Name: analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00
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作者感谢过去和现在的布拉克曼实验室的所有成员, 他们进行了富有成果的讨论, 并帮助开发了本文中介绍的方法。该项目得到了欧洲研究理事会在欧洲联盟第七个框架方案 (fp来 2007-2013) 下的资助, 以及荷兰科学研究组织 (nwo) 根据 echo 方案711.012.008 提供的资金。

所有放射性试剂和程序都是按照乌得勒支大学的当地辐射规则和条例处理的。
1. 脉冲追逐
<ol><li>
粘附细胞的脉冲追逐 注: 此处给出的体积基于60毫米细胞培养皿。对于35毫米或100毫米的菜肴, 将体积分别乘以半或2个。此协议使用10分钟的脉冲时间和0、15、30、60、120和240分钟的追逐时间。这些可以根据正在研究的特定蛋白质而有所不同 (下文将讨论)。<ol>
<li>种?...

<ol>
	<li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER.">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li><li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+Questions+(with+their+Answers)+on+ER-Associated+Degradation.">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li><li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System:+The+Calnexin+Binding+Cycle.">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide.">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067 (2017).</li><li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li><li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein.">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li><li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function.">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).</li><li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro.">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li><li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis.">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li><li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin.">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li><li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Hsp47,+Grp78,+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones.">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li><li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain.">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e.">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li><li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport.">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li></ol>

脉冲追逐方法对于培养科学家对完整细胞中蛋白质折叠的理解至关重要。虽然我们试图提供一种尽可能通用的方法, 但这种方法有可能几乎无限的变化来研究细胞内蛋白质折叠、运输和生命过程中发生的各种过程。
在洗碗中使用粘附细胞进行脉冲追逐时, 必须尽可能多地处理每道菜, 因为在实验中的每个时间点和/或条件都使用单独的菜品。特别是对于短脉冲和追逐时间 (& lt;5 ?...

即使是相对简单的蛋白质的折叠也涉及许多不同的折叠酶、分子伴侣和共价修饰1。考虑到所涉及的大量不同成分,在体外完全重组这些过程实际上是不可能的。因此, 研究活细胞中的蛋白质折叠是非常可取的。放射性脉冲追逐技术被证明是研究蛋白质在自然环境中的合成、折叠、迁移和降解的有力工具。
蛋白质在带有35s 标记的蛋氨酸标记的短脉冲中的代谢标记, 然后在没有放射性标签的情况下进行追逐, 从而可以在更广泛的细胞环境中对新合成的蛋白质群进行特定的跟踪。然后, 目标蛋白可以通过免疫沉淀分离, 并通过sds-page 或其他技术进行分析。对于许多蛋白质来说, 它们穿过细胞的旅程是由 sds-page 凝胶上可见的修饰所标记的。例如, 糖基化蛋白从内质网 (er) 传输到 golgi 复合物时, 往往会对 n-连锁的糖类进行修改, 或添加 o-连锁的糖基 2,3。这些修饰会导致表观分子质量的大幅增加, 这可以从 sds-page 中的移动性变化中看出。成熟也可以表现为蛋白溶解裂解, 如信号肽裂解或去除亲肽, 导致表观分子质量的变化, 可以很容易地遵循 sds-page 凝胶4。与环己酰亚胺酶等可比技术相比, 放射性具有相当大的优势, 在这种技术中, 可以防止新的蛋白质合成, 因为较长的处理方法对细胞有毒, 并且不将大多数较旧的稳态蛋白质排除在分析, 因为一些蛋白质有半生的日子。蛋白质在非还原和还原条件下的比较可以分析二硫键的形成,这是许多分泌蛋白 4,5,6折叠的一个重要步骤,7。
在这里, 我们描述了一个一般的方法来分析蛋白质折叠和运输在完整的细胞, 使用放射性脉冲追逐的方法。虽然我们的目标是提供尽可能详细的方法, 但该协议的适应性潜力几乎是无限的, 可以优化研究每个读者的特定蛋白质。
提供了两种可供选择的脉冲追逐协议, 一种用于粘附细胞 (此处介绍的协议的步骤 1.1) 和用于悬浮细胞的方案 (此处介绍的协议的步骤 1.2)。这里提供的条件足以想象用中高表达水平表达的蛋白质。如果读者使用的是表达不良的蛋白质或各种治疗后条件, 如多重免疫沉淀, 则有必要适当增加菜品大小或细胞数量。
对于悬架脉冲追逐, 在每个时间点采集的追逐样本都是从一管细胞中提取的。在脉冲被省去之后洗涤步;相反, 进一步加入35s是通过稀释高过量的未标记蛋氨酸和半胱氨酸。
所提出的协议使用放射性35s 标记半胱氨酸和蛋氨酸来跟踪细胞蛋白折叠过程。所有使用放射性试剂的操作都应使用适当的保护措施, 以尽量减少操作人员和环境受到放射性辐射的任何照射, 并在指定的实验室进行。由于脉冲追逐标记技术在短脉冲时间 (& lt;15 分钟) 下效率相对较低, 新合成的蛋白质中加入的放射性起始量不到1%。通过免疫沉淀浓缩目标蛋白后, sds-page 样品中放射性起始量的含量不到0.05%。
虽然35s 蛋氨酸和半胱氨酸标记混合物是稳定的, 一些分解, 产生挥发性放射性化合物, 将发生。为了保护研究人员和仪器, 应采取一些预防措施。研究人员应始终遵守当地的辐射安全规则, 除了实验室外套和 (双手套) 外, 还可以佩戴木炭护理面罩。含有 35s 蛋氨酸和半胱氨酸的股票瓶应始终在烟罩中打开, 或在局部抽吸点下打开。已知的实验室污染点是离心机、移液器、水浴、孵化器和振荡器。通过使用带有木炭过滤器的移液器尖端、正密封微离心管 (见材料表)、水浴中的水族馆木炭海绵、粘在脉冲追逐盘中的木炭滤纸, 减少了对这些地区的污染,在抽吸系统中设置木炭防护装置, 并将含有木炭颗粒的盘子放置在孵化器和储存容器中。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td style="width:301px;">glacial acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28956475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carestream Biomax MR films</td>
			<td style="width:71px;">Kodak</td>
			<td>Z350370-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell-culture media</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:301px;">Normal cell culture media for specific cell-lines used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell-culture media, no methionine/cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;">Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1872047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Charcoal filtered pipette tips</td>
			<td style="width:71px;">Molecular bioproducts</td>
			<td>5069B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal vacu-guard</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>112,553</td>
			<td style="width:301px;">for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEG772014MC</td>
			<td style="width:301px;">Other size batches of label are available depending on useage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel-drying equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grade 3 chromatography paper</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">3003-917</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>24020117</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes delicate task wipes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>MX0490&#160;</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methionine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>M5308</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minigel casting/running equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5368</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protein-A Sepharose fastflow beads</td>
			<td style="width:71px;">GE health-care</td>
			<td style="width:119px;">17-5280-04</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base (Tris)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon IP Biomolecular imager</td>
			<td style="width:71px;">Amersham</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Nalgene</td>
			<td>5970-0320PK</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase

放射性脉冲追逐标记是研究活细胞中目标蛋白的构象成熟、向其功能细胞定位的迁移以及目标蛋白降解的有力工具。通过使用短 (脉冲) 无线电标记时间 (lt;30 分钟) 和严格控制的追逐时间, 可以只标记总蛋白质池的一小部分, 并跟随其折叠。当与非还原性 sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 和免疫沉淀与 (符合特异性) 抗体结合, 可以非常详细地检查折叠过程。该系统已被用来分析蛋白质的折叠, 其特性有巨大的差异, 如可溶性蛋白质、单通和多通道跨膜蛋白、重 n 和 o-糖基化蛋白以及具有和不具有广泛二硫醚的蛋白质粘 接。脉冲追逐方法是一系列附加特征的动力学研究的基础, 包括共和后修饰、寡聚和聚合, 基本上允许分析从出生到死亡的蛋白质。通过提供更多的时间分辨率和生理信息, 对蛋白质折叠的脉冲追逐研究与其他生物生化和生物物理方法是相辅相成的。本文中描述的方法很容易适应于研究几乎任何蛋白质的折叠, 可以在哺乳动物或昆虫细胞系统中表达。

从粘连脉追逐中折叠和分泌 hiv-1 gp120 如图 2所示。非还原凝胶 (图中的细胞 nr) 显示了 gp120 的氧化折叠。在 5分钟 (0分钟追逐) gp120 的脉冲标记后, 立即显示为凝胶中更高的漫反射带, 随着追逐的进展, 带通过更分散的折叠中间体 (it) 向下迁移凝胶, 直到它在紧的带 (nt) 中积累表示本地折叠的 gp120。这发生的原因是二硫键的形成增加了蛋白质的致密性, 使...

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Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

放射性脉冲追逐对活细胞蛋白质折叠、迁移和降解的分析

在这里, 我们描述了一种一般脉冲追逐方法的协议, 该方法允许在活细胞中对蛋白质的折叠、迁移和降解进行动力学分析。

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

使用35S标记的异氨酸和半胱氨酸的放射性脉冲追逐仍然是研究活细胞中蛋白质生物合成的唯一生化方法。蛋白质生物合成包括翻译、折叠和组装以及贩运和降解。将放射性脉冲追逐与翻译后蛋白质修饰分析相结合，如二硫化键的形成和乙酰化，为研究蛋白质的用信念提供了一种敏感而定量的检测方法。此过程需要良好的焦点和实验处理。良好的准备至关重要，如缓冲器、放射性工作空间和明确的时间表。本视频清晰地查看了放射性脉冲追逐协议。演示该程序的将是来自我们实验室的pHd候选人杨慧英。要开始此过程，种子转染和培养细胞如文本协议中所述。在脉搏追逐之前，通过显微镜检查您的细胞。接下来，用两毫升的洗涤缓冲液洗碗。和两毫升的饥饿中培养的细胞，并放置在一个加湿的孵化器在37摄氏度与5%的二氧化碳15分钟。确保脉冲追逐设置有序。将盘子转移到水浴的架子上，预热至 37 摄氏度。确保盘子与水接触，但请勿漂浮。然后，启动一个计时器。在40秒，吸饥饿介质。使用微移液器，绘制600微升脉冲溶液。在一分钟内，轻轻地将脉冲溶液添加到菜的中心。重复此过程，以一分钟间隔删除饥饿介质并添加剩余菜盘的脉冲溶液。在正好11分钟和所有以下菜肴，根据脉搏追逐方案，除了零分钟追逐样品，添加两毫升的追逐介质直接到菜。吸进追逐介质，代之以两毫升的新鲜追逐介质。每隔一分钟对所有剩余菜肴重复此过程。当计时器读取正好 16 分钟时，将两个追逐介质直接添加到脉冲介质顶部的零分钟追逐盘上，以停止标记。立即吸气介质。将盘子转移到冷却的铝板中，并加入两个冷止缓冲器。将所有其他菜肴转移到摄氏37度的孵化器。在每个追逐时间结束前两分钟，将每个追逐盘从孵化器转移到水浴。在每道菜的准确追逐时间，吸进追逐介质，将菜转移到冷却的铝板中。添加两毫升的冰冷停止缓冲液。将所有盘子放在冰上，停止缓冲，直到有时间将细胞融化。然后吸走止损溶液并洗洗所有盘子。三同时用两毫升的冰冷停止溶液。完全吸制止损液，一次向两个盘子中加入 600 微升的解液缓冲液。使用细胞刮刀，彻底刮擦盘子的表面，但轻轻地混合了落酸。将每道菜的利沙酸盐转移到新鲜 1.5 毫升微离心管中。在摄氏4度下在15，000至20，000G下离心10分钟，以对核进行分粒。对于悬浮细胞的脉冲追逐收集500万细胞每个时间点在一个50毫升管。执行文本中描述的饥饿过程。在水浴中进行饥饿程序 15 分钟后，启动计时器。在一分钟内，将275个未稀释标签的微库直接添加到含有细胞的管子中，并旋转混合。在正好 11 分钟，添加四毫升的追逐介质，以停止标签。并立即将一毫升转移到冰面上含有 9 毫升冰冷停止溶液的 15 毫升管中，以停止贴标签。重复这个过程，将一毫升的追逐转移到冰上的管子上，每个连续的追逐时间点都含有九毫升的停止溶液。免疫沉淀后，吸气完全洗涤。将珠子重新悬浮在 TE 缓冲液和涡流中的 20 微升中。添加两个 X 样品缓冲液的 20 微升，无需还原剂。漩涡样品，然后在95摄氏度加热5分钟。再次旋转样品。在室温下以12，000倍G离心1分钟。将 19 微升非减量上流液转移到含有 500 毫摩尔滴滴涕微升的新鲜微离心管中。如果需要，请快速离心样品，使所有液体都位于底部。在95摄氏度下加热5分钟。让减少的样品冷却，然后涡流。在室温下将减少的样品和非减少的样品在12，000倍G下离心一分钟，然后在所有样品中加入1.1微升的一摩尔NEM。本研究中，采用放射性脉冲追逐法分析完整细胞中的蛋白质折叠和传输。此处显示了 HIV 的折叠和分泌一个 GP120 来自粘附脉冲追逐。非还原凝胶显示GP120的氧化折叠。紧接着脉冲标记，它显示为一个漫射带在凝胶中更高。随着追逐的进展，带通过更漫反射的折叠中间体向下迁移凝胶，直到它积聚在代表GP120本机折叠的紧密带中。当二硫化键的形成增加蛋白质的紧凑性，导致其迁移速度比完全减少的蛋白质快时，就发生了这种情况。在还原凝胶上，二硫化物键和所有分子都减少了，并且不影响生物。因此，移动性的差异只是分子质量变化的结果。随着时间的推移，从减少的信号肽未洁形式到减少的信号肽切裂形式的变化代表了GP120的翻译后信号肽裂解。由于信号肽的丢失，随着更多蛋白质达到原生褶皱并失去信号肽，信号肽的丧失，流动性增加。在非还原凝胶和还原凝胶上，由于 GP120 的分泌，信号从大约一小时后开始下降。这可以通过分析媒体来监视。该方法适用于任何细胞系，包括器官细胞模型。但成功在很大程度上取决于感兴趣的蛋白质的表达水平。在开始此过程之前，请标记您的菜肴，并在整个实验中保持此顺序。在添加饥饿介质之前，请确保一切已准备就绪。这是实验的开始。你的实验室时间是你的朋友，但是当你没有准备好的时候，你可能是最大的敌人。比尔的追逐可以与有限的蛋白质解相结合，以随着时间的推移调查蛋白质的全部遗产。此外，不同的选择冰柜方法将允许分析冲洗或严格化或充电差异。为了保护研究人员和设备，必须遵守所有局部辐射安全规则。应根据协议采取保护措施。请注意，用于 STH 页面的丙烯酰胺是神经毒性。

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Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

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