Name: analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Forfatterne takke alle medlemmerne af Braakman lab, forbi og præsentere, for deres udbytterige drøftelser og hjælpe med at udvikle de metoder, der er præsenteret i denne artikel. Dette projekt har modtaget støtte fra både det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) N ° 235649 og Holland organisation for videnskabelig forskning (NWO) under ECHO-programmet N ° 711.012.008.

Alle radioaktive reagenser og procedurer blev håndteret i overensstemmelse med lokale Utrecht Universitet stråling regler og forordninger.
1. puls Chase
<ol><li>
Puls Chase for vedhængende celler Bemærk: De mængder, der er givet her er baseret på 60 mm celle kultur retter. For 35 mm og 100 mm retter, multiplicere mængderne med 1/2 eller 2, henholdsvis. Denne protokol bruger en puls tid på 10 min og chase gange 0, 15, 30, 60, 120 og 240 min. Disse kan differentiere...

<ol>
	<li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER.">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li><li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+Questions+(with+their+Answers)+on+ER-Associated+Degradation.">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li><li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System:+The+Calnexin+Binding+Cycle.">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide.">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067 (2017).</li><li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li><li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein.">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li><li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum.">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function.">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).</li><li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro.">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li><li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis.">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li><li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin.">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li><li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Hsp47,+Grp78,+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones.">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li><li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain.">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e.">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li><li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport.">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li></ol>

Puls-chase metoder har været af afgørende betydning for udviklingen af forskernes forståelse af proteinfoldning i intakt celler. Mens vi har forsøgt at tilvejebringe en metode, der er så generel som muligt, har denne tilgang potentialet for næsten ubegrænsede variationer at studere forskellige processer, der opstår under folde, transport og liv af proteiner inde i cellen.
Når du udfører en puls chase med vedhængende celler i retter, er det vigtigt at behandle hvert fad, det samme s?...

Foldning af selv relativt simple proteiner involverer mange forskellige folde enzymer, molekylære chaperoner og kovalente ændringer1. En komplet rekonstituering af disse processer in vitro- er praktisk talt umuligt, da det store antal forskellige involverede komponenter. Det er derfor ønskeligt, at studere proteinfoldning i vivo, i levende celler. Radioaktive pulse-chase teknikker bevise et kraftfuldt værktøj til at studere den syntese, foldning, transport og nedbrydning af proteiner i deres naturlige miljø.
Den metaboliske mærkning af proteiner i løbet af en kort puls med 35S-mærket methionin/cystein, efterfulgt af en jagt i mangel af en radioaktivt mærket, giver mulighed for specifikke tracking af en population af nyligt syntetiserede proteiner i det bredere cellulære miljø. Derefter, target proteiner kan være isolerede via immunoprecipitation og analyseret via SDS-PAGE eller andre teknikker. For mange proteiner, er deres rejse gennem cellen kendetegnet ved ændringer, der er synlige på SDS-PAGE gel. For eksempel, er transport af glykosyleret proteiner fra det endoplasmatiske reticulum (ER) til Golgi kompleks ofte ledsaget af ændringer af N-knyttet glycans eller tilsætning af O-knyttet glycans2,3. Disse ændringer medføre store stigninger i den tilsyneladende molekylemasse, som kan ses af mobilitet ændringer i SDS-PAGE. Modning kan også være præget af proteolytiske splittelser, såsom signal-peptid kavalergang eller fjernelse af pro-peptider, resulterer i ændringer i den tilsyneladende molekylvægt, der let kan følges på SDS-PAGE gel4. Radioaktivitet har betydelige fordele i forhold til sammenlignelige teknikker som cycloheximide jagter, hvor romanen proteinsyntesen er forhindret, som længere behandlinger er giftigt for celler og udelukker ikke et flertal af ældre, steady-state proteiner fra de analyse, som visse proteiner har halveringstider dage. Sammenligning af proteiner under både nonreducing og reducere betingelser giver mulighed for analyse af disulfid obligation dannelse, et vigtigt skridt i foldning af mange sekretoriske proteiner4,5,6, 7.
Her beskriver vi en generel metode til analyse af proteinfoldning og transport i intakt celler, ved hjælp af et radioaktivt pulse-chase tilgang. Mens vi har til formål at give metoden som detaljeret som muligt, protokollen har en næsten ubegrænsede muligheder for tilpasningsevne og vil tillade optimering at studere hver læser specifikke proteiner.
To alternative pulse-chase protokoller, en for vedhængende celler (trin 1.1 protokollens præsenteres her) og en for suspension celler (trin 1.2 i protokollen præsenteres her) er forudsat. Betingelserne her er tilstrækkeligt til at visualisere en protein udtrykt med medium til høj udtryk niveauer. Hvis læseren arbejder med dårligt udtrykte proteiner eller forskellige posttreatment forhold, som flere immunoprecipitations, er det nødvendigt at øge parabol størrelse eller celle nummer korrekt.
For suspension puls chase, er chase prøver på hvert tidspunkt alle taget fra et enkelt rør af celler. Vask trin efter pulsen er udeladt; i stedet, yderligere indarbejdelse af 35S er forhindret ved fortynding med en høj overskud af umærket methionin og cystein.
De præsenterede protokoller bruger radioaktive 35S-mærket cystein og methionin for at følge cellulære proteinfoldning processer. Alle operationer med radioaktivt reagenser skal udføres ved hjælp af passende beskyttelsesforanstaltninger for at minimere eksponering af operatøren og miljø for radioaktiv stråling og udføres i et laboratorium, der er udpeget. Som puls-chase mærkning teknik er relativt ineffektive på kort puls gange (< 15 min), mindre end 1% af grundbeløbet for radioaktivitet er indarbejdet i de nyligt syntetiserede proteiner. Efter tilsætning af target protein via immunoprecipitation indeholder prøven for SDS-PAGE mindre end 0,05% af grundbeløbet for radioaktivitet.
Selvom 35S methionin og cystein mærkning mix er stabiliseret, vil nogle nedbrydning, fremstilling af flygtige radioaktive stoffer, opstå. For at beskytte forskeren og apparatet, bør der tages nogle forholdsregler. Forskeren bør altid adlyde de lokale stråling sikkerhedsregler og kan bære en trækul sygepleje maske, udover en lab coat og (dobbelt) handsker. Stock hætteglas med 35S methionin og cystein bør altid åbnes i et stinkskab eller under en lokal aspiration punkt. Kendt laboratorium forurening steder er centrifuger, pipetter, vandbade, væksthuse og shakers. Forureningen af disse områder er reduceret ved hjælp af pipette tips med en trækul filter, positive-seal microcentrifuge rør (Se Tabel af materialer), akvarium charcoal svampe i vand bade, trækul papirfiltre limet i puls-chase retter, trækul vagt i aspiration systemet, og placeringen af skåle, som indeholder trækul korn i væksthuse og opbevaringsbeholdere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706.400</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td style="width:301px;">glacial acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BAS Storage phosphor screen 20x25 cm</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28956475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carestream Biomax MR films</td>
			<td style="width:71px;">Kodak</td>
			<td>Z350370-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell-culture media</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:301px;">Normal cell culture media for specific cell-lines used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell-culture media, no methionine/cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;">Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1872047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Charcoal filtered pipette tips</td>
			<td style="width:71px;">Molecular bioproducts</td>
			<td>5069B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Charcoal vacu-guard</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>112,553</td>
			<td style="width:301px;">for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express35S Protein Labeling Mix</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEG772014MC</td>
			<td style="width:301px;">Other size batches of label are available depending on useage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E1644</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel-drying equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grade 3 chromatography paper</td>
			<td style="width:71px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">3003-917</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>24020117</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes delicate task wipes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M3671</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>MX0490&#160;</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methionine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>M5308</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minigel casting/running equipment</td>
			<td style="width:71px;">Various</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>E3876</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5368</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protein-A Sepharose fastflow beads</td>
			<td style="width:71px;">GE health-care</td>
			<td style="width:119px;">17-5280-04</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base (Tris)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:301px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon IP Biomolecular imager</td>
			<td style="width:71px;">Amersham</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Nalgene</td>
			<td>5970-0320PK</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of protein folding, transport, and degradation in living cells by radioactive pulse chase

Radioaktive pulse-chase mærkning er et kraftfuldt værktøj til at studere en konformationel modning, transport til deres funktionelle cellular placering, og nedbrydningen af mål proteiner i levende celler. Ved hjælp af kort (puls) radiolabeling gange (< 30 min) og stramt kontrolleret chase gange, det er muligt at mærke kun en lille brøkdel af det samlede proteinindhold pool og følge dens foldning. Når det kombineres med nonreducing/reducere SDS-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og immunoprecipitation med (kropsbygning-specifikke) antistoffer, kan folde processer blive undersøgt i stor detalje. Dette system er blevet brugt til at analysere folde proteiner med en enorm variation i egenskaber som opløselige proteiner, enkelt og multi-pass transmembrane proteiner, stærkt N og O glykosyleret proteiner, og proteiner med og uden omfattende disulfid limning. Puls-chase metoder er grundlaget for kinetiske undersøgelser i en række ekstra funktioner, herunder co og posttranslationelle modifikationer, oligomerisering og polymerisation, hovedsagelig giver mulighed for analyse af et protein fra fødsel til død. Puls-chase undersøgelser på proteinfoldning supplerer med andre biokemiske og biofysiske metoder til at studere proteiner i vitro ved at give øget tidsmæssige opløsning og fysiologiske oplysninger. Metoder som beskrevet i denne hvidbog er let tilpasses studere foldning af næsten enhver protein, der kan udtrykkes i pattedyr eller insekt-celle systemer.

Foldning og sekretion af HIV-1 gp120 fra en vedhængende puls chase er vist i figur 2. Den nonreducing gel (celler NR i figur) viser, at oxidativ foldning af gp120. Umiddelbart efter pulsen mærkning af 5 min (0 min chase) gp120 vises som en diffus band højere i gelen, og som skrider frem chase bandet vandrer ned gel gennem endnu mere diffust folde mellemprodukter (IT), indtil det ophobes i den stramme band (NT) der repræsenterer indbygget foldede gp120. De...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase at JoVE.com

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Her beskriver vi en protokol for en generel pulse-chase metode, der tillader kinetic analyse af folde-, transport- og nedbrydning af proteiner skal følges i levende celler.

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Den radioaktive puls jagt ved hjælp af 35 S-mærket methionin og cystein er stadig den eneste biokemiske metoder til at undersøge protein biosyntese med tiden i levende celler. Proteinbiosyntese dækker både oversættelse, foldning og samling og handel og nedbrydning. Ved at kombinere den radioaktive pulsjagt med analyse af proteinændringer efter oversættelsen, såsom disulfidbindingsdannelse og acetylation, får den en følsom og kvantitativ analyse til at undersøge proteinets tro med tiden.Der er behov for godt fokus og eksperimentel håndtering til denne procedure. God forberedelse er afgørende, ligesom buffere, din radioaktive arbejdsområde, og en klar tidsplan. Denne video giver en klar over skulderen opfattelse af den radioaktive puls chase protokol.Demonstration af proceduren vil være Hui Ying Yeoh, en pHd kandidat fra vores laboratorium. For at starte denne procedure, frø transfect og kulturceller som skitseret i tekstprotokollen. Før pulsjagten skal du inspicere dine celler gennem mikroskopet.Dernæst vaskes op med to milliliter vaskebuffer. Og to milliliter sult medium til cellerne og placere retterne i en befugtet inkubator på 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 15 minutter. Sørg for, at din puls jagt oprettet er i orden.Overfør retterne til stativerne i vandbadet, forvarmet til 37 grader Celsius. Sørg for, at retterne er i kontakt med vand, men ikke flyder. Start derefter en timer.Ved 40 sekunder, aspirere sult medium. Ved hjælp af en mikrorør, udarbejde 600 mikroliter puls løsning. På præcis et minut, forsigtigt tilføje puls opløsning til midten af skålen.Gentag denne proces med at fjerne sultemediet og tilføje pulsopløsningen til de resterende retter med et minuts mellemrum. På præcis 11 minutter og for alle følgende retter, i henhold til puls chase ordningen, bortset fra nul minutter chase prøve, tilføje to milliliter chase medium direkte til fadet. Aspirate chase medium og erstatte det med to milliliter frisk chase medium.Gentag denne proces for alle resterende retter med et minuts mellemrum. Når timeren læser præcis 16 minutter, tilføje to militers af chase medium direkte til nul minut chase parabol, på toppen af pulsen medium, for at stoppe mærkning. Straks aspirere mediet.Overfør skålen til en afkølet aluminiumsplade og tilsæt to militers af iskold stop buffer. Overfør alle andre retter til en kuvøse ved 37 grader Celsius. Overfør hver chase parabol tilbage fra inkubatoren til vandbadet to minutter før udgangen af hver chase tid.På den nøjagtige chase tid for hver skål, aspirere chase medium og overføre skålen til en afkølet aluminiumsplade. Tilføj to milliliter iskold stop buffer. Lad alle retter på is og stop buffer, indtil der er tid til at lyse cellerne.Derefter aspirere stopopløsningen og vask alle opvaske. Tre på samme tid med to milliliter iskold stop opløsning. Aspirere stopopløsningen helt og tilsæt 600 mikroliter lysis buffer til to retter ad gangen.Brug en celle skraber, skrabe overfladen af skålen grundigt, men forsigtigt at blande lysatet. Lysat fra hver skål overføres til et friskt mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter. Centrifuge ved 15,000 til 20, 000 G ved fire grader Celsius i 10 minutter for at pellet kernen.For pulsjagt på suspension celler indsamling fem millioner celler per tid punkt i en 50 milliliter rør. Udfør sultproceduren som beskrevet i teksten. Efter sult procedure i vandbad i 15 minutter, start timeren.På præcis et minut, tilsæt 275 microcuries af ufortyndet etiket direkte til røret, der indeholder celler og hvirvle til at blande. På præcis 11 minutter, tilføje fire milliliter chase medier til at stoppe mærkningen. Og straks overføre en milliliter til en 15 milliliter rør på is, der indeholder ni milliliter iskold stop opløsning til at stoppe mærkning.Gentag denne proces med at overføre en milliliter jagt til et rør på is, der indeholder ni milliliter stopopløsning for hvert efterfølgende jagttidspunkt. Efter immunoprecipitationen aspireres den sidste vask fuldstændigt. Re-suspendere perlerne i 20 mikroliter af TE buffer og vortex.Der tilsættes 20 mikroliter af to X-prøvebuffer uden reduktionsmidlet. Vortex prøverne og derefter varme dem ved 95 grader Celsius i fem minutter. Vortex prøverne igen.Centrifuge ved 12,000 gange G ved stuetemperatur i et minut. Overfør 19 mikroliter af den ikke-reducerede supernatant til et frisk mikrocentrifugerør, der indeholder et mikroliter på 500 millimolar DDT. Hvis det er nødvendigt, centrifuge prøven hurtigt, så alle væsker er i bunden.Og varme ved 95 grader Celsius i fem minutter. Lad den reducerede prøve køle ned og derefter vortex. Centrifuge både de reducerede og ikke-reducerede prøver ved 12.000 gange G ved stuetemperatur i et minut, og tilsæt derefter 1,1 mikroliter af en molar NEM til alle prøverne.I denne undersøgelse, en radioaktiv puls chase tilgang bruges til at analysere protein foldning og transport i intakte celler. Foldning og sekretion af HIV en GP120 fra en tilhænger puls chase er vist her. Den ikke-reducerende gel viser den oxidative foldning af GP120.Umiddelbart efter pulsmærkningen fremstår den som et diffust bånd højere i gelen. Som jagten skrider frem, bandet migrerer ned gelen gennem endnu mere diffus folde mellemprodukter, indtil det akkumuleres i den stramme bånd, der repræsenterer indbygget foldet på GP120. Dette sker som dannelsen af disulfid obligationer øger kompakthed af proteinet, får det til at migrere hurtigere end den fuldt reducerede protein.På den reducerende gel er disulfidbindingerne og alle molekyler blevet reduceret og påvirker ikke mobiilty. Som sådan er forskelle i mobilitet kun et resultat af ændringer i molekylmassen. Skiftet over tid fra det reducerede signal peptid uncleaved form til den reducerede signal peptid kløvet form repræsenterer post-translationel signal peptid spaltning af GP120.Mobiliteten stiger på grund af tabet af signal peptid, som stiger under jagten som flere proteiner nå den indfødte fold og mister deres signal peptid. På både den ikke-reducerende og reducerende gel begynder signalet at falde fra ca. en time og frem på grund af udskillelsen af GP120. Dette kan overvåges ved at analysere medierne.Denne metode gælder for alle cellelinje, herunder organoidcellemodeller. Men succesen afhænger i høj grad af interesseproteinets udtryksniveau. Før du begynder denne procedure, markere dine retter og holde denne ordre i hele eksperimentet.Sørg for, at alt er forberedt, før du tilføjer sult medium. Dette er starten på eksperimentet. Og din laboratorietid er din ven, men kan være din største fjende, når du ikke er forberedt.Bill's jagt kan kombineres med begrænset proteolyse til at undersøge den fulde ejendom af proteiner med tiden. Også forskellige valgte frysere metoder vil gøre det muligt analyse af skylning eller stringens eller afgift forskelle. For at beskytte forskeren og apparatet skal alle lokale strålingssikkerhedsregler overholdes.Og beskyttelsesforanstaltninger bør træffes i henhold til protokollen. Bemærk, at din acrylamid, der anvendes til din STH side er neurotoksisk.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisning af Heterodimerization af Protein isoformer ved hjælp af en in Situ nærhed ligatur Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af blå indfødte gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse af Endocytic optagelse og retrograd Transport til Trans-Golgi netværket ved hjælp af Functionalized Nanobodies i kulturperler celler

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Brug af open source-MALDI TOF-MS IDBac-rørledningen til analyse af mikrobiel protein og specialiserede metabolit data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...