظام لتحليل قابلة للطي للبروتينات مع تباين كبير في خصائص مثل البروتينات القابلة للذوبان، البروتينات وحيدة ومتعددة تمرير transmembrane، N و O الغليكوزيلاتي البروتينات بشدة، والبروتينات مع أو بدون ثنائي كبريتيد واسعة النطاق الربط. أساليب مطاردة نبض هي أساس الدراسات الحركية إلى مجموعة من الميزات الإضافية، بما في ذلك شركة-والتعديلات بوستترانسلاشونال، أوليجوميريزيشن، والبلمره، أساسا يسمح تحليل البروتين من الولادة حتى الموت. دراسات نبض--تشيس في طي البروتين متكاملان مع أساليب أخرى البيوكيميائية والفيزيائية لدراسة البروتينات في المختبر بتقديم معلومات الفسيولوجية وزيادة الأزمنة. هي تكييف الأساليب كما هو موضح في هذه الورقة بسهولة لدراسة الطي تقريبا أي البروتين التي يمكن التعبير عنها في نظم الثدييات أو خلايا الحشرات.

ويرد في الشكل 2قابلة للطي وإفراز gp120 فيروس نقص المناعة البشرية-1 من تشيس نبض ملتصقة. هلام نونريدوسينج (NR الخلايا في الشكل) يبين طي عنصر مؤكسد من gp120. فورا بعد النبض وسم من gp120 5 دقيقة (0 دقيقة تشيس) يظهر كعصابة منتشر في الهلام أعلى، وكما تقدم تشيس، ترحيل الفرقة أ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

هنا يمكننا وصف بروتوكول لأسلوب مطاردة نبض عامة يسمح تحليل الحركية قابلة للطي والنقل، وتدهور البروتينات الواجب اتباعها في الخلايا الحية.

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

مطاردة النبض المشع باستخدام 35 S المسمى الميثيونين والسيستين لا يزال الأساليب الكيميائية الحيوية الوحيدة للتحقيق في التركيب الحيوي البروتين مع الوقت في الخلايا الحية. ويشمل التركيب الحيوي للبروتين كلا من الترجمة والطية والتجميع والاتجار والتدهور. الجمع بين مطاردة النبض المشع مع تحليل التعديلات البروتينية المشتركة واللاحقة للترجمة ، مثل تكوين سندات التكفيريد والأسيتيل يوفر مقايسة حساسة وكمية للتحقيق في إيمان البروتين مع مرور الوقت.مطلوب التركيز الجيد والتعامل التجريبي لهذا الإجراء. إعداد جيد أمر بالغ الأهمية، مثل المخازن المؤقتة، مساحة العمل المشعة الخاصة بك، وجدول زمني واضح. هذا الفيديو يوفر واضحة على عرض الكتف من بروتوكول مطاردة النبض المشع.إثبات الإجراء سيكون هوي يينغ يوه، مرشح pHd من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، transfect البذور والخلايا الثقافة كما هو موضح في بروتوكول النص. قبل مطاردة النبض، افحص خلاياك من خلال المجهر.بعد ذلك، اغسل الأطباق بمليلترين من عازل الغسيل. و مليلتران من التجويع وسط الخلايا ووضع الأطباق في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة. تأكد من أن إعداد مطاردة النبض الخاص بك هو في النظام.نقل الأطباق إلى الرفوف في حمام الماء، قبل warmed إلى 37 درجة مئوية. تأكد من أن الأطباق على اتصال مع الماء، ولكن لا تطفو. ثم، بدء تشغيل جهاز ضبط وقت.في 40 ثانية، استلهمي وسط المجاعة. باستخدام الأنابيب الصغيرة، ووضع ما يصل 600 ميكرولترات من حل النبض. في دقيقة واحدة بالضبط، إضافة بلطف حل نبض إلى وسط الطبق.كرر هذه العملية لإزالة وسط المجاعة وإضافة حل النبض للأطباق المتبقية على فترات دقيقة واحدة. في بالضبط 11 دقيقة ولجميع الأطباق التالية، وفقا لمخطط مطاردة النبض، باستثناء عينة مطاردة دقيقة الصفر، إضافة ملليلتر اثنين من مطاردة المتوسطة مباشرة إلى الطبق. التعرق متوسطة مطاردة واستبدالها مع ملليلتر اثنين من وسط مطاردة جديدة.كرر هذه العملية لجميع الأطباق المتبقية على فترات دقيقة واحدة. عندما يقرأ جهاز ضبط الوقت بالضبط 16 دقيقة، إضافة اثنين من militers من مطاردة المتوسطة مباشرة إلى طبق مطاردة دقيقة الصفر، على رأس وسيط نبض، لوقف وضع العلامات. على الفور التعرق المتوسطة.نقل الطبق إلى لوحة الألومنيوم المبردة وإضافة اثنين من militers الجليد الباردة وقف العازلة. نقل جميع الأطباق الأخرى إلى حاضنة في 37 درجة مئوية. نقل كل طبق مطاردة مرة أخرى من الحاضنة إلى حمام الماء قبل دقيقتين من نهاية كل وقت مطاردة.في الوقت مطاردة الدقيق لكل طبق، التعرق متوسطة مطاردة ونقل الطبق إلى لوحة الألومنيوم المبردة. إضافة ملليلتر اثنين من الجليد الباردة توقف العازلة. ترك جميع الأطباق على الجليد والتوقف عن العازلة حتى يكون هناك وقت لlyse الخلايا.ثم التعرق في حل التوقف وغسل جميع الأطباق. ثلاثة في نفس الوقت مع مليلترين من الجليد الباردة وقف الحل. التعرق وقف الحل تماما وإضافة 600 ميكرولترات من عازلة تحلل إلى طبقين في وقت.باستخدام مكشطة الخلية، كشط سطح الطبق بدقة، ولكن بلطف لخلط lysate. نقل lysate من كل طبق إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر جهاز طرد مركزي صغير. جهاز طرد مركزي في 15، 000 إلى 20، 000 G في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه النوى.لمطاردة النبض على الخلايا المعلقة جمع خمسة ملايين خلية في نقطة الوقت في أنبوب واحد 50 ملليلتر. تنفيذ إجراء starvation كما هو موضح في النص. بعد إجراء المجاعة في حمام الماء لمدة 15 دقيقة ، ابدأ المؤقت.في دقيقة واحدة بالضبط، إضافة 275 microcuries من تسمية غير مخفف مباشرة إلى أنبوب تحتوي على الخلايا ودوامة لخلط. في دقيقة 11 بالضبط، إضافة أربعة ملليلتر من وسائل الإعلام مطاردة لوقف وضع العلامات. ونقل على الفور ملليلتر واحد إلى أنبوب 15 ملليلتر على الجليد الذي يحتوي على تسعة ملليلتر من الجليد الباردة وقف حل لوقف وضع العلامات.كرر هذه العملية لنقل ملليلتر واحد من مطاردة إلى أنبوب على الجليد تحتوي على تسعة ملليلتر من وقف الحل لكل نقطة وقت مطاردة المتعاقبة. بعد الاعتياز, يتبخر الغسل الأخير تماما. إعادة تعليق الخرز في 20 ميكروليتر من العازلة وTE دوامة.إضافة 20 ميكروليتر من اثنين X عينة العازلة دون وكيل الحد. دوامة العينات ثم تسخينها في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. دوامة العينات مرة أخرى.جهاز طرد مركزي في 12،000 مرات G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. نقل 19 ميكرولترات من غير مخفضة سوبرات إلى أنبوب جديد microcentuge التي تحتوي على ميكرولتر واحد من 500 ملليمولار دي تي. إذا لزم الأمر، الطرد المركزي العينة بسرعة بحيث جميع السوائل في الجزء السفلي.وتسخن على 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق السماح للعينة المخفضة تبرد ثم تبرد دوامة. أجهزة الطرد المركزي على حد سواء خفضت وغير خفضت العينات في 12، 000 مرات G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة، ثم إضافة 1.1 ميكرولترات من واحد NEM الضرس لجميع العينات.في هذه الدراسة، يتم استخدام نهج مطاردة النبض المشع لتحليل طي البروتين ونقله في الخلايا السليمة. يظهر طي وإفراز فيروس نقص المناعة البشرية واحد GP120 من مطاردة نبض معتنقي هنا. يُظهر الجل غير المتناقص الطي التأديدي لـ GP120.مباشرة بعد وضع العلامات النبض، يبدو كما الفرقة منتشر أعلى في هلام. كما تقدم مطاردة، والفرقة يهاجر أسفل هلام من خلال وسيطة قابلة للطي أكثر انتشارا حتى تتراكم في الفرقة الضيقة التي تمثل مطوية أصلا في GP120. يحدث هذا مع زيادة تكوين روابط ثاني كبريتيد في ضغط البروتين، مما يؤدي إلى هجرة أسرع من البروتين المخفض بالكامل.على الحد من هلام، وقد تم تخفيض الروابط كبريتيد وجميع الجزيئات ولا تؤثر على mobiilty. وعلى هذا النحو، فإن الاختلافات في القدرة على الحركة ليست سوى نتيجة للتغيرات في الكتلة الجزيئية. يمثل التحول بمرور الوقت من شكل الببتيد المُقلل إلى شكل الببتيد المشقوق للإشارة المشقوقة شكل الببتيد بعد النقل من GP120.يزيد التنقل بسبب فقدان الببتيد إشارة الذي يزيد أثناء المطاردة كما المزيد من البروتينات تحقيق أضعاف الأصلي وتفقد الببتيد إشارة بهم. على كل من هلام غير خفض والحد، تبدأ إشارة في الانخفاض من ساعة واحدة تقريبا فصاعدا بسبب إفراز GP120. ويمكن رصد ذلك من خلال تحليل وسائل الإعلام.هذه الطريقة قابلة للتطبيق على أي خط الخلية، بما في ذلك نماذج الخلايا العضوية. غير أنّ يعتمد النجاح كثيرا على التعبير مستوى من البروتين الفائدة. قبل البدء في هذا الإجراء، ضع علامة على الأطباق الخاصة بك والحفاظ على هذا النظام طوال التجربة.تأكد من أن كل شيء جاهز قبل إضافة وسط المجاعة. هذه بداية التجربة ووقت مختبرك هو صديقك، ولكن يمكن أن يكون أكبر عدو لك عندما كنت غير مستعدة.يمكن الجمع بين مطاردة بيل مع تحلل البروتين المحدود للتحقيق في الحوزة الكاملة للبروتينات مع مرور الوقت. أيضا مختلف أساليب التجميد المنتخبة سوف تسمح بتحليل شطف أو صرامة أو الخلافات تهمة. لحماية الباحث والجهاز، يجب أن تُطاع جميع قواعد السلامة الإشعاعية المحلية.وينبغي اتخاذ تدابير وقائية وفقا للبروتوكول. لاحظ أن الأكريلاميد الخاص بك، وتستخدم لصفحة STH الخاص بك هو سُمّي عصبي.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

الكشف عن هيتيروديميريزيشن Isoforms البروتين باستخدام في الموقع قرب ربط التحليل

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

عزل ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا واستخدامها في فحوصات البروتين الطاقة تعتمد على النقل

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

تحليل لامتصاص اندوسيتيك والنقل إلى الوراء إلى غولجي عبر الشبكة باستخدام نانوبوديس فونكتيوناليزيد في الخلايا المستزرعة

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

استخدام خط أنابيب MALDI TOF-MS IDBac المفتوح المصدر لتحليل البروتين الميكروبي وبيانات المستقلب المتخصصة

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...